Trapianto trans-sclerale transpupillare guidato di innesti sottoretinici in un modello murino di degenerazione retinica

Riepilogo

Questo protocollo presenta un approccio trans-sclerale guidato dalla visione transpupillare per fornire in modo sicuro e preciso innesti cellulari sottoretinici, con un basso tasso di complicanze chirurgiche, in riceventi murini con o senza degenerazione retinica.

Abstract

Il trapianto di cellule fotorecettrici e cellule epiteliali pigmentate retiniche (RPE) fornisce una potenziale terapia per le malattie da degenerazione retinica. Il trapianto sottoretinico di cellule terapeutiche del donatore in riceventi di topo è impegnativo a causa dello spazio chirurgico limitato consentito dal piccolo volume dell'occhio del topo. Abbiamo sviluppato una piattaforma di trapianto chirurgico trans-sclerale con guida diretta alla visione transpupillare per facilitare la somministrazione sottoretinica di cellule esogene nei riceventi murini. La piattaforma è stata testata utilizzando sospensioni di cellule retiniche e fogli retinici tridimensionali raccolti da topi Rho::EGFP ricchi di bastoncelli e OPN1LW-EGFP ricchi di coni; NRL^-/- topi, rispettivamente. Il test vivo/morto ha mostrato una bassa mortalità cellulare per entrambe le forme di cellule donatrici. Gli innesti di retina sono stati somministrati con successo nello spazio sottoretinico di un modello murino di degenerazione retinica, Rd1/NS, con complicanze chirurgiche minime, come rilevato dall'oftalmoscopio laser a scansione confocale multimodale (cSLO). Due mesi dopo il trapianto, la colorazione istologica ha dimostrato l'evidenza di una maturazione avanzata degli innesti retinici in coni e bastoncelli "adulti" (mediante robusta espressione di Rho::EGFP, S-opsina e OPN1LW:EGFP, rispettivamente) nello spazio sottoretinico. Qui, forniamo una piattaforma chirurgica in grado di consentire una somministrazione sottoretinica altamente accurata con un basso tasso di complicanze nei riceventi di topo. Questa tecnica offre precisione e relativa facilità di acquisizione delle abilità. Inoltre, la tecnica potrebbe essere utilizzata non solo per studi sul trapianto di cellule sottoretiniche, ma anche per altri studi terapeutici intraoculari, comprese le terapie geniche.

Introduzione

Il trapianto di cellule epiteliali pigmentate retiniche (RPE) e fotorecettrici fornisce una potenziale terapia per le malattie degenerative della retina come la degenerazione maculare legata all'età (AMD), la malattia di Stargardt e la retinite pigmentosa (RP)1,2,3,4,5,6,7 . Per ricostituire o sostituire i fotorecettori malati e le cellule RPE nelle retine degenerate, lo spazio sottoretinico è particolarmente adatto come bersaglio di trapianto data l'anatomia laminare dei fotorecettori ospiti e delle cellule RPE. Mentre le procedure chirurgiche di trapianto sottoretinico di cellule RPE sono ben consolidate nei grandi animali 8,9,10 e negli studi clinici^11,12,13, le sfide che la ricerca sul trapianto di fotorecettori deve affrontare includono la scarsità di modelli animali transgenici di grandi dimensioni e la limitata comprensione dei meccanismi di sinaptogenesi approfonditi coinvolti nel trapianto neuronale^, tra le altre preoccupazioni. Modelli murini geneticamente modificati, con vari tipi di mutanti di degenerazione retinica, forniscono strumenti utili per studiare i meccanismi molecolari nel contesto del trapianto e guidare lo sviluppo di efficaci terapie di sostituzione cellulare allo stadio preclinico 14,15,16,17,18.

A differenza dell'occhio relativamente grande e del piccolo cristallino negli animali di grandi dimensioni (ad esempio, maiale, scimmia), le piccole dimensioni e la grande lente cristallina degli occhi di topo li rendono bersagli chirurgici difficili, specialmente per il trapianto sottoretinico in cui i vincoli di spazio fisico e la visualizzazione diretta limitata sono le sfide principali.

Gli approcci attuali possono essere classificati in tre tipi principali in base alla via di iniezione. In primo luogo, nel caso dell'approccio transcorneale, l'ago viene fatto passare attraverso la cornea nella cavità vitreale e poi nello spazio sottoretinico^19,20. Il successo della somministrazione sottoretinica può essere ottenuto utilizzando questo metodo, ma il danno alle strutture del segmento anteriore (ad es. cornea, iride, cristallino) è un rischio importante che può ostacolare gravemente l'analisi in vivo a valle. In secondo luogo, nel caso dell'approccio transvitreo, l'ago entra nella cavità vitreale attraverso la pars plana e quindi nello spazio sottoretinico²¹. Questo approccio è ampiamente utilizzato negli esseri umani e nei grandi animali. Tuttavia, esiste un potenziale rischio di danni al cristallino nei roditori poiché il cristallino occupa un volume relativo maggiore della cavità vitreale. In particolare, entrambi i protocolli trans-corneali e trans-vitrei richiedono la penetrazione della retina neurale per arrivare allo spazio sottoretinico, che provoca danni alla retina dell'ospite e aumenta il rischio di reflusso delle cellule del donatore attraverso il foro di penetrazione. In terzo luogo, nel caso dell'approccio trans-sclerale^22,23, l'ago penetra attraverso il complesso scleral-coroide-RPE ed entra direttamente nello spazio sottoretinico. Questo approccio riduce il potenziale trauma delle strutture del segmento anteriore e della cavità vitreale. Tuttavia, senza la visualizzazione diretta del fondo oculare ospite, vengono comunemente rilevati fallimenti chirurgici causati da punture transretiniche, distacco di RPE ed emorragia coroidea.

Qui, abbiamo sviluppato una piattaforma chirurgica trans-sclerale con guida diretta alla visione transpupillare per il trapianto sottoretinico in riceventi di topo. Validazione della vitalità dei foglietti retinici del donatore e delle sospensioni cellulari prima dell'esecuzione del trapianto. È stato confermato il successo della consegna delle cellule del donatore nello spazio sottoretinico di un modello murino di degenerazione della retina. Sono state rilevate solo rare complicanze chirurgiche. Inoltre, i fotorecettori trapiantati negli innesti retinici sono sopravvissuti e hanno mostrato prove di maturazione avanzata in coni e bastoncelli "adulti" due mesi dopo il trapianto.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con la National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publications No. 8023, rivista nel 1978) e con l'ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali della Johns Hopkins University (approvazione M021M459).

1. Animali

1. Utilizzare topi Rho::EGFP (di età P3-P6) come donatori di sospensioni di cellule retiniche.
   NOTA: Questa varietà è stata un gentile regalo del Dr. T. Wensel, del Baylor College of Medicine.
2. Utilizzare topi OPN1LW-EGFP/NRL-^{/- 14} (P3 di età) come donatori di foglietti retinici.
3. Utilizzare topi adulti con degenerazione retinica Rd1/NS con immunodeficienza (entrambi i sessi) come riceventi.
4. Alloggiare tutti i topi in gabbie con un ciclo luce-buio di 12:12 ore con accesso all'acqua e al cibo secondo necessità.

2. Raccogliere la retina neurale (Figura 1)

NOTA: Tutti i seguenti passaggi sono stati eseguiti in condizioni sterili. Le informazioni sui fornitori degli strumenti e dei prodotti di ricerca sono fornite nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione dei topi donatori: Eutanasiare i topi donatori con un sovradosaggio di anidride carbonica e confermare l'eutanasia con lussazione cervicale.
2. Isolare i bulbi oculari dei topi. Per fare ciò, segui i passaggi seguenti.
   1. Apri con cautela le palpebre dei cuccioli usando delle microforbici per esporre il bulbo oculare.
   2. Usa una pinza liscia per afferrare il nervo ottico ed estrarre il bulbo oculare con un paio di pinze.
3. Isolare la retina neurale
   NOTA: Questa fase viene eseguita al microscopio da dissezione.
   1. Incidere un foro al centro della cornea con un ago sterile da 25 G.
   2. Tagliare la cornea, attraverso il foro, a metà e allargare l'incisione alla sclera e all'RPE, quindi rimuovere la sclera e l'RPE.
   3. Utilizzare una pinza microdentata per rimuovere delicatamente il cristallino e il vitreo per isolare la retina neurale.
   4. Procedere con la sezione 3 per preparare la sospensione retinica del donatore o con la sezione 4 per preparare il foglio retinico del donatore, come richiesto.

3. Preparare la sospensione retinica del donatore (Figura 1)

1. Incubare la retina neurale in soluzione di papaina a 37 °C per 20-30 minuti fino a quando non vengono rilevati grumi cellulari.
   NOTA: Pipettare delicatamente la miscela cellulare 15 volte ogni 10 min.
2. Seguire le istruzioni del produttore del kit di dissociazione della papaina per raccogliere le singole cellule.

4. Preparare i fogli retinici del donatore (Figura 1)

NOTA: Questo passaggio segue la sezione 2 e viene eseguito al microscopio di dissezione.

1. Mettere la coppetta di retina neurale isolata in una capsula di Petri da 35 mm con PBS sterile preraffreddato.
2. Usa le microforbici per tagliare la coppa della retina neurale in più fogli retinici (circa 1 mm x 2 mm).

5. Preparare i topi riceventi

1. Anestetizzare topi riceventi con iniezione intraperitoneale di ketamina (100 mg/kg di peso corporeo) e xilazina cloridrato (20 mg/kg di peso corporeo).
2. Confermare il piano chirurgico dell'anestesia assicurando la perdita dei riflessi di battito delle palpebre e del dolore, la respirazione regolare e la respirazione.
3. Valutare la profondità dell'anestetico in base alla mancanza di risposta al pizzicamento della coda o al ritiro dei riflessi del pedale.
4. Ricontrollare sempre la profondità dell'anestetico durante la procedura operatoria e regolare la profondità dell'anestetico se l'animale risponde al dolore. Tenere i topi sul tavolo operatorio preriscaldato per prevenire l'ipotermia.
5. Dilatare le pupille riceventi con un collirio all'1% (wt/vol) di tropicamide 5 minuti prima dell'intervento. Una pupilla ben dilatata può facilitare la visualizzazione transpupillare al microscopio operatorio.
6. Disinfettare l'occhio del topo operatorio e i tessuti oculari circostanti con iodio povidone, lavare con PBS sterilizzato.
7. Applichi il cloridrato di proparacaina di 0,5% sull'occhio del topo per l'analgesia.

6. Trapianto sottoretinico di innesti retinici (Figura 2)

NOTA: Tutti i seguenti passaggi sono stati eseguiti in condizioni asettiche. Gli strumenti chirurgici sono stati sterilizzati in autoclave (utilizzare vassoi per strumenti per proteggere le punte degli strumenti e rimuovere lo stantuffo dalle microsiringhe per evitare che rimangano incastrati nel lume). Le informazioni sui fornitori degli strumenti e dei prodotti di ricerca sono fornite nella Tabella dei materiali.

1. Paracentesi della camera anteriore: penetrare la cornea periferica nella camera anteriore con un ago da insulina per consentire all'umore acqueo di uscire passivamente, per prevenire i picchi di pressione intraoculare (IOP) durante il trapianto.
   NOTA: Una paracentesi di successo è indicata dall'efflusso di umore acqueo attraverso il foro corneale.
2. Applicare una goccia di ialuronato di sodio e un vetrino coprioggetti (5 mm di diametro) sulla parte superiore della cornea per consentire la visualizzazione transpupillare del fondo oculare sotto l'endoscopio chirurgico.
3. Utilizzare una pinza dentata per esporre il locus di iniezione (limbus post-corneale di 1 mm) premendo la parete superiore o inferiore dell'occhio, come richiesto dall'esperimento, verso il centro della visione transpupillare.
4. Utilizzare un ago per microiniezione per penetrare perpendicolarmente nella sclera.
5. Ruotare con cautela la direzione dell'ago tangenzialmente per consentire la completa penetrazione del complesso sclera-coroide-RPE nello spazio sottoretinico.
6. Inserire l'ago tangenzialmente per accedere al luogo di iniezione terminale.
   NOTA: Verificare il posizionamento completo dello smusso dell'ago con la guida della visione transpupillare. Utilizzare i vasi retinici superficiali come riferimento anatomico per un posizionamento accurato dell'ago all'interno dello spazio sottoretinico.
7. Iniettare innesti retinici
   NOTA: La presenza di piccole bolle precaricate nella siringa può facilitare la convalida dell'accurato posizionamento sottoretinico delle cellule del donatore. L'elevata IOP derivante dall'iniezione sottoretinica aumenta il rischio di reflusso delle cellule donatrici.
   1. Se la cornea diventa torbida^24,25, un indicatore di IOP elevata, tenere l'ago nello spazio sottoretinico per almeno 3 minuti fino a quando la cornea non si schiarisce^, un indicatore che la IOP si è ridotta a sufficienza.
      NOTA: In rari casi, la IOP può richiedere più tempo per normalizzarsi e si consiglia di mantenere l'ago in posizione fino al ripristino della chiarezza della cornea, anche se ciò richiederebbe 8-10 minuti. Osservare al microscopio operatorio per prevenire danni alle strutture retiniche.
8. Afferrare il bordo del foro di iniezione con una pinza microdentata ed estrarre rapidamente l'ago.
   NOTA: I criteri per il successo della somministrazione sottoretinica di una sospensione e di un foglio di cellule retiniche sono rispettivamente un bleb costante e un foglio bianco visibile nello spazio sottoretinico.
9. Pulire l'area chirurgica dell'occhio con lacrime artificiali e applicare un unguento se necessario.
10. Somministrazione post-operatoria
    1. Collocare i topi trapiantati in una gabbia di recupero pulita preriscaldata (37 °C) e monitorare attentamente l'eventuale sofferenza.
    2. Applichi una goccia di cloridrato topico di proparacaina allo 0,5% sull'occhio chirurgico 2-3 volte se l'angoscia si verifica.
    3. Riporta i topi nella gabbia di casa dopo che i topi sono completamente vigili e mobili. Metti un piccolo numero di pellet di cibo e una tazza di gel nella gabbia se i topi hanno difficoltà a raggiungere la tramoggia del cibo.
       NOTA: Mantenere la superficie oculare umida fino a quando l'anestesia non svanisce per prevenire la formazione di cataratta.

7. Imaging oftalmosico laser a scansione confocale multimodale (cSLO)

1. Due mesi dopo il trapianto, anestetizzare topi riceventi Rd1/NS (n=5) mediante iniezione intraperitoneale di ketamina (100 mg/kg di peso corporeo) e xilazina cloridrato (20 mg/kg di peso corporeo) per l'imaging.
2. Dilatare le pupille con un collirio di tropicamide all'1% (wt/vol).
3. Eseguire l'imaging multimodale standard a 55° utilizzando l'oftalmoscopio laser a scansione confocale cSLO^{system 22}.
4. Ottieni immagini RM e SD-OCT utilizzando 30 fotogrammi di media ART.

8. Colorazione istologica

1. Preparare vetrini congelati di occhi di topi Rd1/NS trapiantati come riportato in precedenza ¹⁴.
2. Bloccare e penetrare i vetrini congelati di retine trapiantate utilizzando una miscela di siero di capra al 5% e Triton X100 all'1% in PBS.
3. Incubare i campioni con anticorpi primari per una notte a 4 °C e risciacquare in PBS (5 min, 3x). Gli anticorpi primari includono l'anti-GFP-FITC di capra (1:200), l'anti-recoverina di coniglio (1:1000) e l'anti-S-opsina di coniglio (1:500).
4. Incubare i campioni con anticorpi secondari (capra anti-coniglio Cy3, 1:500) e controcolorati con DAPI.
   NOTA: I fornitori di anticorpi primari e secondari sono elencati nella Tabella dei materiali.

Risultati

Gli innesti retinici vengono consegnati con successo nello spazio sottoretinico e sono sopravvissuti in vivo.
Le prestazioni della nostra piattaforma di trapianto sottoretinico sono state valutate in topi riceventi Rd1/NS di età compresa tra 6 e 8 settimane, quando le loro retine residue erano gravemente assottigliate a causa della degenerazione quasi completa dello strato nucleare esterno (ONL). Data la fragilità della retina, la scarsità di fotorecettori dei coni e la vitalità relativamente scarsa delle cellule in sospensione rispetto ai donatori di foglietti, i topi ricchi di coni (OPN1LW-EGFP; NRL-^/-)¹⁴ sono stati utilizzati come fonti di fogli retinici donatori e topi ricchi di bastoncelli (Rho::EGFP) come donatori per le sospensioni cellulari. Il foglio retinico ricco di coni e le sospensioni cellulari ricche di bastoncelli sono stati somministrati con successo nello spazio sottoretinico di tutti i topi riceventi utilizzando la nostra piattaforma chirurgica, come confermato dal bleb sottoretinico e dal foglio bianco osservati utilizzando la visualizzazione transpupillare immediatamente dopo l'iniezione. Due mesi dopo il trapianto, è stato eseguito l'imaging multimodale di cSLO per monitorare gli stati degli innesti retinici in vivo. La scansione OCT trasversale ha mostrato che gli innesti retinici sono sopravvissuti nello spazio sottoretinico e hanno ricostituito l'ONL in tutti i topi riceventi (Figura 3A). L'imaging a infrarossi non ha rilevato cataratta evidente in tutti gli occhi trapiantati (Figura 3B). Altre complicanze chirurgiche, tra cui l'emorragia, sono state raramente rilevate nelle retine trapiantate (n = 1/10 degli occhi) mediante imaging in riflettanza multicolore a due mesi dopo il trapianto (Figura 3C). Abbiamo eseguito la colorazione istologica per valutare ulteriormente la sopravvivenza e l'entità della maturazione dei fotorecettori negli innesti di retina. Sono stati osservati abbondanti fotorecettori dei coni che esprimono OPN1LW:EGFP e S-opsina nei fogli retinici trapiantati. Allo stesso modo, le sospensioni di cellule retiniche trapiantate hanno mostrato un'ampia percentuale di fotorecettori Rec+ in vivo, tra cui numerosi bastoncelli Rho::EGFP⁺ (Figura 3D). I topi di controllo non trapiantati hanno mostrato una grave degenerazione di ONL con scarsi fotorecettori dei coni residui (Rec⁺). Nessun segnale EGFP è stato rilevato nella retina Rd1/NS non trapiantata (Figura 3D).

Figura 1: Schema di raccolta del foglio retinico del donatore e delle sospensioni cellulari. Schemi che mostrano i passaggi chiave della raccolta di sospensioni e fogli di cellule retiniche da topi donatori Rho::EGFP . L'imaging in campo chiaro e fluorescente ha mostrato immagini rappresentative di cellule dissociate e un foglio sezionato isolato da topi Rho::EGFP . Linea tratteggiata gialla: margine incisionale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Procedure di trapianto sottoretinico di foglietti retinici e sospensione cellulare in topi Rd1/NS . (A) Immagini schematiche della preparazione dei topi riceventi. (B) Procedure chirurgiche chiave e diagrammi corrispondenti che mostrano il trapianto sottoretinico di sospensioni e foglietti di cellule retiniche. Le fasi chirurgiche includono: 1. penetrare nella camera anteriore; 2. far cadere lo ialuronato di sodio sulla cornea, quindi montare il vetrino coprioggetti sopra lo ialuronato di sodio per facilitare la visualizzazione transpupillare; 3. penetrare negli strati esterni della parete oculare (complesso sclera-coroide-RPE). Gli angoli di penetrazione dell'ago si trovano nel pannello in alto a destra dell'illustrazione; 4. Inserire l'ago per iniezione; 5. Iniettare gli innesti. Le immagini rappresentative mostrano il successo della somministrazione delle sospensioni e del foglio di cellule retiniche in due singoli riceventi, rispettivamente. Asterisco: testa del nervo ottico; Punte di freccia rosse: vaso sanguigno retinico; Punta di freccia bianca: punta dell'ago penetrata; Frecce bianche: sospensioni retiniche innestate o foglio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Consegna riuscita di innesti retinici nello spazio sottoretinico e sopravvivenza in vivo. (A) Immagini SD-OCT rappresentative hanno mostrato la distribuzione sottoretinica dei foglietti retinici trapiantati e delle sospensioni cellulari rispettivamente in due singoli topi Rd1/NS . I topi Rd1/NS non trapiantati sono stati raccolti come controllo. La regione di interesse (ROI) è indicata da caselle tratteggiate in giallo sulle immagini del fondo oculare a infrarossi (IR). La retina interna è designata come lamine dello strato di cellule gangliari retiniche (RGC), dello strato plessiforme interno (IPL) e dello strato nucleare interno (INL). (B) L'immagine rappresentativa a infrarossi (IR) di un topo Rd1/NS trapiantato non ha mostrato cataratta attraverso la pupilla dilatata. (C) Immagini rappresentative in riflettanza multicolore (MR) di occhi Rd1/NS trapiantati e non trapiantati. Gli occhi trapiantati non presentavano evidenti complicanze chirurgiche, inclusa l'emorragia. (D) Colorazione immunoistochimica (IHC) di topi Rd1/NS trapiantati (foglio e sospensione) e non trapiantati (controllo). I dati hanno mostrato numerosi fotorecettori innestati che esprimono marcatori specifici di fotorecettori (Rec), bastoncelli (Rho::EGFP), coni L/M (OPN1LW:EGFP) e coni S (S-opsina) a due mesi dal trapianto. Le lamine retiniche dei riceventi sono state identificate mediante colorazione DAPI (blu). Gli innesti di retina sono stati identificati dal reporter EGFP (verde). La retina dei topi non trapiantati ha mostrato una grave degenerazione di ONL con scarsi fotorecettori dei coni residui (Rec⁺). Nessun segnale di EGFP è stato rilevato nelle retine Rd1/NS non trapiantate. Le immagini ingrandite sono state presentate nei due pannelli di destra. Abbreviazioni: RGC: strato di cellule gangliari retiniche; INL: strato nucleare interno. ONL: strato nucleare esterno. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Il trapianto sottoretinico nei topi è tecnicamente impegnativo a causa delle piccole dimensioni degli occhi dei topi. In questo studio, abbiamo sviluppato una piattaforma semplice e riproducibile per il trapianto sottoretinico in riceventi murini. La piattaforma consente una protezione costante della vitalità del donatore, un parto sottoretinico di successo e garantisce un basso tasso di complicanze.

La tecnica di trapianto sottoretinico qui descritta è stata sviluppata sulla base della via trans-sclerale, in cui l'ago di iniezione penetra negli strati esterni (complesso sclera-coroide-RPE) della parete oculare. Rispetto all'approccio trans-corneale^19,20 e trans-vitreo^21,26,27, l'approccio trans-sclerale entra direttamente nello spazio sottoretinico senza penetrare le strutture del segmento anteriore e la retina neurale^, consentendo così un trapianto innocuo e riducendo il rischio di reflusso delle cellule del donatore attraverso il foro penetrante. Una sfida dell'approccio trans-sclerale è quella di garantire che la punta dell'ago si propaghi lungo lo spazio sottoretinico prima di arrivare al sito di consegna terminale, evitando al contempo potenziali disturbi dell'RPE e degli strati coroidei adiacenti. È difficile raggiungere questi obiettivi attraverso un approccio trans-sclerale tradizionale^28,29 senza una guida visiva diretta. In questo studio, abbiamo sviluppato una piattaforma guidata dalla visione transpupillare utilizzando un microscopio operatorio e l'illuminazione esterna della retina per facilitare il trapianto sottoretinico in modelli murini. La piattaforma consente all'operatore di monitorare il processo chirurgico e le condizioni retiniche dei riceventi fornendo una visualizzazione in tempo reale del fondo oculare ricevente al microscopio operatorio. Ad esempio, la penetrazione di successo del complesso sclera-coroide-RPE può essere semplicemente convalidata da una riflettanza relativamente luminosa della punta dell'ago tramite la visualizzazione transpupillare. È importante sottolineare che, se guidato dalla visualizzazione transpupillare, l'operatore può modulare con precisione l'angolo e la profondità dell'iniezione in base alla posizione relativa tra l'ago e le strutture anatomiche nella retina ricevente (ad esempio, vasi retinici e testa del nervo ottico). Inoltre, la somministrazione accurata di materiali con questa tecnica può ridurre al minimo l'RPE, il trauma della coroide e altre complicanze chirurgiche. In effetti, abbiamo scoperto che le emorragie possono essere ridotte al minimo evitando manovre in prossimità dei vasi sanguigni retinici con l'aiuto della visualizzazione transpupillare.

Il reflusso delle cellule del donatore è una delle principali cause di fallimento chirurgico post-iniezione^29,30. Ci sono molteplici fattori coinvolti nel promuovere il reflusso delle cellule del donatore. L'elevata pressione intraoculare (IOP) degli occhi del ricevente causata dalle miscele di cellule del donatore iniettate è un fattore importante che promuove il reflusso di cellule fuori dall'occhio. Il nostro protocollo riduce la IOP dei riceventi attraverso la penetrazione della camera anteriore all'inizio dell'intervento chirurgico e consente alla IOP di abbassarsi spontaneamente per uscita di liquido acquoso prima di estrarre l'ago vitreo dalla cavità vitreale. Un secondo fattore è il tunnel di iniezione non sigillato negli occhi dei riceventi. Per prevenire il reflusso dell'innesto attraverso il tunnel di iniezione, utilizziamo un ago per microiniezione di piccole dimensioni (34G) per creare un tunnel autosigillante quando penetra nella parete oculare e una micro-pinza dentata per trattenere i bordi dell'apertura esterna del tunnel quando si estrae l'ago. Nel trapianto convenzionale, gli innesti a reflusso sono difficilmente rilevabili perché possono verificarsi rapidamente o dissiparsi rapidamente. Lo ialuronato di sodio, dopo l'applicazione del vetrino coprioggetto, quasi invariabilmente scivola via dalla cornea per coprire la maggior parte del limbus e della sclera, compreso il sito della sclerotomia. Dopo l'iniezione cellulare, lo ialuronato di sodio nel sito di sclerotomia può aiutare a rallentare il flusso di massa del contenuto reflusso, se presente, e contribuire a renderlo rilevabile visivamente al microscopio operatorio. Inoltre, l'assenza di reflusso può essere verificata anche tracciando la costanza del bleb sottoretinico per le sospensioni cellulari e la localizzazione intraoculare del foglio retinico utilizzando il nostro protocollo, che potrebbe essere utile per i laboratori in cui la tomografia a coerenza ottica (OCT) non è disponibile.

Mentre un numero considerevole di cellule fotorecettrici è sopravvissuto nei fogli retinici trapiantati, non è stato possibile rilevare alcun orientamento cellulare distinguibile, o orientamento del foglio. Sebbene sia stata stabilita la somministrazione di fogli retinici 3D ad animali di grandi dimensioni 26,31,32, lo spazio sottoretinico nei topi, insieme alla mancanza di capacità di imaging retinico intraoperatorio^, rende molto difficile garantire il mantenimento dell'orientamento del foglio intraoperatoriamente e nell'immediato periodo postoperatorio, durante il quale le cellule o i fogli trapiantati possono diventare instabili quando il topo riacquista la deambulazione.

Descriviamo una piattaforma chirurgica trans-sclerale con guida diretta alla visione transpupillare per il trapianto sottoretinico in riceventi murini. Questa piattaforma consente un'elevata precisione dell'iniezione e un basso tasso di complicanze chirurgiche. Questa piattaforma consente la somministrazione precisa di dosi note di cellule, è relativamente facile da apprendere e facilita la somministrazione sottoretinica oltre alle iniezioni intraretiniche o intravitreali per diversi tipi di agenti terapeutici, inclusa la terapia genica.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial tears	CareAll	P31447-04
Coverslips (5mm in diameter)	Deckglaser	N/A
Goat anti-GFP (FITC)	Abcam	Ab6662
Goat-anti-rabbit Cy3	Invitrogen	A10520
Insulin syringe (30G)	Easy Touch	08496-3015-11
Ketamine	VETone Zetamine	AH2017J
Live Dead Viability Kit	Thermo Fisher Scientific	L3224
Micro scissor	Harvard Apparatus	72-8503
Micro smooth forceps	ASICO	AE-4360
Micro toothed forceps	World Precision Instruments	555041FT
Microinjection needle (26G)	Hamilton	7804-03
Microinjection needle (34G)	Hamilton	207434
Microinjection syringe	Hamilton	7633-01
Papain dissociation kit	Worthington Biochemical	LK003150
Petri-dish (35 mm)	Thermo Fisher Scientific	FB012920
Povidone-iodine (10%)	Betadine Solution	N/A
Proparacaine Hydrochloride (0.5%)	Keeler	AX0500
Rabbit anti-recoverin	Millipore	Ab5585
Rabbit anti-S-opsin	Millipore	Ab5407
Sodium hyaluronate	Johnson & Johnson Vision	10-2400-11
Sterile cotton swabs	Puritan	25-806 2PC
Sterile needle (25G)	BD PrecisionGlide Needle	305122
Sterile towel drapes	Dynarex	4410
Surgical materials/reagents
Tropicamide ophthalmic solution	Henry Schein	112-7192
Xylazine	AnaSed Injection	N/A