의식이 있는 쥐의 고혈당 클램프 및 저혈당 클램프

요약

고혈당 클램프는 더 높은 혈당 농도를 유지하면서 인슐린 방출을 측정하는 데 사용됩니다. 저혈당 클램프는 역조절 반응에 의해 유도된 포도당 생성을 측정하기 위한 것입니다. 두 방법 모두 동일한 수술 절차를 사용합니다. 여기에서는 전신 포도당 대사를 평가하기 위한 클램프 기술을 제시합니다.

초록

진성 당뇨병(DM)은 췌장 β세포의 인슐린 분비 부족(1형 DM)과 근육, 간, 지방 조직의 인슐린 민감성(2형 DM)으로 인해 발생합니다. 인슐린 주사는 DM 환자를 치료하지만 부작용으로 저혈당증을 유발합니다. 코르티솔과 카테콜아민은 간에서 포도당 생산을 활성화하여 저혈당을 회복하기 위해 분비되는데, 이를 역조절 반응(CRR)이라고 합니다. 설치류 모델을 이용한 DM 연구에서는 인슐린 방출과 CRR을 측정하기 위해 각각 포도당 내성 검사와 2-데옥시-포도당 주사를 사용합니다. 그러나 실험 중에 혈당 농도가 지속적으로 변하여 순 인슐린 분비와 CRR을 평가하는 데 어려움이 있습니다. 이 글에서는 의식이 있는 쥐의 혈당을 250mg/dL 또는 50mg/dL로 유지하여 각각 인슐린과 CRR 호르몬의 분비를 비교하는 방법을 설명합니다.

폴리에틸렌 튜브를 생쥐의 경동맥과 경정맥에 이식하고 생쥐가 수술에서 회복할 수 있도록 합니다. 경정맥 튜브는 주사기 펌프가 있는 해밀턴 주사기에 연결되어 일정하고 다양한 속도로 인슐린 또는 포도당을 주입할 수 있습니다. 경동맥 튜브는 혈액 수집을 위한 것입니다. 고혈당 클램프의 경우 30%의 포도당을 정맥에 주입하고 5분 또는 10분마다 동맥혈에서 혈당 수치를 측정합니다. 혈당 수치가 250mg/dL이 될 때까지 30% 포도당의 주입 속도가 증가합니다. 인슐린 농도를 측정하기 위해 혈액을 채취합니다. 저혈당 클램프의 경우 10mU/kg/min 인슐린을 30% 포도당과 함께 주입하며, 주입 속도는 50mg/dL의 혈당 수준을 유지하기 위해 가변적입니다. 포도당 주입과 혈당이 모두 정상 상태에 도달했을 때 역조절 호르몬을 측정하기 위해 혈액을 수집합니다. 고혈당 클램프와 저혈당 클램프는 모두 동일한 수술 절차와 실험 설정을 가지고 있습니다. 따라서 이 방법은 전신 포도당 대사 연구자에게 유용합니다.

서문

포도당은 세포의 중요한 에너지원이며, 포도당이 부족하면 다양한 증상과 합병증이 발생할 수 있습니다. 저혈당(저혈당, 일반적으로 공복 혈당 수치가 70mg/dL 미만이지만^{단일 값으로 결정}되어서는 안 됨1)의 경우 가장 흔한 증상으로는 쇠약, 혼란, 발한, 두통 등이 있습니다. 또한 대뇌 기능을 방해하고 심혈관 질환 및 사망 위험을 증가시킬 수 있다². 반대로, 고혈당증은 혈장 포도당 농도가 정상 수준(일반적으로 공복 혈당 수치³에서 > 126mg/dL)을 초과하는 의학적 상태입니다. 이는 인슐린 생산 또는 활용에 결핍이 있는 당뇨병 환자에서 발생할 수 있습니다. 고혈당증은 당뇨병성 케톤산증으로 이어질 수 있는데, 이는 신체가 포도당을 에너지로 사용하지 못하고 대신 지방산을 분해하여 연료로 사용할 때 발생합니다. 고혈당 고삼투압 상태도 사망률을 증가시킨다⁴. 장기적인 고혈당증은 혈관, 신경 및 장기에 손상을 일으켜 심혈관 질환, 망막병증 및 신장 질환과 같은 여러 만성 합병증의 발병으로 이어질 수 있습니다. 따라서 혈당 농도는 100mg/dL에서 120mg/dL 사이의 좁은 범위로 유지되어야 합니다.

프로토콜

모든 절차는 구마모토 대학의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.

참고: 통증 완화를 위해 이부프로펜을 식수(0.11mg/mL)에 타서 48시간 동안 투여하고, 부프레노르핀(0.05-0.1mg/kg i.p.)을 수술 30분 전에 투여했습니다. 멸균 조건에는 장갑, 마스크 및 동물 사이에서 에틸렌 옥사이드로 멸균된 고압멸균 기구가 포함됩니다. 수술은 37°C로 설정된 가열 패드에서 수행되었으며 각 동물에 대한 새로운 실험실 매트로 덮여 있었습니다. 수술 전에 수술 부위를 베타딘 용액과 알코올로 청소했습니다. 모든 수술 기구는 오토클레이브로 멸균되었습니다(2회 이하의 수술). 절개를 하기 전에 쥐가 완전히 마취되었는지 확인했습니다. 각 마우스에 대한 마취 깊이는 수술 전과 수술 중에 발가락 꼬집음으로 평가되었습니다. 적응 시간은 매번 5분을 넘지 않았습니다. 해당 기관의 IACUC 지침을 따르십시오.

1. 경정맥 및 경동맥용 튜브 준비

1. 모든 튜브, 폴리프로필렌 공급품(예: 피펫 팁) 및 봉합사를 오토클레이브 또는 에틸렌 옥사이드로 멸균합니다. 경정맥의 경우 접착제를 사용하여 ....

토론

여기에 설명된 방법은 피펫 팁, 주사기 및 일반 실험실에서 볼 수 있는 기타 품목으로 수행할 수 있는 간단한 방법입니다. 연구원이 추가 튜브와 펌프를 구입해야 할 수도 있지만 값비싼 장비는 필요하지 않습니다. 따라서, 이러한 카테터 삽입 및 클램프 프로토콜은 이전 보고에 비해 시작하기가 더 쉽다⁽12,13,14).

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive glue	Henkel AG & Co. KGaA	LOCTITE 454
ELISA kit (C-peptide)	Morinaga Institute of Bilogical Science Inc	M1304	Mouse C-peptide ELISA Kit
ELISA kit (insulin)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	633-03411	LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (U-type)
Handy glucose meter	Nipro Co.	11-777	Free Style Freedom Lite
Insulin (100U/ml)	Eli Lilly & Co.	428021014	Humulin R (100U/ml)
Mouse	Japan SLC Inc.	C57BL/6NCrSlc	C57BL
Suture	Natsume seisakusho	C-23S-560 No.2	Sterilized
Syringe Pump	Pump Systems Inc.	NE-1000
Synthetic suture	VÖMEL	HR-17
Tubing1	AS ONE Corporation	9-869-01	LABORAN(R) Silicone Tube
Tubing2	Fisher Scientific	427400	BD Intramedic PE Tubing
Tubing3	IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD.	size5	Polyethylene tubing size5