교차 실험 비교를 위한 세포 주기 동기화 모델의 특성화 손실을 사용한 동기화된 시계열 데이터의 정렬

요약

동기화된 시계열 실험 분석의 한 가지 과제는 실험이 종종 동기 및 세포 주기 기간으로부터의 회복 기간이 다르다는 것입니다. 따라서 서로 다른 실험의 측정값을 집계하여 분석하거나 쉽게 비교할 수 없습니다. 여기에서는 단계별 비교가 가능하도록 실험을 정렬하는 방법을 설명합니다.

초록

세포 주기를 조사하는 것은 종종 세포가 세포 주기를 통과할 때 시계열로 다양한 매개변수를 측정하기 위해 세포 집단을 동기화하는 데 달려 있습니다. 그러나 유사한 조건에서도 반복 실험은 동기화에서 회복하고 세포 주기를 통과하는 데 필요한 시간의 차이를 나타내므로 각 시점에서 직접적인 비교가 불가능합니다. 실험 전반에 걸쳐 동적 측정을 비교하는 문제는 돌연변이 집단 또는 동기 회복 시간 및/또는 세포 주기 기간에 영향을 미치는 대체 성장 조건에서 악화됩니다.

우리는 이전에 세포의 동기 집단이 동기화에서 방출되고 세포 주기를 통해 진행되는 방식을 모니터링하는 CLOCCS(Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony)라는 파라메트릭 수학적 모델을 발표했습니다. 그런 다음 모델에서 학습된 매개 변수를 사용하여 동기화된 시계열 실험의 실험 시점을 정규화된 시간 척도(라이프라인 포인트)로 변환할 수 있습니다. lifeline scale은 실험 시작부터 경과 시간을 분 단위로 나타내는 대신 동기에서 세포 주기 진입까지의 진행을 나타내며 그 다음에는 세포 주기의 단계를 거칩니다. 라이프라인 포인트는 동기화된 모집단 내의 평균 세포 위상에 해당하기 때문에 이 정규화된 시간 척도를 통해 다양한 기간과 회복 시간을 가진 실험을 포함하여 실험 간에 직접 비교할 수 있습니다. 또한, 이 모델은 서로 다른 종(예: Saccharomyces cerevisiae 및 Schizosaccharomyces pombe) 간의 세포 주기 실험을 정렬하는 데 사용되어 세포 주기 측정을 직접 비교할 수 있어 진화적 유사점과 차이점을 밝힐 수 있습니다.

서문

세포주기가 진행됨에 따라 동기화된 세포 집단에 대한 시계열 측정은 세포주기 진행을 제어하는 메커니즘을 조사하기 위한 표준 방법입니다 1,2,3,4,5,6,7,8 . 동시성/릴리스 시계열 실험을 비교하는 기능은 이러한 동적 프로세스를 이해하는 데 매우 중요합니다. 결과를 확증하기 위해 반복 실험을 사용하면 결론의 재현성에 대한 신뢰도를 높일 수 있습니다. 또한 환경 조건, 돌연변이 간, 심지어 종 간의 비교를 통해 세포주기 조절에 대한 많은 새로운 통찰력을 발견 할 수 있습니다. 그러나 동시성으로부터의 회복 및 세포 주기 진행 속도의 실험 간 가변성은 복제물 간 또는 변경된 세포 주기 타이밍이 있는 실험 간에 시점 간 비교를 수행하는 능력을 손상시킵니다. 이러한 문제로 인해, 반복실험은 종종 전체 시계열(예: Spellman et ^al.4)에 포함되지 않습니다. 전체 시계열의 반복실험이 수집되면 데이터를 집계하여 분석할 수 없고 단일 반복이 분석에 사용되며 다른 반복실험은 종종 보충 수치로 강등됩니다(예: Orlando et ^al.8). 또한, 상이한 회복 또는 세포주기 진행 특성을 가진 실험 간의 비교는 어렵다. 관심 있는 사건과 세포 주기 랜드마크(예: 새싹 출현, S상 진입 또는 아나페이즈 시작) 사이의 더 작은 간격을 측정하면 이러한 랜드마크 이벤트를 추적하는 경우 오류를 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다 1,2,3,9,10,11,12. 그러나 미묘하지만 중요한 차이는 이러한 임시 방법을 사용하여 감지되지 않거나 가려질 수 있습니다. 마지막으로, 단일 세포 분석은 동기화나 정렬에 의존하지 않고 세포 주기 진행을 분석할 수 있지만¹³, 단일 세포 연구에서 대규모 측정은 어렵고 비용이 많이 들 수 있습니다.

이러한 어려움을 극복하기 위해 우리는 동기화된 집단^14,15에 대한 시계열 측정 분석을 돕기 위해 CLOCCS(Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony) 모델을 개발했습니다. CLOCCS는 동기화된 세포가 동기화에서 해제되고 세포 주기를 통해 진행될 때 세포 주기 단계 전반에 걸쳐 동기화된 세포의 분포를 설명하는 유연한 수학적 모델입니다. 분지 과정 프레임워크를 통해 모델은 S. cerevisiae에서 관찰된 바와 같이 분열 후 모녀 세포의 비대칭 특성을 설명할 수 있으며 S. pombe와 같이 핵분열로 분열하는 유기체에 여전히 유용합니다. 이 모델은 다양한 측정 유형 세트에서 입력을 받아 셀 주기 단계를 지정할 수 있습니다. 그것은 시간 경과에 따른 발아 세포의 백분율 측정을 포함하는 발아 세포주기 단계 데이터를 수집 할 수 있으며, 발아되지 않은 G1 단계^14,15 외부의 세포 수를 추정 할 수 있습니다. 이 모델은 또한 DNA 함량을 측정하는 유세포 분석 데이터를 수집할 수 있으므로 G1에서 S로, S에서 G2로, M에서 G1로 획기적인 전이를 평가할 수 있습니다¹⁵. 형광 형태학적 마커는 또한 세포 주기 단계를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 미오신 고리, 핵 및 방추극체(SPB)의 형광 표지는 세포 주기 단계를 결정하는 데 사용할 수 있으며 이들은 CLOCCS 모델¹¹에 통합되었습니다. 그러나 이러한 측정은 이 프로토콜에서 설명되지 않습니다. 또한, septation index는 S. pombe¹⁴의 모델링 데이터를 위한 입력으로 사용되었습니다. 따라서 이 모델은 다양한 유기체의 세포 주기 분석에 사용할 수 있으며 추가로 확장할 수 있습니다.

CLOCCS는 입력 데이터에서 여러 매개변수(예: 신진 비율, DNA 함량)의 전체 베이지안 추론을 허용하는 매개변수 모델입니다. 이러한 매개변수에는 동기화로부터의 회복 시간, 세포 주기 기간의 길이(모녀 세포에 대해 별도로 추정됨) 및 각 시점에서 세포의 평균 세포 주기 위치가 포함됩니다. 이러한 매개변수는 모집단에서 평균 세포의 행동을 나타내므로 연구자는 각 시점을 생명선 지점으로 표현된 세포 주기 위치에 매핑할 수 있습니다. 라이프라인 포인트로의 변환은 CLOCCS 매개변수 lambda(λ) 및 mu0(μ₀)^14,15에 따라 달라집니다. 파라미터 λ는 모세포의 평균 세포 주기 주기에 상응한다. 그러나, 모녀 지연(^14,15)으로 인해^, 이것은 모녀 세포 모두를 포함하는 전체 집단의 평균 세포주기 기간이 아니다. CLOCCS는 모녀 지연에 해당하는 매개변수 델타(δ)를 추가로 추론하므로 전체 집단의 평균 세포 주기 기간을 계산할 수 있습니다. 마지막으로, 각 실험은 셀 주기 동기화에서 해제된 후에 시작되기 때문에 동기화 방법에서 복구하는 데 필요한 시간은 CLOCCS 매개 변수_{μ 0}으로 표시됩니다. CLOCCS는 입력 셀 사이클 위상 데이터에 모델을 피팅한 다음 랜덤 워크 마르코프 체인 몬테카를로 알고리즘^14,15를 사용하여 이러한 매개변수를 추론합니다. 여러 실험을 공통 세포 주기 수명 주기 시간 척도에 매핑함으로써 회복 시간 또는 세포 주기 기간이 동일하지 않은 복제 또는 실험 간에 직접적인 단계별 비교를 수행할 수 있습니다 8,14,15.

동기화된 모집단이 시계열^14,15,16,17 동안 어느 정도 동기화성을 잃기 때문에 동기화 손실률의 변동성은 실험 전반에 걸친 정량적 비교를 방해할 수도 있습니다. CLOCCS는 모집단의 위치와 분포의 분산을 식별하여 동시성 손실률의 차이를 설명합니다. 이 강력한 도구는 실험 전반에 걸쳐 구체적이고 상세한 비교를 가능하게 하여 복제물 간뿐만 아니라 환경 조건, 돌연변이 및 심지어 세포 주기 타이밍이 크게 다른 종 간에도 관련 비교를 직접 수행할 수 있는 기능을 제공합니다^14,15.

이 논문에서는 CLOCCS를 사용하여 동기/릴리스 시계열 실험의 데이터를 피팅하여 매개변수를 추정하고, 데이터를 공통 라이프라인 척도에 매핑한 다음, 반복 또는 실험 간에 관련 비교를 수행하는 방법을 설명합니다. 라이프라인 정렬을 통해 이러한 실험에서 직접 상별 비교가 가능하므로 복제물의 집계 및 비교가 가능하며 회복 타이밍 및 세포 주기 기간이 다른 실험 간에 보다 관련성 높은 비교를 수행할 수 있습니다.

프로토콜

1. 세포주기 단계 및 실험 데이터 수집

1. 원하는 동기화 방법을 사용하여 세포 주기에 대해 세포를 동기화한다 (예를 들어, Leman et al.18에 기술된 바와 같은 원심 용출 또는 Rosebrock 19에 기술된 바와 같은 짝짓기 페로몬 정지; Leman et al.18 및 Rosebrock¹⁹ 둘 다 동기화로부터 방출하기 위한 방법을 포함한다). 시계열 전체에서 샘플링을 시작하여 시계열의 길이가 최소 2개의 전체 셀 주기 기간인지 확인하고 최적으로 셀 주기당 최소 10개의 샘플을 수집합니다. 각 시점에서 아래에 설명된 대로 세포 주기 단계 데이터(신진 또는 유세포 분석)를 위한 샘플과 실험 데이터를 위한 샘플을 수집합니다.
2. 신진 데이터를 세포 주기 단계 데이터로 사용하는 경우 CLOCCS 정렬을 위해 신진에 대한 데이터를 수집합니다.
   1. 시계열 전체에서 샘플링합니다. 각 시점에 대해 세포를 수집하고 Leman et ^al.18에 설명된 대로 200μL의 초음파 처리된 세포 배양액과 200μL의 고정 용액을 혼합하여 고정합니다.
   2. 표준 출아의 경우 40x 대물렌즈와 혈구계가 있는 투과광 현미경을 사용하여 시점당 최소 200개의 세포를 계산합니다. 세포 추가 amp1.2.1 단계의 le을 혈구계에 넣고 밀도가 계산을 방해하는 경우 희석합니다. 각 시점에서 싹이 트고 싹이 트지 않은 세포의 수를 기록합니다. 싹이 트는 세포의 백분율을 계산하고 싹이 트는 곡선의 각 시점에 대해 플로팅합니다.
      참고: 셀 사이클 단계 정보를 지정하는 다른 방법을 사용할 수 있지만 이 프로토콜에서는 설명하지 않습니다. 다른 방법은 CLOCCS readme 및 이전 작업¹¹에 설명되어 있습니다.
3. 유세포 분석 DNA 함량 데이터를 세포 주기 단계 데이터로 사용하는 경우 유세포 분석 CLOCCS 정렬을 위해 유세포 분석 DNA 염색 데이터를 수집합니다.
   1. 시계열 전체에서 샘플링합니다. 각 시점에 대해 세포를 수집하고 Haase 및 Reed²⁰에 설명된 대로 고정합니다.
   2. DNA를 염색하고 표준 유세포 분석을 사용하여 분석합니다. S. cerevisiae 에 대한 권장 염색 프로토콜은 Haase and Reed²⁰에 설명되어 있습니다.
4. 관련 오믹스 또는 관련 실험 데이터를 수집합니다. 표준 전사체 데이터의 경우 Leman et ^al.18 및 Kelliher et ^al.21,22에 설명된 대로 수집합니다. 다운스트림 정렬을 허용하기 위해 데이터가 셀 주기 단계 데이터를 포함하는 시점과 연관되어 있는지 확인합니다. 최적의 정렬을 위해 실험 데이터가 포함된 각 시점에 위상 데이터도 연결되어 있는지 확인하십시오.
   참고: 실험 데이터는 다양한 형태를 취할 수 있습니다. 전통적으로, 우리는 시계열 전사체 실험을 정렬하기 위해 설명된 정렬 방법을 사용합니다. 그러나, 시점들과 연관된 임의의 타입의 데이터가 정렬될 수 있다(즉, 프로테오믹스(proteomics,²²).

2. 필요한 소프트웨어 설치

참고: 이 섹션에서는 Conda, Java 19 및 Git이 이미 설치되어 있다고 가정합니다(재료 표).

1. 터미널에 다음 명령을 입력하여 CLOCCS_alignment 리포지토리를 다운로드합니다.
   자식 복제 자식 복제 https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
2. CLOCCS_alignment 리포지토리가 복제된 폴더의 터미널에 다음 명령을 입력하여 conda_req.yml 파일을 사용하여 Conda 환경을 만듭니다.
   conda env create -f conda_req.yml

3. CLOCCS를 사용하여 실험 매개 변수화

1. CLOCCS_alignment 리포지토리의 CLOCCS 폴더에 있는 cloccs_v2023.jar 파일을 두 번 클릭하고 그래픽 사용자 인터페이스가 열릴 때까지 기다립니다. 이 화면에서는 CLOCCS 실행에 대한 옵션을 입력할 수 있으며 실행 후 결과를 표시합니다.
2. 일반 설정을 입력합니다.
   1. Sim Anneal, Burn In 및 Iterations를 관련 텍스트 입력 상자에 입력하여 설정합니다. Sim Anneal(시뮬레이션 어닐링)은 양호한 시작 파라미터 값을 식별하고, Burn In은 후방 모드를 검색하며, 최종 단계에서는 모든 후방 추론을 도출할 수 있습니다. 값이 높을수록 실행 시간이 늘어나지만 정확도도 높아집니다.
   2. 온도를 섭씨로 지정하고 온도라고 표시된 텍스트 상자와 드롭다운 메뉴 Synchro를 사용하여 동기화 방법을 지정하여 실험 조건을 입력합니다. 방법, 각각.
   3. 선택적으로 Advanced Settings(고급 설정) 메뉴에서 고급 설정을 구성합니다. 고급 설정을 사용하면 각 매개변수("mu0", "sigma0", "sigmav", "lambda", "bud.start", "bud.end")에 대해 사전을 설정할 수 있습니다.
      참고: 고급 설정에 대한 자세한 내용은 CLOCCS_alignment 리포지토리의 CLOCCS 폴더에 있는 readme.txt 찾을 수 있습니다.
3. 시작 데이터에 사용할 설정을 입력합니다.
   1. 모델 유형 드롭다운 메뉴에서 적절한 선택 항목을 선택합니다. 기본 옵션 Bud는 출아 효모에 대한 표준 출아 정보를 위한 것입니다.
      참고: 드롭다운 메뉴에는 다른 고급 옵션도 있습니다: 분열 없이 여러 번의 출아 주기를 거치는 돌연변이에 대한 출아 정보를 위한 돌연변이, 출아 정보 및 추가 스핀들 폴 바디 및 미오신 고리 정보를 위한 BudSSLSMR, 출아 정보 및 추가 분할 및 새싹목 핵 정보를 위한 BudNucDivNeck. 이러한 고급 옵션은 CLOCCS readme 및 이전 작업^11,14,15에 설명되어 있습니다.
   2. 데이터 가져오기 패널을 사용하여 텍스트 입력 상자에 입력하거나 파일 선택 버튼을 클릭하여 파일을 업로드하여 데이터를 가져옵니다. 첫 번째 열은 시점을 지정합니다. 나머지 두 열은 새싹 데이터를 지정하며 새싹 제거되지 않은 셀 수(No Bud), 새싹 달린 셀 수(Bud) 또는 총 셀 수(Total) 옵션을 사용할 수 있습니다.
4. 유세포 분석 데이터와 함께 사용할 설정을 입력합니다. 각 실험에 대해 3.3 단계 또는 3.4단계를 실행합니다.
   참고: 유세포 분석 데이터와 신진 데이터를 함께 사용할 수 있습니다. 앞에서 함께 실행하는 것에 대해 설명했지만¹⁵, 이 도구의 경우 독립적으로 실행한 다음 비교해야 합니다.
   1. 보충 파일 1(CLOCCS_alignment 리포지토리에 CLOCCS/flow_cytometry_conversion_instructions.txt으로도 있음)의 지침에 따라 .fcs 파일을 유세포 분석을 위한 올바른 CLOCCS 입력 형식으로 변환합니다.
   2. 모델 유형(Model Type) 드롭다운 메뉴에서 흐름(Flow) 선택 항목을 선택합니다.
   3. 데이터 가져오기 패널을 사용하여 데이터를 가져옵니다. 파일 선택을 클릭하고 3.4.1단계에서 생성된 파일을 선택합니다.
   4. 피팅 횟수 상자에서 시점을 선택하여 유세포 분석 CLOCCS 피팅을 플로팅해야 하는 시점을 선택합니다.
5. 신진 또는 유세포 분석에 대한 모든 입력이 선택되면 적용 버튼을 클릭한 다음 화면 상단의 샘플 버튼을 클릭합니다.
6. Predicted Fits 탭을 선택하여 예측 적합치가 있는 신진 곡선 또는 유세포 분석 플롯을 봅니다. 이 탭은 기본적으로 이전 단계 직후에 열립니다.
7. 매개변수 히스토그램 탭을 선택한 다음 mu0, delta, sigma0, sigmav, lambda, bud.start, bud.end 등의 옵션에서 관심 있는 매개변수에 해당하는 하위 탭을 선택하여 각 매개변수에 대한 매개변수 히스토그램을 봅니다.
8. 사후 점수 탭을 선택하여 사후 점수 그림을 봅니다.
9. 설정을 보고 설정 탭을 선택하여 추가로 변경합니다. 로그 탭을 선택하여 이전 실행의 로그를 봅니다.
10. 사후 매개변수(Posterior Parameters) 탭을 선택하여 피팅에서 CLOCCS 매개변수를 가져옵니다. 결과 테이블은 다음과 같은 형식을 갖습니다. 각 행은 매개 변수로 구성되며 마지막 행은 사후입니다. 열은 평균에 대한 예측 모수, 2.5% 신뢰 구간 하한, 97.5% 상한 신뢰 구간 및 합격률로 구성됩니다.
    1. 각 실험에 대한 정렬에 사용된 파라미터, 즉 동기로부터의 회복 시간(μ₀) 및 모세포의 평균 세포 주기 기간(λ)을 기록합니다.
    2. 모세포 기간(λ)과 딸 세포 기간(λ+δ)의 평균을 계산하여 세포 주기 기간을 계산하며, 여기서 δ는 딸 특이적 지연입니다.
       참고: 비교에 포함할 모든 실험에 대해 섹션 3을 반복합니다.

4. Python 변환 함수 및 CLOCCS 매개 변수를 사용하여 시점을 라이프라인 점으로 변환

참고: 시점과 라이프라인 지점 간의 변환에는 두 개의 변환 공식⁽²¹)이 필요합니다. 변환 및 데이터 시각화를 위한 Python 구현은 CLOCCS_alignment 리포지토리에서 사용할 수 있으며 아래에 설명되어 있습니다.

1. 터미널에 conda activate 명령을 입력하여 Conda 환경을 활성화합니다CLOCCS_alignment
2. 터미널에 jupyter notebook 명령을 입력하여 대화형 Python Notebook을 엽니다.
3. 원하는 폴더에 새 Python Notebook을 만듭니다.
   참고: 표준 사용을 보여주기 위해 예제 Notebook이 포함되어 있으며 CLOCCS_ 맞춤 리포지토리의 Alignment/JOVE_example.ipynb에서 찾을 수 있습니다.
4. 첫 번째 셀에서 다음 명령을 실행하여 정렬 함수가 포함된 Python 파일을 가져옵니다.
   %run path_to_repo/cloccs_alignment/Alignment/utilities를 실행합니다.py
   1. CLOCCS_alignment 리포지토리의 경로를 path_to_repo로 대체합니다.
5. 신진 데이터를 셀 주기 단계 데이터로 사용하는 경우 새 셀에서 다음 명령을 실행하여 각 시점의 신진 비율이 포함된 데이터 프레임을 가져옵니다.
   budding_df = pd.read_csv("path_to_folder/budding_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
   1. 적절한 파일 경로와 파일 이름을 대체합니다. 파일이 .csv 파일인 경우 sep ="\t"를 제거하십시오.
6. 신진 데이터를 셀 주기 단계 데이터로 사용하는 경우, 새 셀에 다음 함수를 입력하여 신진 데이터를 라이프라인 포인트 시간 척도에 맞춥니다.
   aligned_budding_df = df_conversion_from_parameters(budding_df, 시점, param_mu0, param_lambda)
   1. 시점의 경우 시점 목록을 budding_df 데이터 프레임의 인덱스로 대체합니다.
   2. param_mu0 및 param_lambda의 경우 섹션 3의 신진 CLOCCS 실행에서 학습된 매개 변수를 실험으로 대체합니다.
7. 유세포 분석 데이터를 사용하는 경우 새 셀에서 다음 명령을 실행하여 유세포 분석 데이터를 가져옵니다.
   flow_samples = flow_cytometry_import(flow_input_folder)
   1. flow_input_folder의 경우 유세포 분석 .fcs 파일이 포함된 폴더의 적절한 경로로 대체합니다.
8. 유세포 분석 데이터를 사용하는 경우 새 셀에 다음 명령을 입력하여 각 실험의 시점과 수명선 지점 간의 변환표를 생성합니다.
   flow_converter = convert_tp_to_ll(시점, param_mu0, param_lambda)
   1. 시점의 경우 유세포 분석 데이터의 시점 목록으로 대체합니다.
   2. param_mu0 및 param_lambda의 경우 실험을 위해 섹션 3에서 CLOCCS가 실행한 유세포 분석에서 학습된 매개 변수로 대체합니다.
9. 새 셀에서 다음 명령을 실행하여 실험 데이터가 포함된 데이터 프레임을 Notebook으로 가져옵니다.
   data_df = pd.read_csv("path_to_folder/exp_data_filename.tsv", 9월 ="\t", index_col=0)
   1. 적절한 파일 경로와 파일 이름을 대체합니다. 파일이 .csv 파일인 경우 sep ="\t"를 제거하십시오.
      참고: 모든 테이블 형식 데이터에 대해 이 작업을 수행할 수 있습니다. 실험 데이터에는 단순히 시점이 데이터 프레임의 열 또는 인덱스로 있어야 합니다. 예제 데이터는 CLOCCS_alignment 리포지토리에서 찾을 수 있습니다.
10. 새 셀에 다음 함수를 입력하여 실험 데이터를 라이프라인 포인트 시간 척도에 맞춥니다.
    lifeline_aligned_df = df_conversion_from_parameters(data_df, 시점, param_mu0, param_lambda, 보간, 하한, 상위)
    1. 시점의 경우 시점 목록을 이전 단계의 실험 data_df 인덱스 또는 열로 대체합니다.
    2. param_mu0 및 param_lambda의 경우 CLOCCS에서 섹션 3에서 얻은 값을 대체합니다.
       참고: 매개 변수는 허용된 셀 주기 단계 데이터 형식 중 하나에서 수행된 모든 CLOCCS 실행에서 가져올 수 있습니다.
    3. 필요에 따라 보간을 True 또는 False로 대체하거나 비워 둡니다(기본값은 False).
       참고: False로 설정하면 데이터가 보간되지 않습니다. True로 설정하면 라이프라인 포인트가 반올림되고 보간되어 라이프라인 포인트 사이의 값을 채우므로 라이프라인 포인트 범위 내에 정수당 포인트가 있습니다. 이를 통해 데이터 세트 간에 더 나은 비교가 가능합니다.
    4. 필요에 따라 lowerll 및 upperll 을 None 또는 정수 값으로 대체합니다.
       참고: 없음으로 설정하면 보간 후의 모든 라이프라인 포인트가 유지됩니다. 정수가 제공되면 라이프라인 포인트의 범위가 lowerll 에서 upperll까지 데이터가 잘립니다. 이를 통해 다른 lowerll 또는 upperll을 사용하여 데이터 세트를 비교할 수 있습니다.
11. 새 셀에 lifeline_aligned_df.to_csv("path_to_desired_location/name_of_file.tsv", sep = "\t") 명령을 입력하여 라이프라인에 맞춰진 데이터셋을 다운로드합니다.
12. 비교에 포함할 모든 실험에 대해 4.5-4.11단계를 반복합니다.

5. 신진 곡선과 유세포 분석 데이터 비교

1. 새 셀에 다음 명령을 입력하여 Python 유틸리티 함수를 사용하여 정렬하기 전에 새싹 곡선을 플로팅합니다.
   plot_budding_curves(list_of_budding_curves, list_for_legend = leg_list, point_type = str_type, 제목 = str_title)
   1. 원하는 모든 새싹 곡선의 데이터 프레임이 포함된 목록을 list_of_budding_curves-[bud_df1, bud_df2, bud_df3]에 대한 플로팅으로 대체합니다.
   2. 원하는 경우 범례-[실험 1, 실험 2, 돌연변이]의 레이블 목록을 leg_list로 대체합니다. 그렇지 않은 경우 None을 제외하거나 대체합니다.
   3. str_type 시간을 대체하십시오.
   4. 원하는 경우 문자열 제목 Comparison Budding Curves 를 str_title로 대체합니다. 그렇지 않은 경우 None을 대체하거나 제외합니다.
2. 5.1단계의 지침에 따라 Python 유틸리티 함수를 사용하여 정렬 후 신진 곡선을 플로팅하되, list_of_budding_curves 대신 정렬된 신진 곡선 목록을 사용하고 시간 대신 point_type 라이프라인을 사용하여 플로팅합니다.
3. 유세포 분석 데이터를 플로팅하려면 4.8단계에서 생성된 변환기를 사용하여 해당 라이프라인 포인트에 .fcs 파일의 관련 데이터를 플로팅합니다.
4. 변환기 테이블을 사용하여 라이프라인 포인트를 셀 주기 단계로 변환합니다(표 1).
   참고: 5.1단계의 지침에 따라 그릴 수도 있지만 시간 대신 point_type 단계를 사용합니다.

6. 실험 데이터 비교

1. 문헌 정보 또는 연구에 관심 있는 유전자를 기반으로 선 그래프에 표시할 유전자 목록을 결정합니다.
2. Python 유틸리티 파일에 제공된 plot_linegraph_comparison 사용하여 새 셀에 다음 명령을 입력하여 원본, 정렬 또는 정렬 및 보간된 데이터 프레임에 대해 선 그래프 비교를 수행합니다.
   plot_linegraph_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, 유전자 목록, point_type = str_type, 제목 = str_title)
   1. list_of_dfs 위해 비교할 실험의 데이터 프레임 목록을 대체합니다.
      참고: 데이터 프레임은 정렬되지 않거나 정렬될 수 있습니다. 그러나 해당 point_type 6.2.4단계에서 입력해야 합니다.
   2. list_for_legend에 대한 데이터 프레임 목록과 동일한 순서로 각 데이터 프레임의 제목 목록을 대체합니다.
   3. 유전자 목록에 대해 플롯할 유전자 이름 목록(데이터 프레임의 인덱스에 포함되어야 함)을 대체합니다.
   4. str_type 포인트 유형을 대체합니다. 6.2.1단계에서 정렬된 데이터 프레임에 대해 수명선 (기본값은 수명줄 포인트 스케일) 또는 위상 (셀 주기 단계 라이프라인 스케일)을 사용하거나 6.2.1단계에서 정렬되지 않은 데이터 프레임에 대해 시간을 사용하십시오.
   5. str_title 대신 선택적 문자열 제목을 사용합니다.
3. 상위 주기적 유전자를 결정하기 위해 문헌 또는 알고리즘을 사용하여 히트맵에 포함될 유전자 목록을 결정합니다.
   참고: 적절한 히트맵 비교를 위해 6.2단계에서 데이터를 정렬, 보간 및 시간 척도 조정해야 합니다. 각 실험에 대해 동일한 시작 및 종료 수명줄 값을 가져야 합니다.
   1. 주기성 알고리즘을 실행하여 상위 주기적 유전자(^23,24)를 결정하거나 원하는 대체 방법을 사용하여 유전자 목록(즉^, 문헌 결과)을 결정합니다.
   2. 새 셀에서 다음 명령을 사용하여 .csv 또는 .tsv 유전자 목록 파일을 Notebook으로 가져옵니다.
      sort_df = pd.read_csv("path_to_folder/sorting_filename.tsv", sep="\t", index_col=0)
   3. 적절한 파일 경로와 파일 이름을 대체합니다. 파일이 .csv 파일인 경우 sep="\t"를 제거합니다.
4. Python 유틸리티 파일에 제공된 함수 plot_heatmap_comparison 사용하여 새 셀에 다음 명령을 입력하여 정렬, 보간 및 위상 정렬 데이터 프레임에 대한 히트맵 비교를 수행합니다.
   plot_heatmap_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, 유전자 목록, 제목 = str_title)
   1. list_of_dfs 비교하기 위해 실험의 정렬된 데이터 프레임 목록을 대체합니다.
   2. list_for_legend에 대한 데이터 프레임 목록과 동일한 순서로 각 데이터 프레임의 제목 목록을 대체합니다.
   3. 유전자 목록에 대해 플롯할 유전자 이름 목록(데이터 프레임의 인덱스에 포함되어야 함)을 대체합니다.
   4. str_title 대신 선택적 문자열 제목을 사용합니다.
      참고: 목록의 첫 번째 데이터 프레임은 히트맵에서 유전자를 정렬하는 데 사용되는 데이터 프레임입니다. 유전자는 해당 데이터 프레임의 첫 번째 기간의 최대값으로 정렬되며 목록의 후속 데이터 프레임에 동일한 순서가 사용됩니다.

결과

위의 프로토콜과 그림 1 의 워크플로우에 설명된 단계를 5개의 세포 주기 동기화 시계열 실험에 적용하여 서로 다른 동기화 방법(짝짓기 페로몬 및 원심 용출¹⁸)을 사용한 복제물과 염기서열 분석 플랫폼(RNA 시퀀싱[RNA-seq] 및 마이크로어레이) 간의 두 가지 대표적인 비교를 입증했습니다. S. cerevisiae를 사용하여 여러 실험을 수행하고, 각 실험에 대해 ?...

토론

이 논문은 동기화된 세포 집단에 대한 시계열 실험의 데이터를 보다 정확하고 정량적으로 평가하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 각 실험을 파라미터화하기 위해 신진 데이터 및 유세포 분석 DNA 함량 데이터와 같은 입력 세포 주기 단계 데이터를 사용하는 베이지안 추론 모델인 CLOCCS에서 학습된 매개변수를 활용합니다^(14,15). CLOCCS는 입력 세포 주기 단...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2x PBS			For Fixative Solution. Described in Leman 2014.
4% formaldehyde			For Fixative Solution.
100% Ethanol			For flow cytometry fixation. Described in Haase 2002.
CLOCCS			https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
Flow Cytometer			For flow cytometry protocol.
Git			https://git-scm.com/
Java 19			https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19
Microscope			For counting cells and buds.
Miniconda			https://docs.conda.io/en/latest/
Protease solution			For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002.
RNAse A solution			For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002.
SYTOX Green Nucleic Acid Stain	Invitrogen	S7020	For flow cytometry staining. Described in Haase 2002.
Tris			pH 7.5