JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يستخدم مشبك ارتفاع السكر في الدم لقياس إطلاق الأنسولين مع الحفاظ على تركيز أعلى من الجلوكوز في الدم. المشبك الخافض لسكر الدم هو لقياس إنتاج الجلوكوز الناجم عن الاستجابات المضادة للتنظيم. كلتا الطريقتين تستخدمان نفس الإجراء الجراحي. هنا ، نقدم تقنية المشبك لتقييم استقلاب الجلوكوز الجهازي.

Abstract

يحدث داء السكري (DM) بسبب عدم كفاية إفراز الأنسولين من خلايا β البنكرياس (النوع 1 DM) وحساسية الأنسولين في العضلات والكبد والأنسجة الدهنية (النوع 2 DM). يعالج حقن الأنسولين مرضى DM ولكنه يؤدي إلى نقص السكر في الدم كأثر جانبي. يتم إطلاق الكورتيزول والكاتيكولامينات لتنشيط إنتاج الجلوكوز من الكبد لاستعادة نقص السكر في الدم ، وتسمى الاستجابات التنظيمية المضادة (CRR). في أبحاث DM باستخدام نماذج القوارض ، يتم استخدام اختبارات تحمل الجلوكوز وحقن الجلوكوز 2-deoxy-glucose لقياس إطلاق الأنسولين و CRR ، على التوالي. ومع ذلك ، تتغير تركيزات الجلوكوز في الدم باستمرار أثناء التجارب ، مما يسبب صعوبات في تقييم صافي إفراز الأنسولين و CRR. توضح هذه المقالة طريقة يتم فيها الاحتفاظ بجلوكوز الدم عند 250 مجم / ديسيلتر أو 50 مجم / ديسيلتر في الفئران الواعية لمقارنة إفراز هرمونات الأنسولين و CRR ، على التوالي.

يتم زرع أنابيب البولي إيثيلين في الشريان السباتي للفئران والوريد الوداجي ، ويسمح للفئران بالتعافي من الجراحة. يتم توصيل أنبوب الوريد الوداجي بحقنة هاملتون بمضخة حقنة لتمكين ضخ الأنسولين أو الجلوكوز بمعدل ثابت ومتغير. أنبوب الشريان السباتي مخصص لجمع الدم. بالنسبة لمشبك ارتفاع السكر في الدم ، يتم غرس الجلوكوز بنسبة 30٪ في الوريد ، ويتم قياس مستويات الجلوكوز في الدم من الدم الشرياني كل 5 دقائق أو 10 دقائق. يتم زيادة معدل ضخ الجلوكوز بنسبة 30٪ حتى يصبح مستوى الجلوكوز في الدم 250 مجم / ديسيلتر. يتم جمع الدم لقياس تركيزات الأنسولين. بالنسبة لمشبك سكر الدم ، يتم حقن 10 mU / kg / min من الأنسولين مع 30٪ جلوكوز ، والذي يكون معدل ضخه متغيرا للحفاظ على 50 مجم / ديسيلتر من مستوى الجلوكوز في الدم. يتم جمع الدم لقياس الهرمونات المضادة للتنظيم عندما يصل كل من ضخ الجلوكوز والجلوكوز في الدم إلى حالة مستقرة. كل من المشابك ارتفاع السكر في الدم وسكر الدم لها نفس الإجراء الجراحي والإعدادات التجريبية. وبالتالي ، فإن هذه الطريقة مفيدة للباحثين في استقلاب الجلوكوز الجهازي.

Introduction

الجلوكوز هو مصدر مهم للطاقة للخلايا ، ويمكن أن يؤدي نقص الجلوكوز إلى مجموعة متنوعة من الأعراض والمضاعفات. في حالة انخفاض الجلوكوز (نقص السكر في الدم ، بشكل عام أقل من 70 مجم / ديسيلتر في مستوى الجلوكوز في الدم الصائم ، ولكن لا ينبغي تحديده بقيمة واحدة1) ، تشمل الأعراض الأكثر شيوعا الضعف والارتباك والتعرق والصداع. يمكن أن يعطل أيضا وظيفة الدماغ ويزيد من خطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدمويةوالوفيات 2. على العكس من ذلك ، فإن ارتفاع السكر في الدم هو حالة طبية يتجاوز فيها تركيز الجلوكوز في البلازما المستويات الطبيعية (بشكل عام > 126 مجم / ديسيلتر في مستوى الجلوكوز في الدم الصائم3). يمكن أن يحدث هذا في الأفراد المصابين بداء السكري الذين يعانون من عجز في إنتاج الأنسولين أو استخدامه. يمكن أن يؤدي ارتفاع السكر في الدم إلى الحماض الكيتوني السكري ، والذي يحدث عندما لا يستطيع الجسم استخدام الجلوكوز للحصول على الطاقة ولكن بدلا من ذلك يكسر الأحماض الدهنية للحصول على الوقود. حالة فرط الأسمولية ارتفاع السكر في الدم تزيد أيضا من معدل الوفيات4. يمكن أن يتسبب ارتفاع السكر في الدم على المدى الطويل في تلف الأوعية الدموية والأعصاب والأعضاء ، مما يؤدي إلى تطور العديد من المضاعفات المزمنة مثل أمراض القلب والأوعية الدموية واعتلال الشبكية وأمراض الكلى. وبالتالي ، يجب الحفاظ على تركيز الجلوكوز في الدم في نطاق ضيق بين 100 ملغ / ديسيلتر و 120 ملغ / ديسيلتر.

يتم تنظيم نسبة الجلوكوز في الدم من خلال التوازن بين مدخلات ومخرجات الجلوكوز في نموذج حجرة واحدة (الشكل 1 أ). يتضمن مدخل الجلوكوز الجلوكوز الممتص من الطعام وإنتاج الجلوكوز من الكبد والكلى والأمعاء الدقيقة. يشمل إنتاج الجلوكوز امتصاص الجلوكوز في الأنسجة والتخلص من الجلوكوز من الكلى. يتم تنظيم كل من كمية مدخلات الجلوكوز ومخرجاته بواسطة هرمونات الغدد الصماء. على سبيل المثال ، يتم إطلاق الجلوكاجون والكورتيكوستيرون والكاتيكولامينات ، والمعروفة باسم الهرمونات المضادة للتنظيم ، عندما تنخفض مستويات الجلوكوز في الدم5. أنها تحفز انهيار الجليكوجين وتوليف الجلوكوز ، وخاصة من الكبد. تعرف هذه العمليات باسم تحلل الجليكوجين وتكوين الجلوكوز ، على التوالي. يزيد ارتفاع السكر في الدم من إفراز الأنسولين من خلايا β البنكرياس ويحفز امتصاص الجلوكوز في العضلات والأنسجة الدهنية والقلب6،7،8،9. تزيد التمارين من امتصاص الجلوكوز المستقل عن الأنسولين10. يزيد الجهاز العصبي الودي من امتصاص الجلوكوز في العضلات والأنسجة الدهنية البنية 6,11. لقياس القدرة على تنظيم استقلاب الجلوكوز في الأنسجة المحيطية ، يستخدم الباحثون عادة اختبار تحمل الجلوكوز (GTT) واختبار تحمل الأنسولين (ITT) (الشكل 1B ، C). في GTT ، يجب مراعاة عاملين: إطلاق الأنسولين وحساسية الأنسولين (الشكل 1B). ومع ذلك ، يختلف منحنى تركيز الجلوكوز خلال اختبار 120 دقيقة في كل فأر ، مما قد يؤثر على كميات مختلفة من إفراز الهرمونات. في ITT ، يتم تنظيم نسبة الجلوكوز في الدم عن طريق كل من حساسية الأنسولين وإطلاق الهرمونات المضادة للتنظيم. لذلك ، من الصعب تحديد المعنى الدقيق لاستقلاب الجلوكوز ، وإطلاق الأنسولين ، وحساسية الأنسولين في GTT و ITT ، في الحالات التي تكون فيها مستويات الجلوكوز في الدم غير ثابتة.

للتغلب على هذه المشاكل ، من المستحسن الحفاظ على نسبة الجلوكوز في الدم عند مستوى ثابت (أو "المشبك"). في مشبك ارتفاع السكر في الدم ، يتم ضخ الجلوكوز في مجرى الدم لرفع مستويات الجلوكوز في الدم إلى مستوى معين ثم يتم الحفاظ عليه عند هذا المستوى لفترة من الزمن. يتم ضبط كمية الجلوكوز المملوءة بناء على قياسات مستويات الجلوكوز في الدم كل 5-10 دقائق للحفاظ على حالة مستقرة. هذه التقنية مفيدة بشكل خاص لفهم معلمات إفراز الأنسولين عند مستوى الجلوكوز المثبت. مشبك سكر الدم هو وسيلة للحفاظ على مستويات منخفضة من الجلوكوز في الدم عن طريق ضخ الأنسولين. يتم غرس الجلوكوز بمعدل متغير للحفاظ على مستوى معين من الجلوكوز في الدم. إذا لم يستطع الفأر التعافي من نقص السكر في الدم ، فيجب ضخ المزيد من الجلوكوز.

على الرغم من وجود العديد من المزايا لأداء مشابك ارتفاع السكر في الدم وسكر الدم ، إلا أن الإجراءات الجراحية والتجريبية تعتبر صعبة من الناحية الفنية. وبالتالي ، لم يتمكن سوى عدد قليل من المجموعات البحثية من القيام بها. كنا نهدف إلى وصف هذه الأساليب للباحثين الذين يعانون من قيود مالية وقوى عاملة لبدء هذه التجارب بميزانية أقل.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) في جامعة كوماموتو.

ملاحظة: لتخفيف الألم ، تم إعطاء الإيبوبروفين في مياه الشرب (0.11 مجم / مل) لمدة 48 ساعة ، وتم إعطاء البوبرينورفين (0.05-0.1 مجم / كجم i.p.) قبل 30 دقيقة من الجراحة. تشمل الظروف المعقمة القفازات والأقنعة وأدوات التعقيم المعقمة بأكسيد الإيثيلين بين. تم إجراء الجراحة على وسادة تدفئة محددة عند 37 درجة مئوية ومغطاة بسجادة مختبر جديدة لكل. قبل الجراحة ، تم تنظيف المنطقة الجراحية بمحلول بيتادين والكحول. تم تعقيم جميع الأدوات الجراحية باستخدام الأوتوكلاف (لمدة لا تزيد عن عمليتين جراحيتين). قبل إجراء الشق ، تم فحص الفئران للتأكد من تخديرها بالكامل. تم تقييم عمق التخدير لكل فأر قبل وأثناء الجراحة بواسطة قرصة إصبع القدم. لم تكن فترة التأقلم أكثر من 5 دقائق في كل مرة. اتبع تعليمات IACUC في المؤسسة المعنية.

1. إعداد الأنابيب للوريد الوداجي والشريان السباتي

  1. تعقيم جميع الأنابيب ومستلزمات البولي بروبلين (على سبيل المثال ، أطراف الماصة) والخيوط باستخدام الأوتوكلاف أو أكسيد الإيثيلين. بالنسبة للوريد الوداجي ، قم بتوصيل 8 سم من الأنابيب 1 (انظر المواد) و 3 سم من الأنابيب 2 باستخدام الغراء (الشكل 2A). ضع 2 مم من الأنابيب 1 في الأعلى لأن الأنبوب 2 (البولي إيثيلين) شديد الصلابة وقد يتلف الأوعية الدموية (الأنبوب 1.1).
  2. أنبوب تمديد للوريد الوداجي (Tubing1.2) لضخ الجلوكوز والأنسولين
    1. قم بإعداد أنبوبين مقاس 30 سم وأنبوب واحد 10 سم مع أنبوب2 (الشكل 2 أ). اقطع الطرف الحاد لطرف ماصة سعة 20 ميكرولتر (أو أي شيء له طرف ضيق مع OD < 0.5 مم للاتصال بالأنبوب 1.1) وضع ثلاثة أنابيب 2 (30 سم و 30 سم و 10 سم) معا فيه. ختم مع الغراء لاصقة.
    2. ضع 5 سم من الأنبوب1 في الطرف الآخر من الأنبوب2.
  3. للشريان السباتي (Tubing1.3): أنبوب مطاطي2 لجعله أرق. قم بتوصيل 8 سم من الأنابيب 1 و 3 سم من الأنبوب الممتد 2 باستخدام الغراء (الشكل 2 أ). ضع علامة على 9 مم من الحافة.
  4. إبرة ذات نهاية غير حادة تربط الأنبوب بالمحقنة: قم بعمل خدش بالقرب من الطرف الحاد للإبرة (23 جم) بملف معدني ، وقم بثنيها برفق ذهابا وإيابا عدة مرات باستخدام كماشة ، وكسرها. قم بنفس القطع في منتصف الإبرة لعمل قطعة من الموصل المعدني (الشكل 2 أ).
  5. أنبوب تمديد للشريان لسحب الدم (مجموعة الأنابيب 1.4): قم بتوصيل 10 سم من الأنبوب 1 بالموصل المعدني والإبرة غير الحادة التي تم إجراؤها في الخطوة 1.4.
    ملاحظة: يتم تعقيم جميع الأنابيب والخيوط باستخدام الأوتوكلاف أو أكسيد الإيثيلين

2. الجراحة

  1. تخدير الفأر بالإيزوفلوران (1.5-2.0٪) أو الكيتامين / الزيلازين (الكيتامين 10 مجم / مل ، زيلازين 1 مجم / مل في محلول ملحي معقم 0.9٪ ، 0.1 مل / 10 جم من وزن الجسم (BW) عن طريق الحقن داخل الصفاق [ip]). احتفظ بالماوس على الوسادة الدافئة (37 درجة مئوية) لتقليل الضغط البدني. انتظر التخدير العميق لمدة 5-10 دقائق. تأكد من عمق التخدير عن طريق منعكس الدواسة والتنفس ومعدل ضربات القلب والاستجابة للمنبهات عن طريق قرص إصبع القدم. أثناء الجراحة ، يجب استخدام الشريط الجراحي لتثبيت غطاء الأنف على طاولة العمليات لاستنشاق التخدير المستمر. ضع مرهم العيون على العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
  2. املأ محلول ملحي هيبارين (100 وحدة / مل) في الأنابيب 1.1 و 1.3 وقم بتوصيلها بحقنة سعة 1 مل بإبرة غير حادة (الشكل 2 ب). أغلق نهاية الأنبوب3 (انظر جدول المواد) عن طريق صهره بمكواة لحام ، والتي سيتم استخدامها كأغطية للأنابيب 1.1 والأنابيب 1.3.
  3. حلق وامسح منطقة الشق الأولى (بين الكتفين على الظهر) والثانية (الرقبة في الأمام) بثلاث دورات من 10٪ بيتادين متبوعة بتحضير ما قبل الجراحة مع كحول معقم بنسبة 70٪. جعل شق خط الوسط عمودي صغير 5 مم رأسي إلى القص ، وتشريح الأنسجة حادة ، وفضح الشريان. افصل العصب المبهم عن الشريان. هذا يقلل من الآثار السلبية لإزالة العصب المبهم على استقلاب الجلوكوز.
    ملاحظة: يتم إجراء الخطوة من الشق البطني إلى الخطوة التي يتم فيها إدخال القسطرة في الوريد وتثبيتها بخيوط حريرية تحت المجهر.
  4. ضع اثنين من خيوط الحرير تحت الشريان. أوقف تدفق الدم عن طريق ربط خيط واحد بإحكام على جانب الجمجمة (الشكل 2C-1) والآخر بشكل فضفاض على الجانب الذيلي (الشكل 2C-2) ، وهو ما يكفي لوقف تدفق الدم ولكنه يكفي لفتحه مرة أخرى لاحقا. ضع خيطا آخر تحت الشريان (الشكل 2C-3).
  5. قطع الشريان بالقرب من الشكل 2C-1 بمقص الربيع ووضع الأنابيب 1.3 في الشريان. قم بعمل ربطة عنق فضفاضة على كل من الشريان والأنبوب (الشكل 2C-3 ، لا تربط بإحكام. سيتم إدخال الأنبوب بشكل أعمق في الشريان). افتح العقدة على الجانب الذيلي (الشكل 2C-2) لإدخال الأنبوب حتى تصل علامة 9 مم إلى العقدة في المنتصف (الشكل 2C-3). اربط جميع الأربطة بإحكام واغسلها بمحلول ملحي معقم بالهيبارين.
  6. كشف الوريد الوداجي الأيمن من نفس شق الشريان السباتي الأيمن للقسطرة الوداجية. اعزل نهاية الجمجمة واربطها بخياطة حريرية (الشكل 2D-1 ، جدول المواد). ضع قطعة أخرى من الخيط في الطرف الذيلي للوريد المكشوف (الشكل 2D-2). قطع الوريد بالقرب من العلامة الشكل 2D-1 بمقص الربيع.
  7. أدخل القسطرة (ليست عميقة جدا لمنع اختراق الأوعية) ، واربطها ، وتأكد بصريا من أنها عينات من الدم. اغسل بمحلول ملحي معقم من الهيبارين (0.2 مل) وتأكد بصريا من عدم بقاء دم في القسطرة.
  8. ضع الفأر على الستارة الجراحية المعقمة الجديدة لمنع العدوى من الجرح الأول. اقلب الماوس ، وامسحه بثلاث دورات من البيتادين متبوعا بإعداد ما قبل الجراحة بالكحول المعقم ، وقم بعمل شق صغير بين شفرات الكتف.
  9. مرر حامل إبرة تحت الجلد من شق الظهر إلى الجانب البطني. قم بتثبيت القسطرة بحامل الإبرة ، وقم بتمريرها تحت الجلد ، وأعدها. نظف موقع الشق وأغلق الشقوق البطنية بخياطة اصطناعية (قطرها 0.15-0.2 مم). قم بتثبيت القسطرة الوريدية باستخدام micro serrefine في موقع الشق بين لوحي الكتف.
  10. قطع القسطرة 1 سم فوق المشبك ، وغسلها بمحلول ملحي هيبارين ، وإغلاقها بغطاء (الخطوة 2.4). اتبع نفس الإجراء للقسطرة الشريانية. أغلق الشق الظهري بخياطة اصطناعية (قطرها 0.15-0.2 مم).
  11. ضع الماوس في قفص دافئ ونظيف (الشكل 2E). أداء الرعاية بعد العملية الجراحية يوميا.

3. الانتعاش

  1. منزل واحد الفأر لأن فأرا آخر قد يعض القسطرة في السكن الجماعي.
    1. لتقليل التوتر عن طريق العزلة الاجتماعية ، احتفظ بالفئران مع الإثراء البيئي (مثل الملاجئ). أداء الرعاية بعد العملية الجراحية يوميا. لتخفيف الألم والضيق وعدم الراحة ، قم بتوفير رعاية ما بعد الجراحة ، بما في ذلك التسكين (الإيبوبروفين في مياه الشرب (0.11 مجم / مل).
    2. راقب الفئران بحثا عن علامات العدوى ، مثل التقيح أو الخمول أو الألم في موقع الشق. تبدأ معظم الفئران السليمة في المشي والتغذية حوالي 2 ساعة بعد الجراحة. قد يشير الموقف المنحني والفراء المزعج وانخفاض تناول الطعام إلى الألم. إذا لوحظت هذه العلامات ، فقم بالقتل الرحيم للفئران على الفور عن طريق قطع رأسها تحت التخدير العميق أو اختناق ثاني أكسيد الكربون.
  2. سوف يدخل الدم القسطرة في الشريان ويشكل جلطة. للحفاظ على خطوط القسطرة ، قم بإزالة الجلطة يوميا ، باتباع الخطوات 3-6.
  3. املأ حقنة سعة 1 مل وإبرة 23 جم (طرف غير حاد) بمحلول ملحي هيبارين (100 وحدة / مل). باستخدام غرفة الحث ، قم بتخدير الماوس برفق باستخدام الأيزوفلوران (1.0٪ -1.5٪). ثم ، قم بإزالة الماوس من الغرفة وقم بإزالة الجلطة تحت التخدير isoflurane مع غطاء الأنف.
  4. قم بتثبيت أنبوب الشريان الموجود على ظهر الماوس باستخدام micro serrefine ، وقم بإزالة الغطاء ، واستخراج الدم والجلطات. اغسل القسطرة بمحلول ملحي هيبارين باستخدام حقنة أخرى سعة 1 مل بإبرة 23 جم (طرف غير حاد) وأعد تغطيتها. تنظيف الخط الوريدي مثل الخط الشرياني في حالة التخثر الشديد.
  5. قم بنفس الإجراء لتنظيف القسطرة مرة واحدة يوميا لمدة 3-5 أيام.
  6. تحقق من وزن جسم الماوس. إذا انخفض وزن الجسم بأكثر من 10٪ من يوم الجراحة ، فقم بتطبيق الرعاية الداعمة وحاول تحسين درجة حالة الجسم الطبيعية ، واستخدم الماوس في تجربة أخرى.
    ملاحظة: كان فقدان الوزن للحيوانات أقل من 10٪ في التجارب في هذه الدراسة. سيؤثر فقدان الوزن بشدة على استقلاب الجلوكوز الجهازي. وبالتالي ، يوصى بانتظار استعادة وزن الجسم أو إزالته من تجربة المشبك.

4. إعداد نظام المضخة (لمشبك سكر الدم)

  1. تحضير 1 وحدة / مل من الأنسولين في محلول ملحي بنسبة 0.1٪ BSA ، و 30٪ جلوكوز في محلول ملحي ، ومحلول ملحي هيبارين.
  2. قياس وزن الجسم من الماوس. احسب حجم 1 وحدة / مل من الأنسولين لجعل الأنسولين يتسرب (10 mU / kg / min). غرس 1.7 ميكرولتر / دقيقة من محلول الأنسولين في الفئران في تجربة المشبك. لجعل 300 ميكرولتر من الأنسولين ، فإن الحجم المطلوب ل 1 وحدة / مل من الأنسولين (ميكرولتر) هو 2.647 (ميكرولتر / جم) × وزن الجسم (جم). حجم 300 ميكرولتر من الأنسولين يكفي لإنهاء تجربة المشبك على 1 ماوس. يوضح الجدول 1 مثالا على جعل الأنسولين ينفجر.
  3. املأ الأنسولين المملوء و 30٪ جلوكوز في كل حقنة هاملتون ، وقم بتوصيلها بالأنبوب 1.2 ، واضبط المحقنة على مضخة المحقنة (الشكل 3 أ). املأ كل محلول في الأنبوب 1.2. املأ المحلول الملحي في حقنة سعة 1 مل ومجموعة أنابيب 1.4 (الشكل 2 أ).
  4. تخدير الفأر باستخدام الأيزوفلوران (1.0٪ -1.5٪) وتوصيل الأنبوب 1.2 بالقسطرة الوريدية ومجموعة الأنابيب 1.4 بالقسطرة الشريانية (الشكل 3 أ). استخدم شريط السيلوفان لتثبيت الأنابيب معا.
  5. ضع الماوس في دورق فارغ سعة 500 مل.
    ملاحظة: بالنسبة لمشبك ارتفاع السكر في الدم ، استخدم محلول ملحي بدلا من 1 وحدة / مل من الأنسولين.

5. مشبك سكر الدم

  1. قم بقياس مستويات الجلوكوز في الدم كل 5-10 دقائق، كما هو موضح في الشكل 3 ب، واجمع عينات الدم لقياس الهرمونات في -15 دقيقة و 10 دقائق و 20 دقيقة و 40 دقيقة و 60 دقيقة و 80 دقيقة و 100 دقيقة و 120 دقيقة. اتبع الخطوة 5.2 لقياس نسبة الجلوكوز في الدم.
    ملاحظة: ليس من الضروري قياس نسبة الجلوكوز في الدم في جميع النقاط الزمنية ، ولكن يوصى بقياسه كل 10 دقائق على الأقل. قم بقياس نسبة الجلوكوز في الدم كل 5 دقائق عندما يكون مستواه ومعدل ضخ الجلوكوز غير ثابتين.
  2. ثبت الطرف العلوي من مجموعة الأنابيب 1.4 وقم بتوصيل حقنة جديدة ، واستخرج 50 ميكرولتر من الدم ، وضعها في أنبوب سعة 1.5 مل للغسيل. قياس مستوى الجلوكوز في الدم.
    ملاحظة: هذا هو الدم المخفف بواسطة المحلول الملحي في الأنبوب بسبب غسل القسطرة بعد أخذ العينات السابقة. حجم 50 ميكرولتر يكفي لاستبدال الدم المخفف بالدم النقي.
  3. تخزين الدم المخفف (خلايا الدم الحمراء). اغسل الدم المجمع (~ 500 ميكرولتر) بالمحلول الملحي (انظر الخطوات 5.11-5.12) والعودة إلى الجسم لمنع نقص الأكسجة.
  4. يتم توصيل القسطرة بالشريان المصاب بارتفاع ضغط الدم ، لذلك عندما يتم فك المشبك ، سيتدفق الدم ويستخدم لقياس الجلوكوز باستخدام مقياس الجلوكوز سهل الاستخدام. نقع 50 ميكرولتر من المياه المالحة للحفاظ على كمية كافية من سوائل الدم.
  5. لأخذ عينات الدم ، استخرج 50 ميكرولترا إضافيا من الدم وضعه في أنبوب سعة 1.5 مل على الثلج. غرس 100 ميكرولتر (50 ميكرولتر من الاستبدال + 50 ميكرولتر من أخذ العينات) من المياه المالحة.
  6. بعد 0 دقيقة من قياس نسبة الجلوكوز في الدم ، ابدأ مضخة حقنة الأنسولين. أولا ، قم بضخ 30 mU / kg / min في البلعة لمدة دقيقتين (5.1 ميكرولتر / دقيقة) ، ثم ضخ 10 mU / kg / min (1.7 μL / min) لبقية المدة.
  7. قياس مستوى الجلوكوز في الدم وتغيير معدل ضخ الجلوكوز كل 5-10 دقائق لمدة 120 دقيقة.
  8. قم بإنشاء حالة مستقرة حيث لا يتغير معدل ضخ الجلوكوز ، ويكون مستوى الجلوكوز في الدم 50 مجم / ديسيلتر.
  9. بعد جمع عينة الدم عند t = 120 دقيقة ، قم بغرس عامل القتل الرحيم في الوريد الوداجي وجمع الأنسجة لتحليل الحمض النووي الريبي أو البروتين.
  10. دم الطرد المركزي عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق وقياس تركيز الهرمونات مثل الأنسولين أو الببتيد C باستخدام مجموعة ELISA وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  11. لغسل الدم ، قم بطرد الدم عند 1000 × جم لمدة 3 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية ، وأضف 500 ميكرولتر من محلول ملحي هيبارين ، وقم بإجراء الماصة.
  12. كرر الغسيل مرة أخرى وضع خلايا الدم الحمراء المغسولة في حقنة 1 مل للشريان. سيتم إعادة حقن خلايا الدم تلقائيا عند غرس 50 أو 100 ميكرولتر من المحلول الملحي في الخطوتين 5.2 و 5.3. مراقبة الهيماتوكريت بعناية لمنع نقص الأكسجة.
    ملاحظة: لقياس نسبة الجلوكوز في الدم ، تم استخدام جهاز قياس الجلوكوز التجاري المفيد.

6. مشبك ارتفاع السكر في الدم

  1. اتبع الخطوات كتقنية مشبك سكر الدم ، ولكن بدون تسريب الأنسولين ومع تعديل نسبة الجلوكوز في الدم إلى 250-300 مجم / ديسيلتر. قم بقياس مستويات الجلوكوز في الدم كل 5-10 دقائق، كما هو موضح في الشكل 3 ب، واجمع عينات الدم لقياس الهرمونات في -15 دقيقة و 10 دقائق و 20 دقيقة و 40 دقيقة و 60 دقيقة و 80 دقيقة و 100 دقيقة و 120 دقيقة.
  2. قم بتوصيل حقنة جديدة بمجموعة الأنابيب1.4 ، واستخرج 50 ميكرولتر من الدم ، وضعها في أنبوب سعة 1.5 مل للغسيل.
  3. لأخذ عينات الدم ، استخرج 50 ميكرولترا إضافيا من الدم وضعه في أنبوب سعة 1.5 مل على الثلج. غرس 100 ميكرولتر (50 ميكرولتر من الاستبدال + 50 ميكرولتر من أخذ العينات) من المياه المالحة.
  4. بعد 0 دقيقة من قياس نسبة الجلوكوز في الدم ، ابدأ تشغيل مضخة حقنة الجلوكوز. أولا ، ضع 30 جم / كجم / دقيقة في البلعة لمدة دقيقتين (5.1 ميكرولتر / دقيقة) ، ثم 10 جم / كجم / دقيقة (1.7 ميكرولتر / دقيقة) لبقية المدة.
  5. قياس مستوى الجلوكوز في الدم وتغيير معدل ضخ الجلوكوز كل 5-10 دقائق لمدة 120 دقيقة. خلق حالة مستقرة حيث لا يتغير معدل ضخ الجلوكوز ، ومستوى الجلوكوز في الدم هو 250-300 ملغ / ديسيلتر ، وهي حالة ارتفاع السكر في الدم مثبتة.

النتائج

تم إجراء دراسة مشبك سكر الدم في ذكور الفئران C57BL / 6N (8 أسابيع من العمر ، أكثر من 25 جم من وزن الجسم) 3 ساعات صامت في بداية التجربة (الشكل 4A ، B). كان مستوى الجلوكوز في الدم الأولي 136 مجم / ديسيلتر (t = -15 دقيقة). إذا كان أقل من 90 ملغ / ديسيلتر ، فقد يكون ذلك إما لأن الجراحة لم تسر...

Discussion

الطريقة الموضحة هنا هي طريقة بسيطة يمكن القيام بها باستخدام أطراف الماصة والمحاقن وغيرها من العناصر الموجودة في المختبرات العادية. على الرغم من أن الباحثين قد يحتاجون إلى شراء أنابيب ومضخات إضافية ، إلا أن المعدات باهظة الثمن ليست ضرورية. وبالتالي ، فإن بروتوكول القسطرة والمشبك هذا أسهل ...

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المبادرة الرائدة للباحثين الشباب المتميزين (من MEXT) ؛ (أ) منحة معونة للبحث العلمي (ب) (رقم المنحة JP21H02352)؛ الوكالة اليابانية للبحث والتطوير الطبي (AMED-RPIME، رقم المنحة JP21gm6510009h0001, JP22gm6510009h9901); مؤسسة أوهارا التذكارية ؛ مؤسسة أستيلاس للبحوث في الاضطرابات الأيضية. مؤسسة سوزوكين التذكارية ، ومؤسسة أكياما لعلوم الحياة ، ومؤسسة ناريشيج لأبحاث علم الأعصاب. كما نشكر الدكتورة نور فريهان أصغر على تحرير مسودة هذه المخطوطة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Adhesive glueHenkel AG & Co. KGaALOCTITE 454
ELISA kit (C-peptide)Morinaga Institute of Bilogical Science IncM1304Mouse C-peptide ELISA Kit
ELISA kit (insulin)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation633-03411LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (U-type)
Handy glucose meterNipro Co.11-777Free Style Freedom Lite
Insulin (100U/ml)Eli Lilly & Co.428021014Humulin R (100U/ml)
MouseJapan SLC Inc.C57BL/6NCrSlcC57BL
SutureNatsume seisakushoC-23S-560 No.2Sterilized
Syringe PumpPump Systems Inc.NE-1000
Synthetic sutureVÖMELHR-17
Tubing1AS ONE Corporation9-869-01LABORAN(R) Silicone Tube
Tubing2Fisher Scientific427400BD Intramedic PE Tubing
Tubing3IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD.size5Polyethylene tubing size5

References

  1. Seaquist, E. R., et al. Hypoglycemia and diabetes: A report of a workgroup of the american diabetes association and the endocrine society. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (5), 1845-1859 (2013).
  2. Amiel, S. A., et al. Hypoglycaemia, cardiovascular disease, and mortality in diabetes: epidemiology, pathogenesis, and management. The Lancet Diabetes and Endocrinology. 7 (5), 385-396 (2019).
  3. . Leanne Riley Mean fasting blood glucose Available from: https://www.who.int/data/gho/indicator-metadata-registry/imr-details/2380 (2022)
  4. Umpierrez, G., Korytkowski, M. Diabetic emergencies-ketoacidosis, hyperglycaemic hyperosmolar state and hypoglycaemia. Nature Reviews Endocrinology. 12 (4), 222-232 (2016).
  5. Sprague, J. E., Arbeláez, A. M. Glucose counterregulatory responses to hypoglycemia. Pediatric Endocrinology Reviews. 9 (1), 463-473 (2011).
  6. Toda, C., et al. Distinct effects of leptin and a melanocortin receptor agonist injected into medial hypothalamic nuclei on glucose uptake in peripheral tissues. Diabetes. 58 (12), 2757-2765 (2009).
  7. Toda, C., et al. Extracellular signal-regulated kinase in the ventromedial hypothalamus mediates leptin-Induced glucose uptake in red-type skeletal muscle. Diabetes. 62 (7), 2295-2307 (2013).
  8. Toda, C., Kim, J. D., Impellizzeri, D., Cuzzocrea, S., Liu, Z. -. W., Diano, S. UCP2 regulates mitochondrial fission and ventromedial nucleus control of glucose responsiveness. Cell. 164 (5), 872-883 (2016).
  9. Lee, M. L., et al. Prostaglandin in the ventromedial hypothalamus regulates peripheral glucose metabolism. Nature Communications. 12 (1), 2330 (2021).
  10. Jessen, N., Goodyear, L. J. Contraction signaling to glucose transport in skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 99 (1), 330-337 (2005).
  11. Shiuchi, T., et al. Induction of glucose uptake in skeletal muscle by central leptin is mediated by muscle β2-adrenergic receptor but not by AMPK. Scientific Reports. 7 (1), 15141 (2017).
  12. Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 57, e3188 (2011).
  13. Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp in the conscious rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 48, e2432 (2010).
  14. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
  15. DeFronzo, R. A., Soman, V., Sherwin, R. S., Hendler, R., Felig, P. Insulin binding to monocytes and insulin action in human obesity, starvation, and refeeding. Journal of Clinical Investigation. 62 (1), 204-213 (1978).
  16. Czech, M. P. Insulin action and resistance in obesity and type 2 diabetes. Nature Medicine. 23 (7), 804-814 (2017).
  17. Saisho, Y. β-cell dysfunction: Its critical role in prevention and management of type 2 diabetes. World Journal of Diabetes. 6 (1), 109 (2015).
  18. Mittendorfer, B., Patterson, B. W., Smith, G. I., Yoshino, M., Klein, S. β Cell function and plasma insulin clearance in people with obesity and different glycemic status. Journal of Clinical Investigation. 132 (3), 154068 (2022).
  19. Nchienzia, H., et al. Hedgehog interacting protein (Hhip) regulates insulin secretion in mice fed high fat diets. Scientific reports. 9 (1), 11183 (2019).
  20. Tomita, T., Doull, V., Pollock, H. G., Krizsan, D. Pancreatic islets of obese hyperglycemic mice (ob/ob). Pancreas. 7 (3), 367-375 (1992).
  21. Uchida, K., et al. Lack of TRPM2 impaired insulin secretion and glucose metabolisms in mice. Diabetes. 60 (1), 119-126 (2011).
  22. Zhu, Y. X., Zhou, Y. C., Zhang, Y., Sun, P., Chang, X. A., Han, X. Protocol for in vivo and ex vivo assessments of glucose-stimulated insulin secretion in mouse islet β cells. STAR Protocols. 2 (3), 100728 (2021).
  23. Moullé, V. S. Autonomic control of pancreatic beta cells: What is known on the regulation of insulin secretion and beta-cell proliferation in rodents and humans. Peptides. 148, 170709 (2022).
  24. Honzawa, N., Fujimoto, K., Kitamura, T. Cell autonomous dysfunction and insulin resistance in pancreatic α cells. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3699 (2019).
  25. Siddiqui, A., Madhu, S. V., Sharma, S. B., Desai, N. G. Endocrine stress responses and risk of type 2 diabetes mellitus. Stress. 18 (5), 498-506 (2015).
  26. Chan, O., Sherwin, R. Influence of VMH fuel sensing on hypoglycemic responses. Trends in Endocrinology & Metabolism. 24 (12), 616-624 (2013).
  27. Donovan, C. M., Watts, A. G. Peripheral and central glucose sensing in hypoglycemic detection. Physiology. 29 (5), 314-324 (2014).
  28. TeSlaa, T., et al. The source of glycolytic intermediates in mammalian tissues. Cell Metabolism. 33 (2), 367-378.e5 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved