清醒小鼠的高血糖钳夹和低血糖钳夹

摘要

高血糖钳夹用于测量胰岛素释放，并维持较高的血糖浓度。降糖钳夹用于测量由反调节反应引起的葡萄糖产生。两种方法都使用相同的外科手术。在这里，我们提出了一种钳夹技术来评估全身葡萄糖代谢。

摘要

糖尿病 （DM） 是由胰腺β细胞释放的胰岛素不足 （Type1 DM） 和肌肉、肝脏和脂肪组织中的胰岛素敏感性 （Type2 DM） 引起的。胰岛素注射治疗糖尿病患者，但会导致低血糖作为副作用。皮质醇和儿茶酚胺被释放以激活肝脏产生的葡萄糖以恢复低血糖，称为反调节反应 （CRR）。在使用啮齿动物模型的 DM 研究中，葡萄糖耐量试验和 2-脱氧葡萄糖注射液分别用于测量胰岛素释放和 CRR。然而，在实验过程中，血糖浓度持续变化，导致评估净胰岛素释放量和 CRR 的困难。本文描述了一种将清醒小鼠的血糖保持在 250 mg/dL 或 50 mg/dL 的方法，以分别比较胰岛素和 CRR 激素的释放。

将聚乙烯管植入小鼠的颈动脉和颈静脉，让小鼠从手术中恢复。颈静脉管通过注射泵连接到汉密尔顿注射器，以恒定和可变的速率输注胰岛素或葡萄糖。颈动脉管用于采血。对于高血糖钳夹，将 30% 的葡萄糖注入静脉，每 5 分钟或 10 分钟从动脉血中测量血糖水平。增加 30% 葡萄糖的输注速率，直到血糖水平变为 250 mg/dL。收集血液以测量胰岛素浓度。对于低血糖钳夹，将 10 mU/kg/min 胰岛素与 30% 葡萄糖一起输注，其输注速率可变以维持 50 mg/dL 的血糖水平。当葡萄糖输注和血糖都达到稳定状态时，收集血液以测量反调节激素。高血糖钳和低血糖钳具有相同的外科手术和实验设置。因此，该方法对全身葡萄糖代谢的研究人员很有用。

引言

葡萄糖是细胞的重要能量来源，缺乏葡萄糖会导致各种症状和并发症。在低血糖（低血糖，空腹血糖水平通常低于 70 mg/dL，但不应由单一值¹ 确定）的情况下，最常见的症状包括虚弱、意识模糊、出汗和头痛。它还可能破坏大脑功能，增加心血管事件和死亡的风险²。相反，高血糖症是一种血浆葡萄糖浓度超过正常水平（空腹血糖^{水平 3} 通常> 126 mg/dL）的疾病。这可能发生在胰岛素产生或利用不足的糖尿病患者身上。高血糖症可导致糖尿病酮症酸中毒，当身体不能使用葡萄糖作为能量，而是分解脂肪酸作为燃料时，就会发生这种情况。高血糖高渗状态也会增加死亡率⁴.长期高血糖会对血管、神经和器官造成损害，导致心血管疾病、视网膜病变和肾脏疾病等多种慢性并发症的发展。因此，血糖浓度必须保持在 100 mg/dL 和 120 mg/dL 之间的严格范围内。

在单室模型中，血糖由葡萄糖输入和输出之间的平衡调节（图1A）。葡萄糖输入包括从食物中吸收的葡萄糖和从肝脏、肾脏和小肠产生的葡萄糖。葡萄糖输出包括组织中的葡萄糖摄取和肾脏的葡萄糖处理。葡萄糖输入量和输出量均受内分泌激素调节。例如，胰高血糖素、皮质酮和儿茶酚胺（称为反调节激素）在血糖水平降低时释放

研究方案

所有程序均由熊本大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准。

注意：为了缓解疼痛，布洛芬在饮用水（0.11mg / mL）中给予48小时，并在手术前30分钟给予丁丙诺啡（0.05-0.1mg / kg ip）。无菌条件包括手套、口罩和在动物之间用环氧乙烷灭菌的高压灭菌器械。手术在设置为37°C的加热垫上进行，并为每只动物覆盖一个新的实验室垫。手术前，用甜菜碱溶液和酒精清洁手术区域。所有手术器械均用高压灭菌器灭菌（不超过两次手术）。在进行切口之前，对小鼠进行检查以确保它们完全麻醉。在手术前和手术期间通过捏脚趾来评估每只小鼠的麻醉深度。适应期每次不超过5分钟。遵循相应机构 IACUC 的指示。

1.颈静脉和颈动脉管的制备

1. 用高压灭菌器或环氧乙烷对所有管路、聚丙烯用品（例如移液管吸头）和缝合线进行灭菌。对于颈静脉，使用胶水连接 8 cm 的管子 1（见 材料）和 3 cm 的管子 2（图 2A）。将 2 毫米的管子 1 放在顶部，因为管子 2（聚乙烯）太硬，可能会损坏血管 （管路 1.1）。
2. 颈静脉延长管（Tubing1.2），用于输注葡萄糖和胰岛素
   1. 准备两个 30 cm 管和一个带管 2 的 10 cm 管（

讨论

这里描述的方法很简单，可以使用移液器吸头、注射器和普通实验室中的其他物品来完成。尽管研究人员可能需要购买额外的管子和泵，但不需要昂贵的设备。因此，与以前的报告相比，这种导管插入术和钳夹术方案更容易开始12,13,14。

钳夹技术是在 1970 年左右开发的，已用于小鼠和人类¹⁵

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive glue	Henkel AG & Co. KGaA	LOCTITE 454
ELISA kit (C-peptide)	Morinaga Institute of Bilogical Science Inc	M1304	Mouse C-peptide ELISA Kit
ELISA kit (insulin)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	633-03411	LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (U-type)
Handy glucose meter	Nipro Co.	11-777	Free Style Freedom Lite
Insulin (100U/ml)	Eli Lilly & Co.	428021014	Humulin R (100U/ml)
Mouse	Japan SLC Inc.	C57BL/6NCrSlc	C57BL
Suture	Natsume seisakusho	C-23S-560 No.2	Sterilized
Syringe Pump	Pump Systems Inc.	NE-1000
Synthetic suture	VÖMEL	HR-17
Tubing1	AS ONE Corporation	9-869-01	LABORAN(R) Silicone Tube
Tubing2	Fisher Scientific	427400	BD Intramedic PE Tubing
Tubing3	IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD.	size5	Polyethylene tubing size5