JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم طريقة لدراسة إعادة نشر الخلايا السرطانية من نقائل الرئة تتضمن بروتوكولا جراحيا للتحويل الضوئي الانتقائي لنقائل الرئة ، يليه تحديد الخلايا السرطانية المعاد نشرها في الأعضاء الثالثة.

Abstract

ورم خبيث - الانتشار المنهجي للسرطان - هو السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان. على الرغم من أن ورم خبيث يعتقد عادة أنه عملية أحادية الاتجاه حيث تنتشر خلايا الورم الرئيسي وتنبعث البذور ، إلا أن الخلايا السرطانية في النقائل الموجودة يمكن أيضا أن تعيدالانتشار وتؤدي إلى آفات جديدة في المواقع الثالثية في عملية تعرف باسم "ورم خبيث من النقائل" أو "ورم خبيث إلى ورم خبيث البذر". قد يؤدي البذر من ورم خبيث إلى ورم خبيث إلى زيادة العبء النقيلي وتقليل نوعية حياة المريض وبقائه على قيد الحياة. لذلك ، فإن فهم العمليات الكامنة وراء هذه الظاهرة أمر بالغ الأهمية لتحسين استراتيجيات العلاج للمرضى الذين يعانون من السرطان النقيلي.

لا يعرف سوى القليل عن بذر ورم خبيث إلى ورم خبيث ، ويرجع ذلك جزئيا إلى القيود اللوجستية والتكنولوجية. تعتمد الدراسات حول البذر من ورم خبيث إلى ورم خبيث بشكل أساسي على طرق التسلسل ، والتي قد لا تكون عملية للباحثين الذين يدرسون التوقيت الدقيق لأحداث البذر من ورم خبيث إلى ورم خبيث أو ما يعززها أو يمنعها. هذا يسلط الضوء على عدم وجود منهجيات تسهل دراسة البذر من ورم خبيث إلى ورم خبيث. لمعالجة هذا الأمر ، قمنا بتطوير - ووصف هنا - بروتوكولا جراحيا للفئران للتحويل الضوئي الانتقائي لنقائل الرئة ، مما يسمح بوضع علامات محددة وتتبع مصير الخلايا السرطانية التي تعيد الانتشار من الرئة إلى المواقع الثالثية. على حد علمنا ، هذه هي الطريقة الوحيدة لدراسة إعادة نشر الخلايا السرطانية وبذر ورم خبيث إلى ورم خبيث من الرئتين التي لا تتطلب التحليل الجينومي.

Introduction

ورم خبيث هو السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان1. ينشأ السرطان النقيلي عندما تنتشر خلايا الورم الرئيسي في جميع أنحاء الجسم وتتكاثر إلى أورام يمكن اكتشافها سريريا في الأعضاء البعيدة 2,3.

على الرغم من أن ورم خبيث يعتقد عادة أنه عملية أحادية الاتجاه حيث تنتشر الخلايا السرطانية من الورم الرئيسي وتستعمر الأعضاء البعيدة4 ، إلا أن الأدلة السريرية والتجريبية المتزايدة تشير إلى وجود عملية أكثر تعقيدا ومتعددة الاتجاهات. لقد ثبت أن الخلايا السرطانية المنتشرة يمكن أن تعيد زرع الورم الرئيسي (إذا كان لا يزال في مكانه)5،6،7،8،9 ، ويمكن للخلايا السرطانية من البؤر النقيلية الموجودة أن تنتقل إلى مواقع ثالثية وتؤدي إلى آفات جديدة10،11،12،13. في الواقع ، تشير الأدلة من التحليلات الجينومية الحديثة إلى أن بعض الآفات النقيلية لا تنشأ من الورم الرئيسي ، ولكن من النقائل الأخرى - وهي ظاهرة تعرف باسم "ورم خبيث من النقائل" أو "ورم خبيث إلى ورم خبيث"14،15،16. يمكن أن يؤدي البذر من ورم خبيث إلى ورم خبيث إلى إدامة عملية المرض حتى بعد إزالة الورم الرئيسي ، وزيادة العبء النقيلي ، وتقليل نوعية حياة المريض وبقائه على قيد الحياة. لذلك ، فإن فهم العمليات الكامنة وراء البذر من ورم خبيث إلى ورم خبيث أمر بالغ الأهمية لتحسين استراتيجيات العلاج للمرضى الذين يعانون من مرض النقيلي.

على الرغم من الآثار السريرية الشديدة المحتملة ، لا يعرف سوى القليل عن البذر من ورم خبيث إلى ورم خبيث ، ويرجع ذلك جزئيا إلى القيود اللوجستية والتكنولوجية. الدراسات البشرية محدودة بسبب ندرة العينات السريرية. الاستئصال السريري وخزعة الآفات النقيلية غير شائعين ، وكذلك خزعة الأعضاء التي تبدو سليمة ، حيث قد تكمن خلايا سرطانية واحدة منتشرة. وهذا يعني أن الدراسات البشرية عادة ما تكون ممكنة فقط باستخدام عينات تشريح الجثة من الأفراد الذين لا تزال أورامهم الأولية في مكانها أو تم استئصالها سابقا ولكنها لا تزال متاحة للباحثين. عندما تتوفر مثل هذه العينات ، يجب إجراء تحليلات النسب لتطور السرطان باستخدام طرق التسلسل14. ومع ذلك ، فإن التسلسل الجماعي للأورام الأولية المتطابقة والانبثاث ليس لديه الحساسية اللازمة لتتبع النسب الشامل. على سبيل المثال ، قد يكشف التسلسل السائب لآفة واحدة عن استنساخ فرعي لا يمكن اكتشافه في أي من الآفات المتطابقة. في هذه الحالة ، لن يتمكن المرء من تحديد أصل هذا الاستنساخ الفرعي. قد يكون موجودا في الورم الرئيسي أو ورم خبيث آخر بتردد أقل من حد الكشف ، أو ربما نشأ بعد الاستعمار الأولي للآفة النقيلية التي تم العثور عليها فيها. يوفر تسلسل الخلية الواحدة حساسية متزايدة ، لكن تكلفته العالية تحد من تطبيق هذه التقنية على نطاق واسع. تعني الطبيعة الاستعادية لهذه الدراسات أيضا أنها توفر نظرة ثاقبة محدودة للأحداث النقيلي العابرة ومشهد المرض في نقاط زمنية مختلفة.

في النماذج الحيوانية ، تسمح التطورات التكنولوجية الحديثة الآن برسم خرائط تطورية مستقبلية بدقة مكانية وزمنية عالية17،18،19،20. تستخدم هذه التقنيات تحرير الجينوم CRISPR / Cas9 لهندسة الخلايا باستخدام رمز شريطي متطور - طفرات وراثية تتراكم بمرور الوقت. عند التسلسل ، يمكن تتبع نسب كل خلية بناء على ملف تعريف الطفرات للرمز الشريطي17،18،19،20. في الواقع ، يتم استخدام هذه التكنولوجيا بالفعل لرسم خريطة البذر من ورم خبيث إلى ورم خبيث. في ورقة بحثية حديثة ، أظهر Zhang et al. أن خلايا سرطان الثدي والبروستاتا في النقائل العظمية تعيد الانتشار من العظام إلى النقائل الثانوية للبذور في أعضاء متعددة21.

في حين أن هذه الطرق الجديدة لديها إمكانات كبيرة لإنشاء خرائط تطورية مفصلة وعالية الدقة لتطور السرطان ، إلا أنها غير عملية للغاية بالنسبة لأولئك الذين يدرسون التوقيت الدقيق لأحداث بذر ورم خبيث وما الذي يعززها أو يمنعها. يعد سد هذه الفجوات المعرفية أمرا بالغ الأهمية لتحسين فهمنا وعلاجنا للسرطان النقيلي ، ولكن هناك نقص ملحوظ في التقنيات لتسهيل مثل هذه الدراسات. لتلبية هذه الحاجة ، قمنا مؤخرا بتطوير - ونقدم هنا - تقنية جديدة تسمح لنا بتحديد الخلايا السرطانية على وجه التحديد عن طريق التحويل الضوئي في موقع نقيلي (الرئة) ثم إعادة تحديدها لاحقا في الأعضاء الثالثة. باستخدام هذه التقنية ، أظهرنا مؤخرا أن خلايا سرطان الثدي تعيد الانتشار من نقائل الرئة والأعضاء الثالثيةللبذور 13. يمكن أيضا استخدام هذه التقنية لتحديد توقيت أحداث إعادة الانتشار ضمن نافذة ضيقة وتحديد كمية الخلايا السرطانية المعاد نشرها ، مما يسهل دراسة الانتحاء العضوي للخلايا المعاد نشرها وما يعزز / يمنع إعادة الانتشار.

في حين أن التحويل الضوئي وأنظمة cre / lox القابلة للحث محليا التي تستبدل بشكل دائم بروتين فلوري بآخر قد استخدمت سابقا لتمييز وتتبع الخلايا السرطانية11،22،23 ، على حد علمنا ، لم يتم تحسين أي نهج لوضع العلامات الزمانية المكانية للخلايا السرطانية لاستهداف الرئة - أحد أكثر مواقع ورم خبيث شيوعا بين الرجال والنساء الذين تم تشخيصهم بأي من أنواع السرطان ال 14 الأكثر شيوعا24. يمكن استخدام أي نوع من الخلايا السرطانية وأي بروتوكول لتوليد ورم خبيث في الرئة مع الإجراء الخاص بنا ، مما يجعله مفيدا على نطاق واسع للباحثين في ورم خبيث. يجب أن تعبر جميع الخلايا السرطانية المستخدمة لتوليد نقائل الرئة عن بروتين قابل للتحويل الضوئي أو قابل للتبديل الضوئي ، وقد يختار الباحثون البروتين الذي يجب استخدامه بناء على احتياجاتهم ومواردهم الخاصة. في هذه الدراسة ، استخدمنا خلايا سرطان الثدي 6DT1 التي عبرت بثبات عن البروتين الفلوري القابل للتحويل الضوئي من الأخضر إلى الأحمر Dendra2 (خلايا 6DT1-Dendra2) 25 الموسومة بهيستون H2B. قمنا بحقن 5.0 × 104 6DT1-Dendra2 خلايا في وسادة الدهون الثديية الرابعة لإناث الفئران Rag2-/- . كانت الأورام الأولية واضحة بين 12 و 16 يوما بعد الحقن ولم يتم استئصالها طوال مدة التجربة. تطورت النقائل الرئوية العفوية بين 19 و 26 يوما بعد حقن الخلايا السرطانية. تم إجراء جراحات التحويل الضوئي بين 26 و 29 يوما بعد حقن الخلايا السرطانية. تم التضحية بالفئران بعد 72 ساعة من الجراحة بسبب عبء ورم خبيث في الرئة.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح الخاصة باستخدام الفقارية ، بما في ذلك الموافقة المسبقة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام في كلية ألبرت أينشتاين للطب.

قبل الجراحة ، يجب إنشاء نقائل الرئة في الفئران باستخدام الخلايا السرطانية التي تعبر عن بروتين قابل للتحويل الضوئي / قابل للتبديل الضوئي. تم نشر العديد من البروتوكولات لتوليد ورم خبيث في الرئة26،27،28.

1. التحضير للجراحة

  1. إعداد مناطق عمل متميزة لإعداد الفئران (إزالة الشعر والتنبيب) والجراحة والتعافي.
  2. تعقيم جميع الأدوات الجراحية في الأوتوكلاف.
    ملاحظة: عند استخدام تقنية النصائح فقط لهذه الجراحة ، يمكن استخدام معقم بالخرز الساخن لإعادة تعقيم الأدوات للإجراءات اللاحقة.
  3. قم بتشغيل المنصة الجراحية الساخنة واتركها تصل وتستقر عند 37-40 درجة مئوية.
  4. حث التخدير مع 5 ٪ إيزوفلوران ، ثم خفض إيزوفلوران إلى 3 ٪. قم بإجراء اختبارات قرصة إصبع القدم بشكل دوري طوال العملية لتقييم مدى كفاية التخدير.
  5. ضع الفأر المخدر في وضع الاستلقاء الجانبي الأيمن. قم بإزالة شعر الجزء العلوي الأيسر من الصدر / الجسم الجانبي (انظر الشكل 1 أ) عن طريق وضع كريم مزيل الشعر على المنطقة. بلل قطعة من الشاش أو منشفة ورقية بالماء وامسح الشعر وكريم مزيل الشعر بعيدا. كرر حسب الضرورة حتى تتم إزالة كل الشعر من المجال الجراحي.
    ملاحظة: لا تترك كريم مزيل الشعر على الماوس لمدة تزيد عن 20 ثانية ، لأن ذلك قد يؤدي إلى تلف الجلد.
  6. اربط عقدة مزدوجة ~ 3 مم فوق قاعدة قسطرة 22 جم مع خياطة حريرية 2-0. اترك ذيول بطول 2 بوصة.
  7. تنبيب الماوس مع هذه القسطرة كما هو موضح سابقا 29,30. لتأكيد نجاح التنبيب ، قم بتوصيل لمبة نفخ بنهاية القسطرة واضغط برفق.
    ملاحظة: الفئران التي تم تنبيبها بنجاح ستشهد ارتفاعا ثنائيا في الصدر مع ضغط المصباح.
  8. قم بتأمين الخيط الحريري 2-0 بإحكام حول خطم الماوس بعقدة مزدوجة للحفاظ على قسطرة التنبيب في مكانها.

2. جراحة لفضح الرئة

ملاحظة: قم بإجراء جميع خطوات الجراحة (الشكل 1) ، بما في ذلك التحويل الضوئي ، في غطاء محرك السيارة أو خزانة التدفق الصفحي لتجنب تلوث المجال الجراحي.

  1. اغسل يديك بالصابون المطهر وارتد قفازات معقمة جديدة.
    ملاحظة: عند استخدام تقنية النصائح فقط لهذه الجراحة ، يمكن أيضا استخدام قفازات غير معقمة. يوصى بتعقيم القفازات غير المعقمة بمطهر كحولي.
  2. تحضير جرعة 0.1 ملغ/كغ من البوبرينورفين (0.03 ملغ/مل) وحقنه تحت الجلد للتسكين.
    ملاحظة: يجب استخدام التسكين متعدد الوسائط ، بما في ذلك حاصرات الألم المحلية والعقاقير المضادة للالتهابات غير الستيرويدية ، جنبا إلى جنب مع البوبرينورفين إذا لم يكن من المتوقع أن تتداخل مع البيولوجيا ذات الأهمية.
  3. ضع مرهما للعيون على كلتا عيني الفأر لمنع تلف القرنية.
  4. ضع الماوس في موضع الاستلقاء الجانبي الأيمن على المنصة الجراحية الساخنة.
  5. قم بتوصيل جهاز التنفس الصناعي بقسطرة التنبيب. احرص على تثبيت القسطرة ، حتى الحركات الطفيفة يمكن أن تزعج وضع القسطرة وتؤدي إلى سوء التهوية.
  6. راقب ارتفاع وانخفاض الصدر الثنائي المستقر الذي يتحكم فيه جهاز التنفس الصناعي.
  7. ثبت الأطراف على المنصة الجراحية بشريط لاصق. تثبيت المجال الجراحي عن طريق وضع قطعة أخرى من الشريط على طول ظهر الفأر وتأمين الجلد الظهري والفراء إلى المنصة الجراحية (الشكل 1 أ).
  8. افتح الأدوات الجراحية المعقمة.
  9. ضع محلول الكلورهيكسيدين على جلد الفأر لتعقيم موقع الجراحة.
  10. حدد المنطقة ~ 7 مم على يسار القص و ~ 7 مم فوق الهامش تحت الضلعي. ارفع الجلد فوق هذه المنطقة بالملقط وقم بعمل شق دائري ~ 10 مم باستخدام مقص تشريح دقيق حاد ، مع الحرص على قطع الجلد فقط.
  11. قم بإزالة الأنسجة الرخوة فوق القفص الصدري (الشكل 1 ب). قم بكي أي أوعية رئيسية في كلا الطرفين بقلم الكي.
    ملاحظة: بالإضافة إلى استئصال جميع الأنسجة الرخوة الكامنة وراء الشق الدائري 10 مم في الجلد ، فإن إزالة بعض الأنسجة الرخوة غير العضلية الإضافية من المحيط يسهل الخطوات المستقبلية للإجراء.
  12. بيد واحدة ، استخدم ملقطلرفع الضلع 6 أو 7. من ناحية أخرى ، استخدم شفرة واحدة من مقص التشريح الدقيق الحاد - بزاوية موازية لجدار الصدر ، وحافة مستديرة متجهة لأسفل - واخترق بعناية العضلةالوربية 6 أو 7 لدخول التجويف الصدري (الشكل 1C). قم بتدوير المقص برفق حسب الحاجة وقطعه لعمل شق ~ 10 مم في الفضاء الوربي ، مع الحرص على تجنب لمس أنسجة الرئة وقطع الأضلاع.
  13. قم بتفريغ الهواء المضغوط بدقة نحو الشق الوربي لزيادة المسافة بين الرئة وجدار الصدر. قم بتفريغ الهواء أولا عند الرسغ أو اليد للعثور على قوة التدفق المناسبة وتنظيف الفوهة من أي حطام ، ثم في دفعات قصيرة عند الشق لمنع إصابة الرئة.
  14. بيد واحدة ، استخدم ملقطلرفع الضلع 6 أو 7. من ناحية أخرى ، أمسك المبعدة مغلقا وأدخله في الشق الوربي. قم بتوجيه شفرات المبعدة بحيث تكون موازية لجدار الصدر ، مع الحرص على تجنب لمس الرئة نفسها (الشكل 1 د).
  15. بمجرد وضع المبعدة في مكانها ، حرر المقبض ببطء ، مما يسمح للضامد بفتح الرئة وكشفها (الشكل 1E). يوضح الشكل 2 أ صورا تمثيلية لنقائل الرئة المكشوفة قبل التحويل الضوئي ، بما في ذلك شكلها بالعين المجردة ، وفي قنوات الفلورسنت FITC (الخضراء ، غير المحولة ضوئيا) و TRITC (الأحمر ، المحول ضوئيا) أثناء استخدام الإضاءة واسعة المجال.

3. التحويل الضوئي لورم خبيث في الرئة

ملاحظة: يمكن العثور على التفاصيل والاختلافات في الخطوات التالية في المناقشة.

  1. ضع برفق 2-3 قطرات من برنامج تلفزيوني معقم بدرجة حرارة 37 درجة مئوية على أنسجة الرئة المكشوفة لمنع الجفاف.
  2. ضع قطعة من رقائق الألومنيوم المعقمة مع فتحة صغيرة فوق الماوس. ضع الفتحة مباشرة فوق أنسجة الرئة المكشوفة وقم بحجمها لكشف الجزء المفتوح فقط من الصدر وبضعة ملليمترات من الأنسجة الرخوة المحيطة والجلد لضمان التحويل الضوئي للرئة المكشوفة فقط.
  3. ضع صندوقا به فتحة فوق الماوس وورق الألمنيوم. تأكد من أن الفتحة فوق الرئة المكشوفة مباشرة.
  4. ضع مصباح التحويل الضوئي مباشرة فوق الفتحة الموجودة على الصندوق (الشكل 1F).
  5. قم بتشغيل مصباح التحويل الضوئي واترك 6 دقائق من الإضاءة المستمرة لأنسجة الرئة المكشوفة.
    ملاحظة: راقب العلامات الحيوية للفأر باستخدام برامج المراقبة الفسيولوجية على جهاز التنفس الصناعي.
  6. بعد التحويل الضوئي ، أطفئ المصباح وأزل المصباح والصندوق وقناع رقائق الألومنيوم من الماوس.

4. إجراء لإغلاق جدار الصدر

  1. كرر الخطوة 2.13 لفصل الرئة عن جدار الصدر.
  2. أمسك بمقبض الضامن بعناية واضغط لإغلاق الشفرات.
  3. قم بمناورة المبعدة المغلقة خارج الفضاء الوربي ، مع الحرص على تجنب لمس أنسجة الرئة.
  4. باستخدام الخيط الحريري 5-0 ، أغلق الشق الوربي بنمط خياطة بسيط مستمر يتضمن الضلع على جانبي الشق (الشكل 1 ج). اسحب الخيط بإحكام للتأكد من أن حواف الجرح موضعية وإعادة تأسيس سلامة جدار الصدر (الشكل 1H). احرص على عدم الإفراط في شد الخيط لأن هذا قد يمزق العضلات الوربية.
  5. قم بتأمين الخيط عن طريق ربط طرفي الخيط معا 4x. قطع ذيول خياطة أقرب ما يمكن عقدة.
  6. أغلق الجلد بدبابيس جراحية.
  7. قم بإزالة الهواء الزائد من التجويف الصدري باستخدام حقنة أنسولين سعة 1 مل مع إبرة 28 جم متصلة. حدد موقع عملية الخنجري عن طريق اللمس ، وأدخل الإبرة أدناه مباشرة ، متقدما نحو الكتف الأيسر لدخول التجويف الصدري من خلال الحجاب الحاجز. اسحب المحقنة إلى ~ 1 مل ؛ أخرج الإبرة من الماوس وتفريغ الهواء من المحقنة. كرر هذه العملية 3-4x.
    ملاحظة: احرص على عدم ثقب أي أعضاء داخلية. علاوة على ذلك ، من المهم استخدام حقنة سعة 1 مل وتكرار الإجراء 3-4x بدلا من استخدام حقنة أكبر حجما ومحاولة إزالة كل الهواء مرة واحدة. قد يؤدي استخدام حقنة أكبر حجما إلى فراغ كبير جدا في التجويف الصدري ويؤدي إلى انتفاخ أنسجة الرئة وتلفها.
  8. قم بإيقاف تشغيل الأيزوفلوران.
  9. استمر في التهوية بالأكسجين بنسبة 100٪ حتى يظهر الماوس علامات الاستيقاظ.
  10. بمجرد أن يظهر الفأر علامات الاستيقاظ ، افصل قسطرة التنبيب عن جهاز التنفس الصناعي ، واقطع الخيط حول الخطم ، وقم بنزع أنبوب الماوس.
  11. قم بفك الماوس ونقله إلى قفص نظيف يوضع ~ 2 قدم تحت مصباح حراري. راقب حتى يتعافى تماما. إذا أظهر الفأر علامات صعوبة في التنفس أو قلة الحركة ، فقم بتخديره بنسبة 5٪ إيزوفلوران لمدة 5 دقائق ، وتأكد من التخدير الكافي من خلال ملاحظة فقدان ردود الفعل عند قرصة إصبع القدم ، والقتل الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم.
  12. بمجرد أن يستيقظ الفأر تماما من التخدير ويبدأ في التحرك ، قم بإعداد جرعة أخرى 0.1 مجم / كجم من البوبرينورفين وحقنها تحت الجلد لتسكين ما بعد الجراحة.
  13. بعد الجراحة ، تأكد من إيواء الفئران بشكل فردي. توفير المضادات الحيوية في مياه الشرب (إينروفلوكساسين ، التركيز النهائي 0.4 ملغ / مل).
  14. في 3 أيام بعد الجراحة ، افحص الماوس مرتين يوميا بحثا عن علامات الضيق. للتحكم في الألم، يتم تطبيق 0.1 ملغ/ كغ من البوبرينورفين (0.03 ملغ/مل) تحت الجلد كل 4-6 ساعات. القتل الرحيم للفأر إذا ظهرت عليه علامات العدوى أو الجمود أو صعوبة التنفس. بعد اليوم الثالث ، يمكن فحص الفئران مرة واحدة في اليوم.

5. معالجة العينات والكشف عن الخلايا المحولة ضوئيا باستخدام إزالة الأنسجة

  1. بين 3 و 5 أيام (أو المدة الزمنية المطلوبة) بعد جراحة التحويل الضوئي ، قم بتخدير الفأر بنسبة 5٪ إيزوفلوران ، وتقليل الأيزوفلوران من 5٪ إلى 2.5٪ بعد الحث ، وضمان التخدير الكافي من خلال ملاحظة فقدان ردود الفعل عند قرصة إصبع القدم ، وإجراء نضح نهائي عبر القلب مع 10 مل من PBS بدرجة حرارة الغرفة ، تليها 10 مل من 4٪ بارافورمالدهيد مبرد إلى 4 درجات مئوية كما هو موضح سابقا31.
  2. جمع الأجهزة ذات الأهمية ومسحها بصريا كما هو موضح سابقا31.
  3. صور الأنسجة التي تم تطهيرها باستخدام مجهر ورقة ضوئية كما هو موضح سابقا31. بدلا من ذلك ، ضع الأنسجة التي تم تطهيرها في طبق زجاجي سفلي وصورة في قنوات FITC و TRITC لتصور الخلايا الخضراء (غير المحولة ضوئيا) والحمراء (المحولة ضوئيا) باستخدام مجهر متحد البؤري أو قرص دوار أو مجهر متعدد الفوتونات.

6. معالجة العينات والكشف عن الخلايا المحولة ضوئيا باستخدام تصنيف الأنسجة

  1. تخدير الفأر باستخدام 5٪ إيزوفلوران لمدة 5 دقائق ، وضمان التخدير الكافي من خلال ملاحظة فقدان ردود الفعل عند قرصة إصبع القدم ، والتضحية عن طريق خلع عنق الرحم بعد 3-5 أيام من التحويل الضوئي.
  2. جمع وهضم الأجهزة ذات الاهتمام كما هو موضح سابقا13.
  3. صفيحة الأنسجة المهضومة ووضعها في حاضنة للالتصاق طوال الليل كما هو موضح سابقا13.
  4. في اليوم التالي ، قم بتصوير الخلايا المطلية في قنوات FITC و TRITC لتصور الخلايا الخضراء (غير المحولة ضوئيا) والحمراء (المحولة ضوئيا) كما هو موضح سابقا13.

النتائج

يوضح الشكل 1 خطوات الجراحة الموصوفة في هذا البروتوكول. باختصار ، يتم تخدير الماوس ، ويتم إزالة الشعر من الصدر الأيسر. ثم يتم تنبيب الفأر وتهويته ، مما يسمح للفأر بتلقي الأكسجين أثناء فتح التجويف الصدري. تتم إزالة الأنسجة الرخوة لفضح القفص الصدري ، ويتم إجراء شق في العضلة ال?...

Discussion

في هذه الورقة ، نصف بروتوكولا جراحيا للتحويل الضوئي الانتقائي للخلايا السرطانية في الرئة. تمكن هذه التقنية الباحثين من تحديد الخلايا السرطانية في الرئة بشكل انتقائي وتتبع مصيرها عن طريق إعادة تحديدها في جميع أنحاء الجسم في وقت لاحق ، مما يسهل دراسة ورم خبيث من نقائل الرئة. باستخدام هذا ال...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgements

يود المؤلفون أن يشكروا Wade Koba على مساعدته في التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (S10RR029545) ، وفيرا ديسماريه وهيلاري جوزيك من مرفق التصوير التحليلي لتدريبهم ومساعدتهم في الفحص المجهري ، ومركز أينشتاين مونتيفيوري للسرطان ، والمعهد الوطني للسرطان (P30CA013330 ، R01CA21248 ، R01CA255153) ، ومركز جروس ليبر للفوتونات الحيوية ، وبرنامج التصوير المتكامل لأبحاث السرطان ، زمالة السير هنري ويلكوم لما بعد الدكتوراه (221647 / Z / 20 / Z) ، وجائزة METAvivor للتطوير الوظيفي.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0-30 V, 0-3 A Power SupplyMPJA9616 PS
12 VDC, 1.2 A Unregulated Plug SupplyMPJA17563 PD
28 G 1 mL BD Insulin SyringeBD329410
400 nm light emitting diode array lampLedEngin Inc.897-LZPD0UA00Photoconversion lamp, custom-built (individual parts included below)
5-0 braided silk suture with RB-1 cutting needleEthicon, Inc.774B
9 cm 2-0 silk tieEthicon, Inc.LA55G
Baytril 100 (enrofloxacin)Bayer (Santa Cruz Biotechnology)sc-362890RxAntibiotic used in drinking water
BuprenorphineHospira0409-2012-32Analgesic
Cables (Cable Assemblies) 2.5 JK-ST 72" ZIP CDMouser172-0250
Chlorhexidine solutionDurvet7-45801-10258-3Chlorhexidine Disinfectant Solution
Compressed air canisterFalconDPSJB-12
Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mmRoboz SurgicalRS-5912Sharp Micro Dissecting Scissors
Fiber-optic illuminatorO.C. White CompanyFL3000Used during mouse intubation
Gemini Cautery KitHarvard Apparatus726067Cautery pen
Germinator 500CellPoint ScientificGER 5287-120VBead Sterilizer
Graefe forcepsRobozRS-5135
High power LEDs - single color ultraviolet 90 wattsMouserLZP-D0UA00
Infrared heat lampBraintree ScientificHL-1
Isoflurane SOL 250 mL PVLCovetrus29405Anesthetic
Isoflurane vaporizerSurgiVetVCT302
Jacobson needle holder with lockKalson SurgicalT1-140
Labeling tapeFisher ScientificS68702
LED Lighting Reflectors CREE MP-L SNGL LENS REFLECTOR & LOC PINMouser928-C11395TM
Long cotton tip applicatorsMedline IndustriesMDS202055
Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4/Celeron up to 3.4GHz / Ball Bearing / Copper Core / CPU Cooling FanCompUSA#S457-1023
Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/BluntRoboz SurgicalRS-5980Blunt Micro Dissecting Scissors
Murine ventilatorKent Scientific PS-02PhysioSuite
Nair Hair Removal LotionAmazonB001RVMR7KDepilatory cream
Personnet mini retractorRobozRS-6504Retractor
Phosphate Buffered Saline 1xFisher Scientific14190144PBS
pLenti.CAG.H2B-Dendra2.WAddgene51005Dendra2 lentivirus
PuralubeHenry Schein Animal Health008897Eye Lubricant
Rodent intubation standBraintree ScientificRIS 100
Small animal lung inflation bulbHarvard Apparatus72-9083
SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with WarmingKent ScientificSURGI-M02Heated surgical platform
Test Leads 48" TEST LEAD BANANA - BlackMouser565-1440-48-0
Test Leads 48" TEST LEAD BANANA - RedMouser565-1440-48-2
Tracheal catheter Exelint International2674622 G catheter
Wound closing system veterinary kitClay AdamsIN015Veterinary surgical stapling kit

References

  1. Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. Are 90% of deaths from cancer caused by metastases. Cancer Medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).
  2. Gupta, G. P., Massagué, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
  3. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature Reviews. Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  4. Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
  5. Liu, T., et al. Self-seeding circulating tumor cells promote the proliferation and metastasis of human osteosarcoma by upregulating interleukin-8. Cell Death & Disease. 10 (8), 575 (2019).
  6. Liu, H., et al. Tumor-derived exosomes promote tumor self-seeding in hepatocellular carcinoma by transferring miRNA-25-5p to enhance cell motility. Oncogene. 37 (36), 4964-4978 (2018).
  7. Kim, M. -. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
  8. Zhang, Y., et al. Tumor self-seeding by circulating tumor cells in nude mouse models of human osteosarcoma and a preliminary study of its mechanisms. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 140 (2), 329-340 (2014).
  9. Dondossola, E., Crippa, L., Colombo, B., Ferrero, E., Corti, A. Chromogranin A regulates tumor self-seeding and dissemination. Cancer Research. 72 (2), 449-459 (2012).
  10. Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
  11. Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
  12. Coste, A., et al. Hematogenous dissemination of breast cancer cells from lymph nodes is mediated by tumor microenvironment of metastasis doorways. Frontiers in Oncology. 10, 571100 (2020).
  13. Borriello, L., Condeelis, J., Entenberg, D., Oktay, M. H. Breast cancer cell re-dissemination from lung metastases-a mechanism for enhancing metastatic burden. Journal of Clinical Medicine. 10 (11), 2340 (2021).
  14. Ullah, I., et al. Evolutionary history of metastatic breast cancer reveals minimal seeding from axillary lymph nodes. The Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1355-1370 (2018).
  15. Gundem, G., et al. The evolutionary history of lethal metastatic prostate cancer. Nature. 520 (7547), 353-357 (2015).
  16. Brown, D., et al. Phylogenetic analysis of metastatic progression in breast cancer using somatic mutations and copy number aberrations. Nature Communications. 8, 14944 (2017).
  17. Kalhor, R., Mali, P., Church, G. M. Rapidly evolving homing CRISPR barcodes. Nature Methods. 14 (2), 195-200 (2017).
  18. Kalhor, R., et al. Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR. Science. 361 (6405), eaat9804 (2018).
  19. McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), aaf7907 (2016).
  20. Junker, J. P., et al. Massively parallel clonal analysis using CRISPR/Cas9 induced genetic scars. bioRxiv. , 056499 (2017).
  21. Zhang, W., et al. The bone microenvironment invigorates metastatic seeds for further dissemination. Cell. 184 (9), 2471.e20-2486.e20 (2021).
  22. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  23. Grau, N., et al. Spatiotemporally controlled induction of gene expression in vivo allows tracking the fate of tumor cells that traffic through the lymphatics. International Journal of Cancer. 147 (4), 1190-1198 (2020).
  24. Riihimäki, M., Thomsen, H., Sundquist, K., Sundquist, J., Hemminki, K. Clinical landscape of cancer metastases. Cancer Medicine. 7 (11), 5534-5542 (2018).
  25. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
  26. Zhang, G. -. L., Zhang, Y., Cao, K. -. X., Wang, X. -. M. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mice mammary fat pad. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
  27. Pavese, J., Ogden, I. M., Bergan, R. C. An orthotopic murine model of human prostate cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
  28. Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh, S. E., Sizemore, S. T. Pathological analysis of lung metastasis following lateral tail-vein injection of tumor cells. Journal of Visualized Experiments. (159), (2020).
  29. Das, S., MacDonald, K., Sucie Chang, h. -. y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318 (2013).
  30. DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).
  31. Hsu, C. -. W., et al. EZ Clear for simple, rapid, and robust mouse whole organ clearing. eLife. 11, e77419 (2022).
  32. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  33. Gambotto, A., et al. Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope. Gene Therapy. 7 (23), 2036-2040 (2000).
  34. Han, W. G. H., Unger, W. W. J., Wauben, M. H. M. Identification of the immunodominant CTL epitope of EGFP in C57BL/6 mice. Gene Therapy. 15 (9), 700-701 (2008).
  35. Stripecke, R., et al. Immune response to green fluorescent protein: implications for gene therapy. Gene Therapy. 6 (7), 1305-1312 (1999).
  36. Rosenzweig, M., et al. Induction of cytotoxic T lymphocyte and antibody responses to enhanced green fluorescent protein following transplantation of transduced CD34(+) hematopoietic cells. Blood. 97 (7), 1951-1959 (2001).
  37. Grzelak, C. A., et al. Elimination of fluorescent protein immunogenicity permits modeling of metastasis in immune-competent settings. Cancer Cell. 40 (1), 1-2 (2022).
  38. Fluegen, G., et al. Phenotypic heterogeneity of disseminated tumour cells is preset by primary tumour hypoxic microenvironments. Nature Cell Biology. 19 (2), 120-132 (2017).
  39. Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903.e14-1914.e14 (2019).
  40. Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A permanent window for investigating cancer metastasis to the lung. Journal of Visualized Experiments. (173), (2021).
  41. Tohme, S., Simmons, R. L., Tsung, A. Surgery for cancer: a trigger for metastases. Cancer Research. 77 (7), 1548-1552 (2017).
  42. Al-Sahaf, O., Wang, J. H., Browne, T. J., Cotter, T. G., Redmond, H. P. Surgical injury enhances the expression of genes that mediate breast cancer metastasis to the lung. Annals of Surgery. 252 (6), 1037-1043 (2010).
  43. Lu, N., Piao, M. -. H., Feng, C. -. S., Yuan, Y. Isoflurane promotes epithelial-to-mesenchymal transition and metastasis of bladder cancer cells through HIF-1α-β-catenin/Notch1 pathways. Life Sciences. 258, 118154 (2020).
  44. Jiao, B., et al. Relationship between volatile anesthetics and tumor progression: unveiling the mystery. Current Medical Science. 38 (6), 962-967 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved