意識のあるマウスにおける高血糖クランプと低血糖クランプ

要約

高血糖クランプは、より高い血糖濃度を維持してインスリン放出を測定するために使用されます。血糖降下クランプは、逆調節反応によって誘発されるグルコース産生を測定するためのものです。どちらの方法も同じ外科的処置を使用します。ここでは、全身のグルコース代謝を評価するためのクランプ技術を紹介します。

要約

糖尿病(DM)は、膵臓β細胞からのインスリン放出不足(1型DM)と、筋肉、肝臓、脂肪組織におけるインスリン感受性(2型DM)によって引き起こされます。インスリン注射はDM患者を治療しますが、副作用として低血糖を引き起こします。コルチゾールとカテコールアミンが放出され、肝臓からのグルコース産生を活性化して、反調節反応(CRR)と呼ばれる低血糖を回復させます。げっ歯類モデルを用いたDM研究では、ブドウ糖負荷試験と2-デオキシグルコース注射を用いて、それぞれインスリン放出とCRRを測定します。しかし、血糖値は実験中に持続的に変化するため、正味のインスリン放出とCRRの評価が困難になります。本稿では、意識のあるマウスの血糖値を250mg/dLまたは50mg/dLに保ち、インスリンホルモンとCRRホルモンの放出をそれぞれ比較する方法について述べる。

マウスの頸動脈と頸静脈にポリエチレンチューブを埋め込み、マウスが手術から回復するのを待ちます。頸静脈チューブは、シリンジポンプでハミルトンシリンジに接続され、インスリンまたはグルコースを一定かつ可変の速度で注入することができます。頸動脈チューブは採血用です。高血糖クランプでは、30%のブドウ糖を静脈に注入し、5分または10分ごとに動脈血から血糖値を測定します。血糖値が250mg/dLになるまで、30%グルコースの注入速度を上げます。血液を採取してインスリン濃度を測定します。血糖降下クランプの場合、10 mU/kg/min のインスリンと 30% グルコースを注入し、その注入速度は 50 mg/dL の血糖値を維持します。血液は、ブドウ糖注入と血糖の両方が定常状態に達したときに、調節ホルモンを測定するために収集されます。高血糖クランプと低血糖クランプはどちらも、同じ外科的処置と実験設定を持っています。したがって、この方法は全身性グルコース代謝の研究者にとって有用である。

概要

ブドウ糖は細胞にとって重要なエネルギー源であり、ブドウ糖が不足するとさまざまな症状や合併症を引き起こす可能性があります。低血糖(低血糖、空腹時血糖値が70 mg / dL未満であるが、^{単一の値1}で決定すべきではない)の場合、最も一般的な症状には、脱力感、錯乱、発汗、頭痛などがあります。また、脳機能を混乱させ、心血管イベントや死亡のリスクを高める可能性があります²。逆に、高血糖は血漿グルコース濃度が正常レベル(空腹時血糖値¹²⁶で一般的に>3mg/dL)を超える病状です。これは、インスリンの産生または利用が不足している糖尿病患者に発生する可能性があります。高血糖は糖尿病性ケトアシドーシスを引き起こす可能性があり、これは体がブドウ糖をエネルギーとして使用できず、代わりに脂肪酸を燃料として分解するときに発生します。高血糖性高浸透圧状態^{も死亡率を}増加させます4。長期的な高血糖は、血管、神経、臓器に損傷を与え、心血管疾患、網膜症、腎臓病などのいくつかの慢性合併症の発症につながる可能性があります。したがって、血糖値は100 mg / dLから120 mg / dLの間の狭い範囲に維持する必要があります。

血糖値は、1コンパートメントモデルにおけるグルコースのインプットとアウトプットのバランスによって....

プロトコル

すべての手続きは、熊本大学の動物実験委員会(IACUC)によって承認されました。

注:痛みを和らげるために、イブプロフェンを飲料水(0.11 mg / mL)で48時間投与し、ブプレノルフィン(0.05〜0.1 mg / kg i.p.)を手術の30分前に投与しました。無菌条件には、手袋、マスク、および動物間でエチレンオキシドで滅菌されたオートクレーブ処理された器具が含まれます。手術は、37°Cに設定された加熱パッドで行われ、各動物用の新しい実験用マットで覆われました。手術前に、手術部位はベタジン溶液とアルコールで洗浄されました。すべての手術器具はオートクレーブで滅菌されました(2回以内の手術の場合)。切開を行う前に、マウスが完全に麻酔されていることを確認するためにマウスをチェックしました。各マウスの麻酔深度は、手術前および手術中につま先をつまんで評価しました。順応期間は毎回5分以内であった。各機関のIACUCの指示に従ってください。

1. 頸静脈と頸動脈のチューブの作製

1. すべてのチューブ、ポリプロピレン供給品(ピペットチップなど)、および縫合糸をオートクレーブまたはエチレンオキシドで滅菌します。頸静脈の場合は、接着剤を使用して8 cmのチューブ1( 材料を参照)と3 cmのチューブ2を接続します(

ディスカッション

ここで説明する方法は、ピペットチップやシリンジなど、通常の実験室にあるものを使ってできる簡単な方法です。研究者は追加のチューブやポンプを購入する必要があるかもしれませんが、高価な機器は必要ありません。したがって、カテーテル法とクランプのこのプロトコルは、以前のレポートと比較して開始が容易です12,13,14。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive glue	Henkel AG & Co. KGaA	LOCTITE 454
ELISA kit (C-peptide)	Morinaga Institute of Bilogical Science Inc	M1304	Mouse C-peptide ELISA Kit
ELISA kit (insulin)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	633-03411	LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (U-type)
Handy glucose meter	Nipro Co.	11-777	Free Style Freedom Lite
Insulin (100U/ml)	Eli Lilly & Co.	428021014	Humulin R (100U/ml)
Mouse	Japan SLC Inc.	C57BL/6NCrSlc	C57BL
Suture	Natsume seisakusho	C-23S-560 No.2	Sterilized
Syringe Pump	Pump Systems Inc.	NE-1000
Synthetic suture	VÖMEL	HR-17
Tubing1	AS ONE Corporation	9-869-01	LABORAN(R) Silicone Tube
Tubing2	Fisher Scientific	427400	BD Intramedic PE Tubing
Tubing3	IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD.	size5	Polyethylene tubing size5