Transpupillengesteuerte transsklerale Transplantation von subretinalen Transplantaten in einem retinalen Degenerations-Mausmodell

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt einen transpupillengesteuerten transskleralen Ansatz zur sicheren und präzisen Verabreichung subretinaler zellulärer Transplantate mit einer geringen Rate an chirurgischen Komplikationen bei Mäuseempfängern mit oder ohne Netzhautdegeneration dar.

Zusammenfassung

Die Transplantation von Photorezeptorzellen und retinalen Pigmentepithelzellen (RPE) stellt eine potenzielle Therapie für Netzhautdegenerationserkrankungen dar. Die subretinale Transplantation von therapeutischen Spenderzellen in Mäuseempfänger ist aufgrund des begrenzten chirurgischen Raums, der durch das geringe Volumen des Mausauges zur Verfügung steht, eine Herausforderung. Wir haben eine transsklerale chirurgische Transplantationsplattform mit direkter transpupillärischer Sehführung entwickelt, um die subretinale Verabreichung exogener Zellen bei Mausempfängern zu erleichtern. Die Plattform wurde mit retinalen Zellsuspensionen und dreidimensionalen Netzhautblättern getestet, die von stäbchenreichen Rho:: EGFP-Mäusen und zapfenreichen OPN1LW-EGFP gesammelt wurden. NRL^-/- Mäusen. Der Lebend-/Tottest zeigte eine geringe Zellmortalität für beide Formen von Spenderzellen. Netzhauttransplantate wurden erfolgreich in den subretinalen Raum eines Mausmodells für Netzhautdegeneration, Rd1/NS, eingebracht, mit minimalen chirurgischen Komplikationen, die durch multimodale konfokale Scanning-Laser-Ophthalmoskop-Bildgebung (cSLO) festgestellt wurden. Zwei Monate nach der Transplantation zeigte die histologische Färbung Hinweise auf eine fortgeschrittene Reifung der Netzhauttransplantate zu "adulten" Stäbchen und Zapfen (durch robuste Rho::EGFP-, S-Opsin- bzw. OPN1LW:EGFP-Expression) im subretinalen Raum. Hier stellen wir eine chirurgische Plattform zur Verfügung, die eine hochpräzise subretinale Verabreichung mit einer geringen Komplikationsrate bei Mausempfängern ermöglichen kann. Diese Technik bietet Präzision und relativ einfaches Erlernen von Fähigkeiten. Darüber hinaus könnte die Technik nicht nur für Studien zur subretinalen Zelltransplantation verwendet werden, sondern auch für andere intraokulare therapeutische Studien, einschließlich Gentherapien.

Einleitung

Die Transplantation von Photorezeptor- und retinalen pigmentierten Epithelzellen (RPE) bietet eine potenzielle Therapie für degenerative Netzhauterkrankungen wie altersbedingte Makuladegeneration (AMD), Morbus Stargardt und Retinitis pigmentosa (RP)1,2,3,4,5,6,7 . Um die erkrankten Photorezeptoren und RPE-Zellen in degenerierten Netzhäuten wieder aufzufüllen oder zu ersetzen, eignet sich der subretinale Raum aufgrund der laminaren Anatomie der Wirts-Photorezeptoren und RPE-Zellen besonders gut als Transplantationsziel. Während chirurgische Verfahren der subretinalen Transplantation von RPE-Zellen bei großen Tieren gut etabliert sind 8,9,10 und klinische Studien^11,12,13, zu den Herausforderungen für die Photorezeptortransplantationsforschung gehören unter anderem der Mangel an transgenen Großtiermodellen und das begrenzte Verständnis der tiefgreifenden Synaptogenesemechanismen^, die an der neuronalen Transplantation beteiligt sind. Genetisch modifizierte Mausmodelle mit verschiedenen Arten von retinalen Degenerationsmutanten bieten nützliche Werkzeuge, um molekulare Mechanismen im Kontext von Transplantationen zu untersuchen und die Entwicklung wirksamer Zellersatztherapien im präklinischen Stadium zu steuern 14,15,16,17,18.

Im Gegensatz zu dem relativ großen Auge und der kleinen Augenlinse bei großen Tieren (z. B. Schwein, Affe) machen die geringe Größe und die große kristalline Linse von Mäuseaugen sie zu schwierigen chirurgischen Zielen, insbesondere für subretinale Transplantationen, bei denen der räumliche Raum und die eingeschränkte direkte Visualisierung die größten Herausforderungen darstellen.

Derzeitige Ansätze können je nach Injektionsweg in drei Haupttypen eingeteilt werden. Zunächst wird beim transkornealen Zugang die Nadel durch die Hornhaut in den Glaskörper und dann in den subretinalen Raum^19,20 eingeführt. Mit dieser Methode kann eine erfolgreiche subretinale Verabreichung erreicht werden, aber die Schädigung der Strukturen des vorderen Segments (d. h. Hornhaut, Iris, Linse) ist ein großes Risiko, das die nachgeschaltete In-vivo-Analyse stark behindern kann. Zweitens tritt die Nadel im Falle des trans-glasartigen Zugangs durch die Pars plana in die Glaskörperhöhle und dann in den subretinalen Raum²¹ ein. Dieser Ansatz ist bei Menschen und Großtieren weit verbreitet. Es besteht jedoch ein potenzielles Risiko einer Linsenschädigung bei Nagetieren, da die Linse ein größeres relatives Volumen des Glaskörpers einnimmt. Bemerkenswert ist, dass sowohl transkorneale als auch transglasartige Protokolle eine Penetration der neuralen Netzhaut erfordern, um in den subretinalen Raum zu gelangen, was die Wirtsnetzhaut schädigt und das Risiko eines Rückflusses von Spenderzellen durch das Penetrationsloch erhöht. Drittens dringt die Nadel im Falle des transskleralen Zugangs^22,23 durch den Skleral-Aderhaut-RPE-Komplex und dringt direkt in den subretinalen Raum ein. Dieser Ansatz reduziert das potenzielle Trauma von vorderen Segmentstrukturen und der Glaskörperhöhle. Ohne direkte Visualisierung des Wirtsfundus werden jedoch häufig chirurgische Misserfolge durch transretinale Punktionen, RPE-Ablösung und Aderhautblutungen erkannt.

Hier haben wir eine transsklerale chirurgische Plattform mit direkter transpupillär Visionsführung für die subretinale Transplantation bei Mausempfängern entwickelt. Validierung der Lebensfähigkeit von Spender-Netzhautfolien und Zellsuspensionen vor der Transplantation. Die erfolgreiche Einschleusung der Spenderzellen in den subretinalen Raum eines retinhautdegenerativen Mausmodells wurde bestätigt. Es wurden nur seltene chirurgische Komplikationen festgestellt. Darüber hinaus überlebten transplantierte Photorezeptoren in den Netzhauttransplantaten und zeigten zwei Monate nach der Transplantation Anzeichen einer fortgeschrittenen Reifung zu "erwachsenen" Stäbchen und Zapfen.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publications No. 8023, überarbeitet 1978) und der ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research durchgeführt. Alle Verfahren wurden vom Animal Care and Use Committee der Johns Hopkins University genehmigt (Genehmigung M021M459).

1. Tiere

1. Verwenden Sie Rho::EGFP-Mäuse (im Alter von P3-P6) als Spender von Netzhautzellsuspensionen.
   HINWEIS: Diese Sorte war ein freundliches Geschenk von Dr. T. Wensel, Baylor College of Medicine.
2. Verwenden Sie OPN1LW-EGFP/NRL-^/- Mäuse¹⁴ (im Alter von P3) als Spender von Netzhautblättern.
3. Verwenden Sie adulte Rd1/NS-Mäuse mit Netzhautdegeneration und Immunschwäche (beiderlei Geschlechts) als Empfänger.
4. Unterbringung aller Mäuse in Käfigen unter einem 12:12 h Hell-Dunkel-Zyklus mit Zugang zu Wasser und Futter nach Bedarf.

2. Sammeln Sie die neuronale Netzhaut (Abbildung 1)

HINWEIS: Alle folgenden Schritte wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Lieferanteninformationen zu den Forschungswerkzeugen und -produkten finden Sie in der Materialtabelle.

1. Vorbereitung von Spendermäusen: Euthanasie von Spendermäusen mit einer Überdosis Kohlendioxid und Bestätigung der Euthanasie mit Gebärmutterhalsluxation.
2. Isolieren Sie die Augäpfel von Mäusen. Führen Sie dazu die folgenden Schritte aus.
   1. Öffnen Sie vorsichtig die Augenlider der Welpen mit einer Mikroschere, um den Augapfel freizulegen.
   2. Greife mit einer glatten Pinzette den Sehnerv und ziehe den Augapfel mit einer Pinzette heraus.
3. Neurale Netzhaut isolieren
   HINWEIS: Dieser Schritt wird unter einem Präpariermikroskop durchgeführt.
   1. Schneiden Sie mit einer sterilen 25-G-Nadel ein Loch in die Mitte der Hornhaut.
   2. Schneiden Sie die Hornhaut durch das Loch in zwei Hälften und vergrößern Sie den Einschnitt bis zur Sklera und zum RPE, dann entfernen Sie die Sklera und das RPE.
   3. Verwenden Sie eine mikroverzahnte Pinzette, um die Linse vorsichtig zu entfernen, und entfernen Sie den Glaskörper, um die neurale Netzhaut zu isolieren.
   4. Fahren Sie mit Abschnitt 3 fort, um die Spender-Netzhautsuspension vorzubereiten, oder mit Abschnitt 4, um das Spender-Netzhautblatt vorzubereiten, je nach Bedarf.

3. Vorbereiten der Spender-Netzhautsuspension (Abbildung 1)

1. Inkubieren Sie die neurale Netzhaut in Papain-Lösung bei 37 °C für 20-30 Minuten, bis keine Zellklumpen mehr entdeckt werden.
   HINWEIS: Pifettieren Sie die Zellmischung vorsichtig 15x alle 10 Minuten.
2. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers des Papain-Dissoziationskits, um einzelne Zellen zu entnehmen.

4. Vorbereiten der Netzhautblätter des Spenders (Abbildung 1)

HINWEIS: Dieser Schritt folgt Abschnitt 2 und wird unter einem Präpariermikroskop durchgeführt.

1. Den isolierten neuralen Netzhautbecher in eine 35-mm-Petrischale mit vorgekühltem sterilem PBS geben.
2. Verwenden Sie eine Mikroschere, um die neurale Netzhautschale in mehrere Netzhautschichten (ca. 1 mm x 2 mm) zu schneiden.

5. Empfängermäuse vorbereiten

1. Anästhesieren von Empfängermäusen mit intraperitonealer Injektion von Ketamin (100 mg/kg Körpergewicht) und Xylazinhydrochlorid (20 mg/kg Körpergewicht).
2. Bestätigen Sie die chirurgische Ebene der Anästhesie, indem Sie den Verlust von Blinzel- und Schmerzreflexen, regelmäßiger Atmung und Atmung sicherstellen.
3. Beurteilen Sie die Narkosetiefe anhand der mangelnden Reaktion auf das Einklemmen des Schwanzes oder den Rückzug der Pedalreflexe.
4. Überprüfen Sie die Narkosetiefe während des operativen Eingriffs immer erneut und passen Sie die Narkosetiefe an, wenn das Tier auf Schmerzen reagiert. Bewahren Sie die Mäuse auf dem vorgewärmten OP-Tisch auf, um eine Unterkühlung zu vermeiden.
5. Erweitern Sie die Pupillen des Empfängers 5 Minuten vor der Operation mit 1 % (Gew./Vol.) Tropicamid Augentropfen. Eine gut erweiterte Pupille kann die transpupilläre Darstellung unter dem Operationsmikroskop erleichtern.
6. Das operierende Mausauge und das umgebende Augengewebe mit Povidon-Jod desinfizieren, mit sterilisiertem PBS waschen.
7. Tragen Sie 0,5% Proparacainhydrochlorid zur Analgesie auf das Mausauge auf.

6. Subretinale Transplantation von Netzhauttransplantaten (Abbildung 2)

HINWEIS: Alle folgenden Schritte wurden unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Chirurgische Instrumente wurden autoklaviert (verwenden Sie Instrumentenschalen, um die Werkzeugspitzen zu schützen, und nehmen Sie den Kolben aus den Mikrospritzen, um zu verhindern, dass sie im Lumen stecken bleiben). Lieferanteninformationen zu den Forschungswerkzeugen und -produkten finden Sie in der Materialtabelle.

1. Vorderkammerparazentese: Mit einer Insulinnadel wird die periphere Hornhaut in die Vorderkammer eingedrungen, um das Kammerwasser passiv entweichen zu lassen, um die Augeninnendruckspitzen (IOD) während der Transplantation zu verhindern.
   HINWEIS: Eine erfolgreiche Parazentese wird durch den Ausfluss von Kammerwasser durch das Hornhautloch angezeigt.
2. Geben Sie einen Tropfen Natriumhyaluronat und ein Deckglas (5 mm Durchmesser) auf die Hornhaut, um eine transpupilläre Visualisierung des Fundus unter dem chirurgischen Endoskop zu ermöglichen.
3. Verwenden Sie eine Zahnzange, um den Injektionsort (1 mm post-cornealer Limbus) freizulegen, indem Sie entweder die obere oder untere Augenwand, wie für das Experiment erforderlich, in Richtung des Zentrums des transpupillären Sehens drücken.
4. Verwenden Sie eine Mikroinjektionsnadel, um senkrecht in die Sklera einzudringen.
5. Drehen Sie die Nadelrichtung vorsichtig tangential, um eine vollständige Penetration des Sklera-Aderhaut-RPE-Komplexes in den subretinalen Raum zu ermöglichen.
6. Führen Sie die Nadel tangential ein, um an den terminalen Injektionsort zu gelangen.
   HINWEIS: Überprüfen Sie die vollständige Positionierung der Abschrägung der Nadel durch die Führung des transpupillären Sehens. Verwenden Sie die oberflächlichen Netzhautgefäße als anatomische Referenz für eine genaue Nadelpositionierung im subretinalen Raum.
7. Netzhauttransplantate injizieren
   HINWEIS: Das Vorhandensein kleiner Bläschen, die in der Spritze vorgeladen sind, kann die Validierung der genauen subretinalen Positionierung von Spenderzellen erleichtern. Ein erhöhter Augeninnendruck infolge der subretinalen Injektion erhöht das Risiko eines Spenderzellrefluxes.
   1. Wenn die Hornhaut trüb wird^24,25, ein Indikator für einen hohen IOD, halten Sie die Nadel mindestens 3 Minuten lang im subretinalen Raum, bis die Hornhaut frei ist, ein Indikator dafür^, dass der IOD ausreichend gesunken ist.
      HINWEIS: In seltenen Fällen kann es länger dauern, bis sich der Augeninnendruck normalisiert hat, und es wird empfohlen, die Nadel an Ort und Stelle zu lassen, bis die Klarheit der Hornhaut wiederhergestellt ist, auch wenn dies 8-10 Minuten dauern würde. Unter dem Operationsmikroskop beobachten, um Schäden an Netzhautstrukturen zu vermeiden.
8. Fassen Sie den Rand des Injektionslochs mit einer mikroverzahnten Pinzette und ziehen Sie die Nadel schnell zurück.
   HINWEIS: Die Kriterien für eine erfolgreiche subretinale Verabreichung einer retinalen Zellsuspension und eines retinalen Blattes sind ein konstantes Bläschen bzw. ein sichtbares weißes Blatt im subretinalen Raum.
9. Reinigen Sie den Operationsbereich des Auges mit künstlichen Tränen und tragen Sie bei Bedarf Salbe auf.
10. Verabreichung nach der Operation
    1. Setzen Sie transplantierte Mäuse in einen vorgewärmten (37 °C) sauberen Erholungskäfig und überwachen Sie sie sorgfältig auf Stress.
    2. Tragen Sie einen Tropfen topisches 0,5%iges Proparacainhydrochlorid 2-3 Mal auf das chirurgische Auge auf, wenn Stress auftritt.
    3. Bringen Sie die Mäuse in den Käfig zurück, wenn die Mäuse vollständig wach und mobil sind. Legen Sie eine kleine Anzahl Futterpellets und einen Gelbecher in den Käfig, wenn die Mäuse Schwierigkeiten haben, den Futterbehälter zu erreichen.
       HINWEIS: Halten Sie die Augenoberfläche feucht, bis die Anästhesie nachlässt, um die Bildung von Katarakt zu verhindern.

7. Multimodale konfokale Scanning-Laser-Ophthalmoskopie (cSLO)-Bildgebung

1. Zwei Monate nach der Transplantation werden Rd1 /NS-Empfängermäuse (n=5) durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (100 mg/kg Körpergewicht) und Xylazinhydrochlorid (20 mg/kg Körpergewicht) für die Bildgebung anästhesiert.
2. Pupillen mit 1 % (Gew./Vol.) Tropicamid-Augentropfen erweitern.
3. Führen Sie eine standardmäßige multimodale 55°-Bildgebung mit dem konfokalen Scanning-Laser-Ophthalmoskop-cSLO-System²² durch.
4. Erhalten Sie MR- und SD-OCT-Bilder mit 30 Bildern ART-Mittelwertbildung.

8. Histologische Färbung

1. Bereiten Sie gefrorene Objektträger von transplantierten Rd1/NS-Mäuseaugen vor, wie zuvor berichtet ¹⁴.
2. Blockieren und penetrieren Sie die gefrorenen Objektträger der transplantierten Netzhaut mit einer Mischung aus 5 % Ziegenserum und 1 % Triton X100 in PBS.
3. Proben mit Primärantikörpern über Nacht bei 4 °C inkubieren und in PBS spülen (5 min, 3x). Zu den primären Antikörpern gehören Ziegen-Anti-GFP-FITC (1:200), Kaninchen-Anti-Recoverin (1:1000) und Kaninchen-Anti-S-Opsin (1:500).
4. Die Proben werden mit einem sekundären Antikörper (Ziegen-Anti-Kaninchen-Cy3, 1:500) inkubiert und mit DAPI gegengefärbt.
   HINWEIS: Die Lieferanten von Primär- und Sekundärantikörpern sind in der Materialtabelle aufgeführt.

Ergebnisse

Netzhauttransplantate werden erfolgreich in den subretinalen Raum eingebracht und in vivo überlebt.
Die Leistungsfähigkeit unserer subretinalen Transplantationsplattform wurde bei Rd1/NS-Empfängermäusen im Alter von 6-8 Wochen untersucht, als ihre verbleibende Netzhaut aufgrund der fast vollständigen Degeneration der äußeren Kernschicht (ONL) stark ausgedünnt war. Angesichts der Zerbrechlichkeit der Netzhaut, der Seltenheit von Zapfen-Photorezeptoren und der relativ schlechten Lebensfähigkeit von Zellen in Suspension im Vergleich zu Blattspendern sollten zapfenreiche Mäuse (OPN1LW-EGFP; NRL-^/-)¹⁴ wurden als Quellen für Spender-Netzhautblätter und stäbchenreiche Mäuse (Rho::EGFP) als Spender für Zellsuspensionen verwendet. Zapfenreiches Netzhautblatt und stäbchenreiche Zellsuspensionen wurden allen Empfängermäusen mit unserer chirurgischen Plattform erfolgreich in den subretinalen Raum eingebracht, was durch die subretinale Blase und das weiße Blatt bestätigt wird, die unmittelbar nach der Injektion mittels transpupillärer Visualisierung zu sehen sind. Zwei Monate nach der Transplantation wurde eine multimodale cSLO-Bildgebung durchgeführt, um den Zustand der Netzhauttransplantate in vivo zu verfolgen. OCT-Querschnittsuntersuchungen zeigten, dass Netzhauttransplantate im subretinalen Raum überlebten und die ONL in allen Empfängermäusen rekonstituierten (Abbildung 3A). Die Infrarot-Bildgebung detektierte keine offensichtlichen Katarakte in allen transplantierten Augen (Abbildung 3B). Andere chirurgische Komplikationen, einschließlich Blutungen, wurden in transplantierten Netzhäuten (n = 1/10 Augen) durch mehrfarbige Reflexionsbildgebung zwei Monate nach der Transplantation selten nachgewiesen (Abbildung 3C). Wir führten histologische Färbungen durch, um das Überleben und das Ausmaß der Reifung von Photorezeptoren in Netzhauttransplantaten weiter zu beurteilen. Es wurden reichlich Zapfen-Photorezeptoren beobachtet, die OPN1LW:EGFP und S-Opsin in transplantierten Netzhautschichten exprimieren. Ebenso zeigten transplantierte Netzhautzellsuspensionen in vivo einen großen Anteil an Rec+-Photorezeptoren, darunter zahlreiche Rho::EGFP⁺-Stäbchen (Abbildung 3D). Die nicht transplantierten Kontrollmäuse zeigten eine starke ONL-Degeneration mit spärlichen Restzapfen-Photorezeptoren (Rec⁺). In der nicht transplantierten Rd1/NS-Netzhaut wurde kein EGFP-Signal nachgewiesen (Abbildung 3D).

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Entnahme von Spendernetzhautfolien und Zellsuspensionen. Schematische Darstellung der wichtigsten Schritte der Entnahme von Netzhautzellsuspensionen und -blättern von Rho::EGFP-Spendermäusen . Die Hellfeld- und Fluoreszenzbildgebung zeigte repräsentative Bilder von dissoziierten Zellen und einem präparierten Blatt, das aus Rho::EGFP-Mäusen isoliert wurde. Gelbe gestrichelte Linie: Schnittrand. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Verfahren der subretinalen Transplantation von Netzhautblättern und Zellsuspension bei Rd1/NS-Mäusen . (A) Schematische Bilder der Präparation der Empfängermäuse. (B) Wichtige chirurgische Verfahren und entsprechende Diagramme, die die subretinale Transplantation von retinalen Zellsuspensionen und -folien zeigen. Zu den chirurgischen Schritten gehören: 1. Eindringen in die Vorderkammer; 2. Tropfen Sie das Natriumhyaluronat auf die Hornhaut und montieren Sie dann das Deckglas auf das Natriumhyaluronat, um die transpupilläre Visualisierung zu erleichtern. 3. die äußeren Schichten der Augenwand durchdringen (Sklera-Aderhaut-RPE-Komplex). Die Eindringwinkel der Nadel befinden sich oben rechts in der Abbildung. 4. Injektionsnadel einführen; 5. Injizieren Sie Transplantate. Repräsentative Bilder zeigen die erfolgreiche Verabreichung von Netzhautzellsuspensionen und -blättern bei zwei einzelnen Empfängern. Sternchen: Sehnervenkopf; Rote Pfeilspitzen: retinales Blutgefäß; Weiße Pfeilspitze: durchdrungene Nadelspitze; Weiße Pfeile: transplantierte Netzhautsuspensionen oder -blätter. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Erfolgreiche Verabreichung von Netzhauttransplantaten in den subretinalen Raum und Überleben in vivo. (A) Repräsentative SD-OCT-Bilder zeigten die subretinale Verteilung der transplantierten Netzhautblätter und Zellsuspensionen in jeweils zwei einzelnen Rd1/NS-Mäusen . Nicht transplantierte Rd1/NS-Mäuse wurden als Kontrolle gesammelt. Die Region of Interest (ROI) wird durch gelb gepunktete Kästchen auf Infrarot-Fundusbildern (IR) angezeigt. Die innere Netzhaut wird als Lamina der retinalen Ganglienzellschicht (RGC), der inneren plexiformen Schicht (IPL) und der inneren Kernschicht (INL) bezeichnet. (B) Repräsentatives Infrarot (IR)-Bild einer transplantierten Rd1/NS-Maus zeigte keinen Katarakt durch die erweiterte Pupille. (C) Repräsentative mehrfarbige Reflexionsbilder (MR) von transplantierten und nicht transplantierten Rd1/NS-Augen . Die transplantierten Augen wiesen keine offensichtlichen chirurgischen Komplikationen einschließlich Blutungen auf. (D) Immunhistochemische (IHC) Färbung von transplantierten (Blatt und Suspension) und nicht transplantierten (Kontroll) Rd1/NS-Mäusen . Die Daten zeigten zwei Monate nach der Transplantation zahlreiche transplantierte Photorezeptoren, die spezifische Marker von Photorezeptoren (Rec), Stäbchen (Rho::EGFP), L/M-Zapfen (OPN1LW:EGFP) und S-Zapfen (S-Opsin) exprimierten. Die retinalen Laminae des Empfängers wurden durch DAPI-Färbung (blau) identifiziert. Netzhauttransplantate wurden von einem EGFP-Reporter (grün) identifiziert. Die nicht transplantierte Retina der Mäuse zeigte eine schwere ONL-Degeneration mit spärlichen Restzapfen-Photorezeptoren (Rec⁺). In nicht-transplantierten Rd1/ NS-Netzhäuten wurde kein EGFP-Signal detektiert. Vergrößerte Bilder wurden auf den rechten beiden Tafeln präsentiert. Abkürzungen: RGC: retinale Ganglienzellschicht; INL: innere Kernschicht. ONL: äußere Kernschicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Die subretinale Transplantation bei Mäusen ist aufgrund der geringen Größe der Mäuseaugen technisch anspruchsvoll. In dieser Studie haben wir eine einfache und reproduzierbare Plattform für die subretinale Transplantation bei Mausempfängern entwickelt. Die Plattform ermöglicht einen konsistenten Schutz der Lebensfähigkeit des Spenders, eine erfolgreiche subretinale Verabreichung und gewährleistet eine niedrige Komplikationsrate.

Die hier dargestellte subretinale Transplantationstechnik wurde auf der Grundlage des transskleralen Weges entwickelt, bei dem die Injektionsnadel in die äußeren Schichten (Sklera-Aderhaut-RPE-Komplex) der Augenwand eindringt. Im Vergleich zum trans-cornealen^19,20- und trans-vitreösen^{21,26,27-Ansatz} tritt der transsklerale Zugang direkt in den subretinalen Raum ein, ohne die vorderen Segmentstrukturen und die neurale Netzhaut zu durchdringen^, wodurch eine harmlose Transplantation ermöglicht und das Risiko eines Spenderzellrückflusses durch das eindringende Loch verringert wird. Eine Herausforderung des transskleralen Ansatzes besteht darin, sicherzustellen, dass sich die Nadelspitze entlang des subretinalen Raums ausbreitet, bevor sie an der terminalen Entbindungsstelle ankommt, und gleichzeitig eine mögliche Störung der angrenzenden RPE- und Aderhautschichten zu vermeiden. Es ist eine Herausforderung, diese Ziele durch einen traditionellen transskleralen Ansatz^28,29 ohne direkte visuelle Führung zu erreichen. In dieser Studie haben wir eine transpupilläre Visionsplattform entwickelt, die ein Operationsmikroskop und eine externe Beleuchtung der Netzhaut verwendet, um die subretinale Transplantation in Mausmodellen zu erleichtern. Die Plattform ermöglicht es dem Operateur, den chirurgischen Prozess und den Netzhautzustand des Empfängers zu verfolgen, indem er den Fundus des Empfängers unter dem Operationsmikroskop in Echtzeit visualisiert. Zum Beispiel kann die erfolgreiche Penetration des Sklera-Aderhaut-RPE-Komplexes einfach durch eine relativ helle Reflexion der Nadelspitze über die transpupille Visualisierung validiert werden. Wichtig ist, dass der Bediener bei Anleitung durch die transpupilläre Visualisierung den Winkel und die Tiefe der Injektion entsprechend der relativen Position zwischen der Nadel und den anatomischen Strukturen in der Netzhaut des Empfängers (z. B. Netzhautgefäße und Sehnervenkopf) genau modulieren kann. Darüber hinaus kann die genaue Verabreichung von Materialien mit dieser Technik RPE, Aderhauttraumata und andere chirurgische Komplikationen minimieren. In der Tat haben wir festgestellt, dass Blutungen minimiert werden können, indem Manöver in unmittelbarer Nähe der retinalen Blutgefäße mit Hilfe der transpupillären Visualisierung vermieden werden.

Der Rückfluss von Spenderzellen ist eine der Hauptursachen für chirurgisches Versagen nach der Injektion^29,30. Es gibt mehrere Faktoren, die an der Förderung des Refluxes von Spenderzellen beteiligt sind. Der hohe Augeninnendruck (IOD) der Empfängeraugen, der durch die injizierten Spenderzellmischungen verursacht wird, ist ein wichtiger Faktor, der den Rückfluss von Zellen aus dem Auge fördert. Unser Protokoll reduziert den Augeninnendruck des Empfängers durch Penetration der Vorderkammer zu Beginn der Operation und ermöglicht es ihm, den Augeninnendruck spontan durch wässrigen Flüssigkeitsaustritt zu senken, bevor die Glaskörpernadel aus der Glaskörperhöhle herausgezogen wird. Ein zweiter Faktor ist der unverschlossene Injektionstunnel in den Augen der Empfänger. Um einen Rückfluss des Transplantats durch den Injektionstunnel zu verhindern, verwenden wir eine kleine Mikroinjektionsnadel (34G), um beim Eindringen in die Augenwand einen selbstdichtenden Tunnel zu schaffen, und eine gezahnte Mikropinzette, um die Ränder der äußeren Tunnelöffnung beim Herausziehen der Nadel zu halten. Bei der konventionellen Transplantation werden Refluxtransplantate kaum erkannt, da sie schnell auftreten oder sich schnell auflösen können. Das Natriumhyaluronat gleitet beim Auftragen des Deckglases fast ausnahmslos von der Hornhaut ab und bedeckt den größten Teil des Limbus und der Sklera einschließlich der Sklerotomiestelle. Nach der Zellinjektion kann das Natriumhyaluronat an der Sklerotomiestelle dazu beitragen, den Massenfluss von refluxiertem Inhalt, falls vorhanden, zu verlangsamen und ihn unter dem Operationsmikroskop visuell erkennbar zu machen. Darüber hinaus kann die Abwesenheit von Reflux auch überprüft werden, indem die Konstanz der subretinalen Blase für Zellsuspensionen und die intraokulare Lage der Netzhautfolie mit unserem Protokoll verfolgt werden, was für Labore nützlich sein könnte, in denen keine optische Kohärenztomographie (OCT) verfügbar ist.

Während eine beträchtliche Anzahl von Photorezeptorzellen in den transplantierten Netzhautschichten überlebte, konnte keine erkennbare Zellorientierung oder Blattorientierung nachgewiesen werden. Obwohl die Verabreichung von 3D-Netzhautblättern an große Tiere etabliert ist 26,31,32, macht es der subretinale Raum bei Mäusen in Verbindung mit der fehlenden intraoperativen Netzhautbildgebungsfähigkeit sehr schwierig, die Aufrechterhaltung der Blattorientierung sowohl intraoperativ als auch in der unmittelbaren postoperativen Phase sicherzustellen, in der die transplantierten Zellen oder Blätter instabil werden können^, wenn die Maus wieder läuft.

Wir beschreiben eine transsklerale chirurgische Plattform mit direkter transpupillärer Visionsführung für die subretinale Transplantation bei Mausempfängern. Diese Plattform ermöglicht eine hohe Injektionsgenauigkeit und eine geringe Rate an chirurgischen Komplikationen. Diese Plattform ermöglicht die präzise Verabreichung bekannter Zelldosen, ist relativ einfach zu erlernen und erleichtert die subretinale Verabreichung zusätzlich zu intraretinalen oder intravitrealen Injektionen für verschiedene Arten von Therapeutika, einschließlich der Gentherapie.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial tears	CareAll	P31447-04
Coverslips (5mm in diameter)	Deckglaser	N/A
Goat anti-GFP (FITC)	Abcam	Ab6662
Goat-anti-rabbit Cy3	Invitrogen	A10520
Insulin syringe (30G)	Easy Touch	08496-3015-11
Ketamine	VETone Zetamine	AH2017J
Live Dead Viability Kit	Thermo Fisher Scientific	L3224
Micro scissor	Harvard Apparatus	72-8503
Micro smooth forceps	ASICO	AE-4360
Micro toothed forceps	World Precision Instruments	555041FT
Microinjection needle (26G)	Hamilton	7804-03
Microinjection needle (34G)	Hamilton	207434
Microinjection syringe	Hamilton	7633-01
Papain dissociation kit	Worthington Biochemical	LK003150
Petri-dish (35 mm)	Thermo Fisher Scientific	FB012920
Povidone-iodine (10%)	Betadine Solution	N/A
Proparacaine Hydrochloride (0.5%)	Keeler	AX0500
Rabbit anti-recoverin	Millipore	Ab5585
Rabbit anti-S-opsin	Millipore	Ab5407
Sodium hyaluronate	Johnson & Johnson Vision	10-2400-11
Sterile cotton swabs	Puritan	25-806 2PC
Sterile needle (25G)	BD PrecisionGlide Needle	305122
Sterile towel drapes	Dynarex	4410
Surgical materials/reagents
Tropicamide ophthalmic solution	Henry Schein	112-7192
Xylazine	AnaSed Injection	N/A