Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتمثل أحد تحديات تحليل تجارب السلاسل الزمنية المتزامنة في أن التجارب غالبا ما تختلف في طول فترة التعافي من التزامن وفترة دورة الخلية. وبالتالي ، لا يمكن تحليل القياسات من التجارب المختلفة بشكل إجمالي أو مقارنتها بسهولة. نصف هنا طريقة لمواءمة التجارب للسماح بإجراء مقارنات خاصة بالطور.

Abstract

غالبا ما يعتمد التحقيق في دورة الخلية على مزامنة مجموعات الخلايا لقياس المعلمات المختلفة في سلسلة زمنية حيث تجتاز الخلايا دورة الخلية. ومع ذلك ، حتى في ظل ظروف مماثلة ، تظهر التجارب المكررة اختلافات في الوقت اللازم للتعافي من التزامن واجتياز دورة الخلية ، وبالتالي منع المقارنات المباشرة في كل نقطة زمنية. تتفاقم مشكلة مقارنة القياسات الديناميكية عبر التجارب في المجموعات السكانية الطافرة أو في ظروف النمو البديلة التي تؤثر على وقت استعادة التزامن و / أو فترة دورة الخلية.

لقد نشرنا سابقا نموذجا رياضيا بارامتريا يسمى توصيف فقدان تزامن دورة الخلية (CLOCCS) الذي يراقب كيفية إطلاق المجموعات المتزامنة للخلايا من التزامن والتقدم خلال دورة الخلية. يمكن بعد ذلك استخدام المعلمات المستفادة من النموذج لتحويل النقاط الزمنية التجريبية من تجارب السلاسل الزمنية المتزامنة إلى مقياس زمني طبيعي (نقاط شريان الحياة). بدلا من تمثيل الوقت المنقضي بالدقائق من بداية التجربة ، يمثل مقياس شريان الحياة التقدم من التزامن إلى دخول دورة الخلية ثم عبر مراحل دورة الخلية. نظرا لأن نقاط شريان الحياة تتوافق مع مرحلة الخلية المتوسطة داخل السكان المتزامنين ، فإن هذا المقياس الزمني الطبيعي يسمح بإجراء مقارنات مباشرة بين التجارب ، بما في ذلك تلك التي لها فترات وأوقات استرداد مختلفة. علاوة على ذلك ، تم استخدام النموذج لمواءمة تجارب دورة الخلية بين الأنواع المختلفة (على سبيل المثال ، Saccharomyces cerevisiae و Schizosaccharomyces pombe) ، مما يتيح المقارنة المباشرة لقياسات دورة الخلية ، والتي قد تكشف عن أوجه التشابه والاختلاف التطورية.

Introduction

تعد قياسات السلاسل الزمنية التي يتم إجراؤها على مجموعات متزامنة من الخلايا أثناء تقدمها خلال دورة الخلية طريقة قياسية للتحقيق في الآليات التي تتحكم في تقدم دورة الخلية1،2،3،4،5،6،7،8. تعد القدرة على إجراء مقارنات عبر تجارب السلاسل الزمنية المتزامنة / الإصدار أمرا حيويا لفهمنا لهذه العمليات الديناميكية. يمكن أن يؤدي استخدام التجارب المكررة لتأكيد النتائج إلى زيادة الثقة في إمكانية استنساخ الاستنتاجات. علاوة على ذلك ، يمكن للمقارنات بين الظروف البيئية ، عبر الطفرات ، وحتى بين الأنواع أن تكشف عن العديد من الأفكار الجديدة في تنظيم دورة الخلية. ومع ذلك ، فإن التباين بين التجارب في التعافي من التزامن وفي سرعة تقدم دورة الخلية يضعف القدرة على إجراء مقارنات من نقطة زمنية إلى نقطة زمنية عبر النسخ المتماثلة أو بين التجارب مع تغيير توقيت دورة الخلية. بسبب هذه التحديات ، غالبا ما لا يتم تضمين النسخ المتماثلة لسلسلة الدوام الكامل (على سبيل المثال ، Spellman et al.4). عندما يتم جمع النسخ المتماثلة للسلسلة الزمنية بأكملها ، لا يمكن تحليل البيانات بشكل إجمالي ، ولكن بدلا من ذلك يتم استخدام نسخة متماثلة واحدة للتحليل ، وغالبا ما يتم إنزال النسخ المتماثلة الأخرى إلى أرقام تكميلية (على سبيل المثال ، Orlando et al.8). علاوة على ذلك ، من الصعب إجراء مقارنات بين التجارب ذات الخصائص المختلفة للتعافي أو تقدم دورة الخلية. يمكن أن تساعد قياسات الفواصل الزمنية الأصغر بين حدث مهم ومعلم دورة الخلية (على سبيل المثال ، ظهور البراعم أو دخول المرحلة S أو بداية الطور) في تقليل الأخطاء إذا تم تتبع هذه الأحداث البارزة1،2،3،9،10،11،12. ومع ذلك ، قد تظل الاختلافات الدقيقة ولكن المهمة غير مكتشفة أو محجوبة باستخدام هذه الأساليب المخصصة. أخيرا ، تسمح تحليلات الخلية الواحدة بتحليل تقدم دورة الخلية دون الاعتماد على التزامن أو المحاذاة13 ، على الرغم من أن القياسات واسعة النطاق في دراسات الخلية الواحدة يمكن أن تكون صعبة ومكلفة.

للتغلب على هذه الصعوبات ، قمنا بتطوير نموذج توصيف فقدان تزامن دورة الخلية (CLOCCS) للمساعدة في تحليل قياسات السلاسل الزمنية التي تم إجراؤها على السكان المتزامنين14،15. CLOCCS هو نموذج رياضي مرن يصف توزيع الخلايا المتزامنة عبر مراحل دورة الخلية عند إطلاقها من التزامن والتقدم خلال دورة الخلية. يمكن إطار عملية التفرع النموذج من حساب الصفات غير المتماثلة لخلايا الأم والابنة بعد الانقسام ، كما لوحظ في S. cerevisiae ، بينما لا يزال مفيدا للكائنات الحية التي تنقسم عن طريق الانشطار ، مثل S. pombe. يمكن أن يأخذ النموذج مدخلات من مجموعة متنوعة من أنواع القياس لتحديد مرحلة دورة الخلية. يمكنه استيعاب بيانات مرحلة دورة الخلية الناشئة ، والتي تتضمن قياسات النسبة المئوية للخلايا الناشئة بمرور الوقت ، مما يسمح بتقدير عدد الخلايا خارج المرحلة G1 غير المهدة14,15. يمكن للنموذج أيضا استيعاب بيانات قياس التدفق الخلوي التي تقيس محتوى الحمض النووي ، مما يتيح تقييم التحولات البارزة من G1 إلى S ، و S إلى G2 ، و M إلى G115. يمكن أيضا استخدام العلامات المورفولوجية الفلورية لتحديد مرحلة دورة الخلية. يمكن استخدام العلامات الفلورية لحلقات الميوسين والنوى وأجسام قطب المغزل (SPBs) لتحديد مرحلة دورة الخلية ، وقد تم دمجها في نموذج CLOCCS11 ؛ ومع ذلك ، لن يتم وصف هذه القياسات في هذا البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام مؤشر التقسيم كمدخل لنمذجة البيانات من S. pombe14. وبالتالي ، يمكن استخدام النموذج لتحليل دورة الخلية في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية ويمكن توسيعه.

CLOCCS هو نموذج حدودي يسمح بالاستدلال البايزي الكامل لمعلمات متعددة من بيانات الإدخال (على سبيل المثال ، النسبة المئوية للتبرعم ، محتوى الحمض النووي). تتضمن هذه المعلمات وقت الاسترداد من التزامن ، وطول فترة دورة الخلية (المقدرة بشكل منفصل للخلايا الأم والابنة) ، ومتوسط موضع دورة الخلية للخلايا في كل نقطة زمنية. تمثل هذه المعلمات سلوك الخلية المتوسطة في المجتمع ، مما يمكن الباحث من تعيين كل نقطة زمنية إلى موضع دورة الخلية معبرا عنه كنقطة شريان الحياة. يعتمد التحويل إلى نقاط شريان الحياة على معلمات CLOCCS lambda (λ) و mu0 (μ0)14,15. تتوافق المعلمة λ مع متوسط فترة دورة الخلية للخلايا الأم. ومع ذلك ، نظرا لتأخير الأم وابنتها14,15 ، فإن هذا ليس متوسط فترة دورة الخلية لجميع السكان الذين يشملون خلايا الأم وابنتها. بالإضافة إلى ذلك ، يستنتج CLOCCS المعلمة دلتا (δ) ، والتي تتوافق مع التأخير بين الأم وابنتها ، وبالتالي ، تسمح بحساب متوسط فترة دورة الخلية لجميع السكان. أخيرا ، نظرا لأن كل تجربة تبدأ بعد الإصدار من مزامنة دورة الخلية ، يتم تمثيل الوقت اللازم للاسترداد من طريقة المزامنة بواسطة معلمة CLOCCS μ0. يناسب CLOCCS نموذجا لبيانات مرحلة دورة الخلية المدخلة ثم يستنتج هذه المعلمات باستخدام خوارزمية سلسلة ماركوف مونت كارلو العشوائية14,15. من خلال تعيين تجارب متعددة إلى مقياس زمني مشترك لشريان حياة دورة الخلية ، يمكن إجراء مقارنات مباشرة خاصة بالطور بين النسخ المتماثلة أو التجارب التي لا يكون فيها وقت الاسترداد أو فترات دورة الخلية متطابقة8،14،15.

نظرا لأن السكان المتزامنين يفقدون التزامن بمعدل ما على مدار السلسلة الزمنية14،15،16،17 ، فإن التباين في معدل فقدان التزامن يمكن أن يعيق أيضا المقارنات الكمية عبر التجارب. من خلال تحديد موقع السكان والتباين في توزيعاتهم ، يمثل CLOCCS الاختلافات في معدلات فقدان التزامن. تسمح هذه الأداة القوية بإجراء مقارنات محددة ومفصلة عبر التجارب ، وبالتالي توفير القدرة على إجراء مقارنات ذات صلة مباشرة ليس فقط بين النسخ المتماثلة ولكن أيضا بين الظروف البيئية والطفرات وحتى الأنواع التي لها توقيت دورة خلية مختلف بشكل كبير14,15.

تصف هذه الورقة طريقة تستخدم CLOCCS لتقدير المعلمات عن طريق ملاءمة البيانات من تجارب السلاسل الزمنية المتزامنة / الإصدار ، وتعيين البيانات إلى مقياس شريان الحياة المشترك ، ثم إجراء مقارنات ذات صلة بين النسخ المتماثلة أو التجارب. تسمح محاذاة شريان الحياة بإجراء مقارنات مباشرة خاصة بالطور عبر هذه التجارب ، مما يسمح بتجميع ومقارنة النسخ المتماثلة وإجراء مقارنات أكثر صلة عبر التجارب ذات توقيتات الاسترداد المختلفة وفترات دورة الخلية.

Protocol

1. جمع مرحلة دورة الخلية والبيانات التجريبية

  1. قم بمزامنة الخلايا فيما يتعلق بدورة الخلية باستخدام طريقة التزامن المطلوبة (على سبيل المثال ، التطهير بالطرد المركزي كما هو موضح في Leman et al.18 أو تزاوج اعتقال الفرمون كما هو موضح في Rosebrock 19 ؛ يتضمن كل من Leman et al.18 و Rosebrock 19 أيضا طرقا للإفراج عن التزامن). ابدأ في أخذ العينات عبر السلسلة الزمنية ، مع التأكد من أن السلسلة الزمنية لا تقل عن فترتين كاملتين من دورة الخلية ، وعلى النحو الأمثل ، اجمع 10 عينات على الأقل لكل دورة خلية. في كل نقطة زمنية ، اجمع عينة لبيانات طور دورة الخلية (التبرعم أو قياس التدفق الخلوي) وعينة للبيانات التجريبية ، كما هو موضح أدناه.
  2. في حالة استخدام البيانات الناشئة كبيانات طور دورة الخلية ، اجمع البيانات حول التبرعم لمحاذاة CLOCCS.
    1. عينة طوال السلسلة الزمنية. لكل نقطة زمنية ، قم بجمع الخلايا وإصلاحها عن طريق خلط 200 ميكرولتر من ثقافة الخلايا الصوتية مع 200 ميكرولتر من المحلول المثبت ، كما هو موضح في Leman et al.18.
    2. بالنسبة للتبرعم القياسي ، عد ما لا يقل عن 200 خلية لكل نقطة زمنية باستخدام مجهر ضوئي مرسل بهدف 40x ومقياس دموي. أضف عينة الخلية من الخطوة 1.2.1 إلى مقياس الدم ، وقم بتخفيفها إذا كانت الكثافة تمنع العد. سجل عدد الخلايا الناشئة وغير المهدة في كل نقطة زمنية. احسب النسبة المئوية للخلايا الناشئة ، وارسم لكل نقطة زمنية في منحنى ناشئ.
      ملاحظة: تتوفر طرق أخرى لتحديد معلومات طور دورة الخلية ، ولكن لم يتم وصفها في هذا البروتوكول. تم وصف الطرق الأخرى في الملف التمهيدي CLOCCS وفي عمل سابق11.
  3. في حالة استخدام بيانات محتوى الحمض النووي للتدفق الخلوي كبيانات طور دورة الخلية ، اجمع بيانات تلطيخ الحمض النووي لقياس التدفق الخلوي لمحاذاة CLOCCS للتدفق الخلوي.
    1. عينة طوال السلسلة الزمنية. لكل نقطة زمنية ، اجمع الخلايا وقم بإصلاحها كما هو موضح في Haase و Reed20.
    2. تلطيخ الحمض النووي ، وتحليل باستخدام تحليل التدفق الخلوي القياسي. تم وصف بروتوكول التلوين الموصى به ل S. cerevisiae في Haase و Reed20.
  4. جمع omics المرتبطة أو البيانات التجريبية ذات الصلة. للحصول على بيانات النسخ القياسية ، اجمع كما هو موضح في Leman et al.18 و Kelliher et al.21,22. تأكد من أن البيانات مرتبطة بنقاط زمنية تحتوي على بيانات مرحلة دورة الخلية للسماح بمحاذاة المصب. لتحقيق المحاذاة المثلى، تأكد من أن كل نقطة زمنية تحتوي على بيانات تجريبية تحتوي أيضا على بيانات طور مرتبطة بها.
    ملاحظة: يمكن أن تتخذ البيانات التجريبية أشكالا عديدة. تقليديا ، نستخدم طريقة المحاذاة الموضحة لمحاذاة تجارب نسخ السلاسل الزمنية. ومع ذلك ، يمكن محاذاة أي نوع من البيانات المرتبطة بالنقاط الزمنية (أي البروتينات22).

2. تثبيت البرنامج المطلوب

ملاحظة: يفترض هذا القسم أن Conda وJava 19 وGit مثبتة بالفعل (جدول المواد).

  1. قم بتنزيل الريبو CLOCCS_alignment عن طريق إدخال الأمر التالي في الجهاز:
    استنساخ بوابة استنساخ https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
  2. قم بإنشاء بيئة Conda باستخدام ملف conda_req.yml عن طريق إدخال الأمر التالي في الجهاز في المجلد حيث تم استنساخ CLOCCS_alignment الريبو:
    Conda env create -f conda_req.yml

3. استخدام CLOCCS لتحديد معلمات التجارب

  1. انقر نقرا مزدوجا فوق الملف cloccs_v2023.jar في مجلد CLOCCS في الريبو CLOCCS_alignment ، وانتظر حتى يتم فتح واجهة مستخدم رسومية. تسمح هذه الشاشة بإدخال خيارات تشغيل CLOCCS وتعرض النتائج بمجرد تشغيلها.
  2. أدخل الإعدادات العامة.
    1. قم بتعيين Sim Anneal و Burn In والتكرارات عن طريق الكتابة في مربعات إدخال النص المرتبطة. يحدد Sim Anneal (التلدين المحاكي) قيم معلمات البدء الجيدة ، و Burn في عمليات البحث عن الأوضاع الخلفية ، وتسمح المرحلة النهائية باستخلاص جميع الاستدلالات الخلفية. تزيد القيم الأعلى من وقت التشغيل ولكنها تزيد أيضا من الدقة.
    2. أدخل الظروف التجريبية عن طريق تحديد درجة الحرارة بالدرجة المئوية وطريقة المزامنة باستخدام مربع النص المسمى درجة الحرارة والقائمة المنسدلة Synchro. الطريقة ، على التوالي.
    3. اختياريا قم بتكوين الإعدادات المتقدمة في قائمة الإعدادات المتقدمة. تسمح الإعدادات المتقدمة بتعيين المقدمات لكل معلمة من المعلمات ("mu0" ، "sigma0" ، "sigmav" ، "lambda" ، "bud.start" ، "bud.end").
      ملاحظة: يمكن العثور على مزيد من المعلومات حول الإعدادات المتقدمة في الملف التمهيدي.txt في مجلد CLOCCS في الريبو CLOCCS_alignment.
  3. أدخل الإعدادات للاستخدام مع البيانات الناشئة.
    1. اختر التحديد المناسب من القائمة المنسدلة نوع النموذج . الخيار الافتراضي Bud هو لمعلومات التبرعم القياسية للخميرة الناشئة.
      ملاحظة: توجد أيضا خيارات أخرى أكثر تقدما في القائمة المنسدلة: Mutant لمعلومات التبرعم للمتحولات التي تخضع لدورات تبرعم متعددة دون تقسيم ، و BudSSLSMR للحصول على معلومات ناشئة ومعلومات إضافية عن جسم عمود المغزل وحلقة الميوسين ، و BudNucDivNeck للحصول على معلومات ناشئة ومعلومات إضافية عن التقسيم ونوى عنق البراعم. تم وصف هذه الخيارات المتقدمة في الملف التمهيدي CLOCCS وفي العمل السابق11،14،15.
    2. قم باستيراد البيانات باستخدام لوحة استيراد البيانات عن طريق الكتابة في مربعات إدخال النص أو عن طريق تحميل ملف بالنقر فوق الزر تحديد ملف . يحدد العمود الأول النقاط الزمنية. يحدد العمودين المتبقيين البيانات الناشئة ويمكن أن يأخذا أيا من الخيارات التالية: عدد الخلايا غير المهدة (بدون برعم) أو عدد الخلايا الناشئة (برعم) أو إجمالي عدد الخلايا (الإجمالي).
  4. أدخل الإعدادات للاستخدام مع بيانات قياس التدفق الخلوي. لكل تجربة، قم بتشغيل الخطوة 3.3 أو الخطوة 3.4.
    ملاحظة: يمكن استخدام بيانات قياس التدفق الخلوي والبيانات الناشئة معا. على الرغم من أننا وصفنا سابقا تشغيلهامعا 15 ، بالنسبة لهذه الأداة ، يجب تشغيلها بشكل مستقل ثم مقارنتها.
    1. قم بتحويل ملفات .fcs إلى تنسيق إدخال CLOCCS الصحيح لقياس التدفق الخلوي باتباع الإرشادات الموجودة في الملف التكميلي 1 (الموجود أيضا في الريبو CLOCCS_alignment ك CLOCCS / flow_cytometry_conversion_instructions.txt).
    2. حدد تحديد التدفق من القائمة المنسدلة نوع النموذج .
    3. قم بإدراج البيانات باستخدام لوحة استيراد البيانات. انقر فوق تحديد ملف ، وحدد الملف الذي تم إنشاؤه في الخطوة 3.4.1.
    4. حدد النقاط الزمنية التي يجب أن يتم فيها رسم CLOCCS لقياس التدفق عن طريق تحديد النقاط الزمنية في المربع أوقات الملاءمة .
  5. بمجرد تحديد جميع المدخلات إما للتبرعم أو قياس التدفق الخلوي ، انقر فوق الزر "تطبيق" ، ثم انقر فوق الزر "عينة" أعلى الشاشة.
  6. اعرض المنحنى الناشئ أو مخططات قياس التدفق الخلوي مع الملاءمة المتوقعة عن طريق تحديد علامة التبويب الملاءمة المتوقعة . يتم فتح علامة التبويب هذه افتراضيا مباشرة بعد الخطوة السابقة.
  7. اعرض الرسوم البيانية للمعلمة لكل معلمة عن طريق تحديد علامة التبويب الرسوم البيانية للمعلمة ثم تحديد علامة التبويب الفرعية التي تتوافق مع المعلمة ذات الأهمية من الخيارات التالية: mu0 ، delta ، sigma0 ، sigmav ، lambda ، bud.start ، bud.end ، إلخ.
  8. اعرض مخطط النتيجة اللاحقة عن طريق تحديد علامة التبويب النتيجة اللاحقة .
  9. عرض الإعدادات ، وتغييرها بشكل أكبر عن طريق تحديد علامة التبويب الإعدادات ؛ اعرض سجل عمليات التشغيل السابقة عن طريق تحديد علامة التبويب سجل .
  10. احصل على معلمات CLOCCS من الملاءمة عن طريق تحديد علامة التبويب المعلمات الخلفية . سيكون للجدول الناتج الشكل التالي: يتكون كل صف من معلمة ، مع كون الصف الأخير هو الخلف. تتكون الأعمدة من المعلمة المتوقعة للمتوسط ، وفاصل الثقة الأقل بنسبة 2.5٪ ، وفاصل الثقة الأعلى بنسبة 97.5٪ ، ومعدل القبول.
    1. سجل المعلمات المستخدمة للمحاذاة لكل تجربة: وقت الاسترداد من التزامن (μ0) ومتوسط فترة دورة الخلية للخلايا الأم (λ).
    2. احسب فترة دورة الخلية عن طريق حساب متوسط فترة الخلية الأم (λ) وفترة الخلية الوليدة (λ + δ) ، حيث δ هو التأخير الخاص بالابنة.
      ملاحظة: كرر القسم 3 مع جميع التجارب المراد تضمينها في المقارنات.

4. تحويل النقاط الزمنية إلى نقاط شريان الحياة باستخدام وظائف تحويل Python ومعلمات CLOCCS

ملاحظة: يتطلب التحويل بين نقاط الوقت ونقاط شريان الحياة صيغتي تحويل21. يتوفر تطبيق Python للتحويل وتصور البيانات في الريبو CLOCCS_alignment والموضح أدناه.

  1. قم بتنشيط بيئة Conda عن طريق إدخال الأمر التالي في الجهاز: conda تنشيط CLOCCS_alignment
  2. افتح دفتر ملاحظات Python تفاعلي عن طريق كتابة الأمر التالي في الجهاز: دفتر ملاحظات jupyter
  3. قم بإنشاء دفتر ملاحظات Python جديد في المجلد المطلوب.
    ملاحظة: تم تضمين مثال دفتر ملاحظات لتوضيح الاستخدام القياسي ويمكن العثور عليه في Alignment/JOVE_example.ipynb في الريبو CLOCCS_ المحاذاة.
  4. قم باستيراد ملف Python الذي يحتوي على وظائف المحاذاة عن طريق تشغيل الأمر التالي في الخلية الأولى:
    ٪ تشغيل path_to_repo / cloccs_alignment / محاذاة / أدوات مساعدة.py
    1. استبدل المسار إلى الريبو CLOCCS_alignment ب path_to_repo.
  5. في حالة استخدام البيانات الناشئة كبيانات طور دورة الخلية، قم بإدراج إطار بيانات يحتوي على النسبة المئوية التي تم التبرع لها في كل نقطة زمنية عن طريق تشغيل الأمر التالي في خلية جديدة:
    budding_df = pd.read_csv("path_to_folder/budding_filename.tsv"، سبتمبر ="\t"، index_col=0)
    1. استبدل مسار الملف المناسب واسم الملف. إذا كان الملف ملف .csv، فقم بإزالة sep ="\t"
  6. في حالة استخدام البيانات الناشئة كبيانات طور دورة الخلية، قم بمحاذاة البيانات الناشئة إلى مقياس وقت نقطة الحياة عن طريق إدخال الوظيفة التالية في خلية جديدة:
    aligned_budding_df = df_conversion_from_parameters(budding_df ، النقاط الزمنية ، param_mu0 ، param_lambda)
    1. بالنسبة للنقاط الزمنية، استبدل قائمة بالنقاط الزمنية لتكون فهرس إطار بيانات budding_df.
    2. بالنسبة param_mu0 و param_lambda ، استبدل المعلمات المستفادة من CLOCCS الناشئة التي يتم تشغيلها في القسم 3 للتجربة.
  7. في حالة استخدام بيانات قياس التدفق الخلوي، قم باستيراد بيانات قياس التدفق الخلوي عن طريق تشغيل الأمر التالي في خلية جديدة:
    flow_samples = flow_cytometry_import(flow_input_folder)
    1. على flow_input_folder، استبدل المسار المناسب للمجلد الذي يحتوي على ملفات .fcs لقياس التدفق الخلوي.
  8. في حالة استخدام بيانات قياس التدفق الخلوي، قم بإنشاء جدول تحويل بين نقاط الوقت ونقاط شريان الحياة لكل تجربة عن طريق كتابة الأمر التالي في خلية جديدة:
    flow_converter = convert_tp_to_ll(النقاط الزمنية ، param_mu0 ، param_lambda)
    1. بالنسبة للنقاط الزمنية ، استبدل قائمة بالنقاط الزمنية من بيانات قياس التدفق الخلوي.
    2. بالنسبة param_mu0 و param_lambda ، استبدل المعلمات المستفادة من قياس التدفق الخلوي CLOCCS في القسم 3 للتجربة.
  9. قم باستيراد إطار البيانات الذي يحتوي على البيانات التجريبية إلى دفتر الملاحظات عن طريق تشغيل الأمر التالي في خلية جديدة:
    data_df = pd.read_csv("path_to_folder/exp_data_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
    1. استبدل مسار الملف المناسب واسم الملف. إذا كان الملف ملف .csv، فقم بإزالة sep ="\t".
      ملاحظة: يمكن القيام بذلك لأي بيانات جدولية. يجب أن تحتوي البيانات التجريبية ببساطة على النقاط الزمنية إما كأعمدة أو فهرس لإطار البيانات. يمكن العثور على أمثلة للبيانات في الريبو CLOCCS_alignment.
  10. قم بمحاذاة البيانات التجريبية إلى مقياس وقت نقطة شريان الحياة عن طريق إدخال الدالة التالية في خلية جديدة:
    lifeline_aligned_df = df_conversion_from_parameters(data_df ، النقاط الزمنية ، param_mu0 ، param_lambda ، الاستيفاء ، السفلي ، العلوي)
    1. بالنسبة للنقاط الزمنية، استبدل قائمة بالنقاط الزمنية كفهرس أو أعمدة data_df التجريبية من الخطوة السابقة.
    2. بالنسبة لعامي param_mu0 و param_lambda ، استبدل القيم التي تم الحصول عليها في القسم 3 من CLOCCS.
      ملاحظة: يمكن أن تأتي المعلمات من أي تشغيل CLOCCS يتم إجراؤه على أي من أنواع بيانات مرحلة دورة الخلية المقبولة.
    3. اختياريا، استبدل الاستيفاء ب True أو False، أو اتركه فارغا (الإعداد الافتراضي هو False).
      ملاحظة: عند التعيين إلى False، لن يتم استيفاء البيانات. عند التعيين إلى True، سيتم تقريب نقاط شريان الحياة واستكمالها لتعبئة القيم بين نقاط شريان الحياة، بحيث توجد نقطة لكل عدد صحيح في نطاق نقاط شريان الحياة. وهذا يسمح بإجراء مقارنة أفضل عبر مجموعات البيانات.
    4. اختياريا ، استبدل lower ll و upperll بقيم لا شيء أو عدد صحيح.
      ملاحظة: عند التعيين إلى بلا، يتم الاحتفاظ بكافة نقاط شريان الحياة بعد الاستيفاء. عند توفير الأعداد الصحيحة ، يؤدي ذلك إلى اقتطاع البيانات بحيث تتراوح نقاط شريان الحياة من الأدنى إلى الأعلى. يسمح هذا بالمقارنة عبر مجموعات البيانات مع سفلي أو علوي مختلف.
  11. قم بتنزيل مجموعة البيانات المحاذاة لشريان الحياة عن طريق إدخال الأمر التالي في خلية جديدة: lifeline_aligned_df.to_csv ("path_to_desired_location/name_of_file.tsv"، sep = "\t")
  12. كرر الخطوات 4.5-4.11 مع تضمين جميع التجارب في المقارنات.

5. مقارنة منحنيات التبرعم وبيانات قياس التدفق الخلوي

  1. ارسم المنحنيات الناشئة قبل المحاذاة باستخدام وظيفة الأدوات المساعدة Python عن طريق إدخال الأمر التالي في خلية جديدة:
    plot_budding_curves(list_of_budding_curves، list_for_legend = leg_list، point_type = str_type، العنوان = str_title)
    1. استبدل قائمة تحتوي على إطارات البيانات لجميع منحنيات التبرعم المرغوبة للتخطيط ل list_of_budding_curves- [bud_df1 ، bud_df2 ، bud_df3].
    2. استبدل قائمة التسميات بوسيلة الإيضاح - [التجربة 1 ، التجربة 2 ، المسوخ] leg_list إذا رغبت في ذلك. إذا لم يكن كذلك ، استبعد أو استبدل بلا.
    3. وقت بديل ل str_type.
    4. استبدل عنوان سلسلة مقارنة منحنيات التبرعم str_title إذا رغبت في ذلك. إذا لم يكن كذلك ، استبدل لا شيء ، أو استبعد.
  2. ارسم منحنيات الناشئ بعد المحاذاة باستخدام وظيفة أدوات Python المساعدة باتباع الإرشادات الواردة في الخطوة 5.1 ، ولكن مع استبدال قائمة منحنيات التبرعم المحاذية ب list_of_budding_curves وشريان الحياة point_type بدلا من الوقت.
  3. لرسم بيانات قياس التدفق الخلوي، ارسم البيانات المرتبطة من ملفات .fcs عند نقاط شريان الحياة المقابلة باستخدام المحول الذي تم إنشاؤه في الخطوة 4.8.
  4. قم بتحويل نقاط شريان الحياة إلى مرحلة دورة الخلية باستخدام جدول المحول (الجدول 1).
    ملاحظة: يمكن أيضا رسم ذلك باتباع الإرشادات الواردة في الخطوة 5.1 ، ولكن مع مرحلة point_type بدلا من الوقت.

6. مقارنة البيانات التجريبية

  1. حدد قائمة الجينات التي سيتم رسمها في الرسوم البيانية الخطية بناء على معلومات الأدبيات أو الجينات ذات الأهمية للبحث.
  2. استخدم plot_linegraph_comparison المتوفرة في ملف أدوات Python المساعدة لإجراء مقارنات الرسم البياني الخطي على إطار البيانات الأصلي أو المحاذي أو المحاذي والمحرف عن طريق كتابة الأمر التالي في خلية جديدة:
    plot_linegraph_comparison (list_of_dfs ، list_for_legend ، جيني ، point_type = str_type ، العنوان = str_title)
    1. استبدل قائمة بإطارات بيانات التجارب المراد مقارنتها ب list_of_dfs.
      ملاحظة: يمكن أن تكون إطارات البيانات غير محاذية أو محاذية; ومع ذلك ، يجب إدخال point_type المقابلة في الخطوة 6.2.4.
    2. استبدل قائمة بالعناوين لكل إطار بيانات بنفس ترتيب قائمة إطارات البيانات ل list_for_legend.
    3. استبدل قائمة بأسماء الجينات (التي يجب تضمينها في فهرس إطارات البيانات) ليتم رسمها للجينات.
    4. استبدل نوع النقطة ب str_type. استخدم شريان الحياة (الافتراضي هو مقياس نقطة شريان الحياة ) أو المرحلة (مقياس شريان الحياة لمرحلة دورة الخلية) لإطارات البيانات المحاذاة في الخطوة 6.2.1 أو الوقت لإطارات البيانات غير المحاذاة في الخطوة 6.2.1.
    5. استبدل عنوان سلسلة اختياري ب str_title.
  3. حدد قائمة الجينات المراد تضمينها في خريطة التمثيل اللوني باستخدام الأدبيات أو الخوارزميات لتحديد الجينات الدورية العليا.
    ملاحظة: لإجراء مقارنات مناسبة للخرائط الحرارية، ينبغي محاذاة البيانات واستكمالها وتعديلها حسب الجدول الزمني في الخطوة 2.6؛ يجب أن يكون لها نفس قيمة شريان الحياة في البداية والنهاية لكل تجربة.
    1. قم بتشغيل خوارزميات الدورية لتحديد الجينات الدوريةالعليا 23,24 ، أو استخدم الطرق البديلة المطلوبة لتحديد قائمة الجينات (أي نتائج الأدبيات).
    2. قم باستيراد ملف قائمة جينات .csv أو .tsv إلى دفتر الملاحظات باستخدام الأمر التالي في خلية جديدة:
      sort_df = pd.read_csv("path_to_folder/sorting_filename.tsv"، sep="\t"، index_col=0)
    3. استبدل مسار الملف المناسب واسم الملف. إذا كان الملف ملف .csv، فقم بإزالة sep="\t".
  4. استخدم الدالة المتوفرة plot_heatmap_comparison في ملف أدوات Python المساعدة لإجراء مقارنة خريطة حرارية على إطار البيانات المحاذي والمحرف والمحاذي للطور عن طريق كتابة الأمر التالي في خلية جديدة:
    plot_heatmap_comparison(list_of_dfs ، list_for_legend ، جيني ، العنوان = str_title)
    1. استبدل قائمة بإطارات البيانات المحاذاة للتجارب المراد مقارنتها ب list_of_dfs.
    2. استبدل قائمة بالعناوين لكل إطار بيانات بنفس ترتيب قائمة إطارات البيانات ل list_for_legend.
    3. استبدل قائمة بأسماء الجينات (التي يجب تضمينها في فهرس إطارات البيانات) ليتم رسمها للجينات.
    4. استبدل عنوان سلسلة اختياري ب str_title.
      ملاحظة: إطار البيانات الأول في القائمة هو الإطار الذي سيتم استخدامه لترتيب الجينات في خريطة الحرارة. سيتم ترتيب الجينات حسب الحد الأقصى في الفترة الأولى لإطار البيانات هذا ، وسيتم استخدام نفس الترتيب لإطارات البيانات اللاحقة في القائمة.

النتائج

تم تطبيق الخطوات الموضحة في البروتوكول أعلاه وفي سير العمل في الشكل 1 على خمس تجارب سلاسل زمنية متزامنة لدورة الخلية لإظهار مقارنتين تمثيليتين: بين النسخ المتماثلة بطرق تزامن مختلفة (فرمون التزاوج وشطف الطرد المركزي18) ومنصات التسلسل (تسلسل الحمض النووي الريب?...

Discussion

تقدم هذه الورقة طريقة لتقييم البيانات بشكل أكثر دقة وكمية من تجارب السلاسل الزمنية على مجموعات متزامنة من الخلايا. تستخدم الطريقة المعلمات المستفادة من CLOCCS ، وهو نموذج استدلال بايزي يستخدم بيانات مرحلة دورة الخلية المدخلة ، مثل البيانات الناشئة وبيانات محتوى الحمض النووي الخلوي المتدفق...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

تم دعم S. Campione و S. Haase بتمويل من المؤسسة الوطنية للعلوم (DMS-1839288) والمعاهد الوطنية للصحة (5R01GM126555). بالإضافة إلى ذلك ، يود المؤلفون أن يشكروا Huarui Zhou (جامعة ديوك) على تعليقاتهم على المخطوطة وعلى الاختبار التجريبي للبروتوكول. نشكر أيضا فرانسيس موتا (جامعة فلوريدا أتلانتيك) وجوشوا روبنسون على مساعدتهم في كود Java.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2x PBSFor Fixative Solution. Described in Leman 2014.
4% formaldehydeFor Fixative Solution.
100% EthanolFor flow cytometry fixation. Described in Haase 2002.
CLOCCShttps://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
Flow CytometerFor flow cytometry protocol.
Githttps://git-scm.com/
Java 19https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19
MicroscopeFor counting cells and buds.
Minicondahttps://docs.conda.io/en/latest/
Protease solutionFor flow cytometry protocol. Described in Haase 2002.
RNAse A solutionFor flow cytometry protocol. Described in Haase 2002.
SYTOX Green Nucleic Acid StainInvitrogenS7020For flow cytometry staining. Described in Haase 2002.
TrispH 7.5

References

  1. Tyers, M., Tokiwa, G., Futcher, B. Comparison of the Saccharomyces cerevisiae G1 cyclins: Cln3 may be an upstream activator of Cln1, Cln2 and other cyclins. EMBO Journal. 12 (5), 1955-1968 (1993).
  2. Schwob, E., Nasmyth, K. CLB5 and CLB6, a new pair of B cyclins involved in DNA replication in Saccharomyces cerevisiae. Genes and Development. 7, 1160-1175 (1993).
  3. Polymenis, M., Schmidt, E. V. Coupling of cell division to cell growth by translational control of the G1 cyclin CLN3 in yeast. Genes and Development. 11 (19), 2522-2531 (1997).
  4. Spellman, P. T., et al. Comprehensive identification of cell cycle-regulated genes of the yeast Saccharomyces cerevisiae by microarray hybridization. Molecular Biology of the Cell. 9 (12), 3273-3297 (1998).
  5. Cho, R. J., et al. A genome-wide transcriptional analysis of the mitotic cell cycle. Molecular Cell. 2 (1), 65-73 (1998).
  6. Bar-Joseph, Z. Analyzing time series gene expression data. Bioinformatics. 20 (16), 2493-2503 (2004).
  7. Pramila, T., Wu, W., Miles, S., Noble, W. S., Breeden, L. L. The Forkhead transcription factor Hcm1 regulates chromosome segregation genes and fills the S-phase gap in the transcriptional circuitry of the cell cycle. Genes and Development. 20 (16), 2266-2278 (2006).
  8. Orlando, D. A., et al. Global control of cell-cycle transcription by coupled CDK and network oscillators. Nature. 453 (7197), 944-947 (2008).
  9. Nash, R., Tokiwa, G., Anand, S., Erickson, K., Futcher, A. B. The WHI1+ gene of Saccharomyces cerevisiae tethers cell division to cell size and is a cyclin homolog. EMBO Journal. 7 (13), 4335-4346 (1988).
  10. Basco, R. D., Segal, M. D., Reed, S. I. Negative regulation of G1 and G2 by S-phase cyclins of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (9), 5030-5042 (1995).
  11. Mayhew, M. B., Robinson, J. W., Jung, B., Haase, S. B., Hartemink, A. J. A generalized model for multi-marker analysis of cell cycle progression in synchrony experiments. Bioinformatics. 27 (13), 295-303 (2011).
  12. Qu, Y., et al. Cell cycle inhibitor Whi5 records environmental information to coordinate growth and division in yeast. Cell Reports. 29 (4), 987-994 (2019).
  13. Di Talia, S., Skotheim, J. M., Bean, J. M., Siggia, E. D., Cross, F. R. The effects of molecular noise and size control on variability in the budding yeast cell cycle. Nature. 448 (7156), 947-951 (2007).
  14. Orlando, D. A., et al. A probabilistic model for cell cycle distributions in synchrony experiments. Cell Cycle. 6 (4), 478-488 (2007).
  15. Orlando, D. A., Iversen, E. S., Hartemink, A. J., Haase, S. B. A branching process model for flow cytometry and budding index measurements in cell synchrony experiments. Annals of Applied Statistics. 3 (4), 1521-1541 (2009).
  16. Duan, F., Zhang, H. Correcting the loss of cell-cycle synchrony in clustering analysis of microarray data using weights. Bioinformatics. 20 (11), 1766-1771 (2004).
  17. Darzynkiewicz, Z., Halicka, H. D., Zhao, H. Cell synchronization by inhibitors of DNA replication induces replication stress and DNA damage response: analysis by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 761, 85-96 (2011).
  18. Leman, A. R., Bristow, S. L., Haase, S. B. Analyzing transcription dynamics during the budding yeast cell cycle. Methods in Molecular Biology. 1170, 295-312 (2014).
  19. Rosebrock, A. P. Synchronization and arrest of the budding yeast cell cycle using chemical and genetic methods. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (1), (2017).
  20. Haase, S. B., Reed, S. I. Improved flow cytometric analysis of the budding yeast cell cycle. Cell Cycle. 1 (2), 132-136 (2002).
  21. Kelliher, C. M., Leman, A. R., Sierra, C. S., Haase, S. B. Investigating conservation of the cell-cycle-regulated transcriptional program in the fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. PLoS Genetics. 12 (12), e1006453 (2016).
  22. Kelliher, C. M., et al. Layers of regulation of cell-cycle gene expression in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2644-2655 (2018).
  23. Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: An efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. Journal of Biological Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
  24. Deckard, A., Anafi, R. C., Hogenesch, J. B., Haase, S. B., Harer, J. Design and analysis of large-scale biological rhythm studies: A comparison of algorithms for detecting periodic signals in biological data. Bioinformatics. 29 (24), 3174-3180 (2013).
  25. Smith, L. M., et al. An intrinsic oscillator drives the blood stage cycle of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Science. 368 (6492), 754-759 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 196

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved