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Resumo

Apresentamos um método para estudo da redisseminação de células tumorais a partir de metástases pulmonares envolvendo um protocolo cirúrgico para fotoconversão seletiva de metástases pulmonares, seguido da identificação de células tumorais redisseminadas em órgãos terciários.

Resumo

A metástase - a disseminação sistêmica do câncer - é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer. Embora a metástase seja comumente pensada como um processo unidirecional em que as células do tumor primário se disseminam e semeiam metástases, as células tumorais em metástases existentes também podem se redisseminare dar origem a novas lesões em sítios terciários, em um processo conhecido como "metástase de metástases" ou "semeadura de metástase para metástase". A semeadura de metástases para metástases pode aumentar a carga metastática e diminuir a qualidade de vida e a sobrevida do paciente. Portanto, compreender os processos por trás desse fenômeno é crucial para refinar as estratégias de tratamento de pacientes com câncer metastático.

Pouco se sabe sobre a semeadura de metástases para metástases, devido, em parte, a limitações logísticas e tecnológicas. Os estudos sobre a semeadura de metástases para metástases dependem principalmente de métodos de sequenciamento, o que pode não ser prático para os pesquisadores que estudam o momento exato dos eventos de semeadura de metástase para metástase ou o que os promove ou impede. Isso evidencia a falta de metodologias que facilitem o estudo da semeadura de metástases para metástases. Para resolver isso, desenvolvemos - e descrevemos aqui - um protocolo cirúrgico murino para a fotoconversão seletiva de metástases pulmonares, permitindo marcação específica e rastreamento do destino de células tumorais que se redisseminam do pulmão para sítios terciários. Até onde sabemos, este é o único método para estudar a redisseminação de células tumorais e a semeadura de metástases para metástases a partir dos pulmões que não requer análise genômica.

Introdução

Metástases são a principal causa de mortes relacionadas ao câncer1. O câncer metastático surge quando células do tumor primário se disseminam por todo o corpo e proliferam em tumores clinicamente detectáveis em órgãos distantes 2,3.

Embora a metástase seja comumente considerada como um processo unidirecional em que as células tumorais se disseminam a partir do tumor primário e colonizam órgãosdistantes4, evidências clínicas e experimentais crescentes sugerem que um processo multidirecional mais complexo está em jogo. Tem sido demonstrado que células tumorais circulantes podem resemear o tumor primário (se ainda existentes)5,6,7,8,9, e células tumorais de focos metastáticos existentes podem viajar para sítios terciários e dar origem a novas lesões10,11,12,13 . De fato, evidências de análises genômicas recentes sugerem que algumas lesões metastáticas não surgem do tumor primário, mas de outras metástases, fenômeno conhecido como "semeadura de metástases de metástases" ou "semeadura de metástase para metástase"14,15,16. A disseminação de metástases para metástases pode perpetuar o processo da doença mesmo após a remoção do tumor primário, aumentando a carga metastática e diminuindo a qualidade de vida e a sobrevida dos pacientes. Portanto, compreender os processos por trás da semeadura de metástase para metástase é crucial para refinar as estratégias de tratamento para pacientes com doença metastática.

Apesar das implicações clínicas potencialmente graves, pouco se sabe sobre a semeadura de metástases para metástases, devido, em parte, a limitações logísticas e tecnológicas. Os estudos em humanos são limitados pela escassez de amostras clínicas. A ressecção clínica e a biópsia de lesões metastáticas são incomuns, assim como a biópsia de órgãos aparentemente saudáveis, onde células tumorais disseminadas únicas podem se esconder. Isso significa que os estudos em humanos normalmente só são possíveis usando amostras de autópsia de indivíduos cujos tumores primários ainda estão em vigor ou foram ressecados anteriormente, mas ainda estão disponíveis para os pesquisadores. Quando essas amostras estão disponíveis, análises de linhagens da progressão do câncer devem ser realizadas por métodos desequenciamento14. No entanto, o sequenciamento em massa de tumores primários e metástases compatíveis não tem a sensibilidade necessária para o rastreamento abrangente da linhagem. Por exemplo, o sequenciamento em massa de uma lesão pode revelar um subclone que é indetectável em qualquer uma de suas lesões pareadas. Nesse caso, não seria possível determinar a origem desse subclone. Pode estar presente no tumor primário ou em outra metástase com frequência abaixo do limite de detecção, ou pode ter surgido após a colonização inicial da lesão metastática em que foi encontrado. O sequenciamento unicelular proporciona maior sensibilidade, mas seu alto custo limita a aplicação em larga escala dessa técnica. A natureza retrospectiva desses estudos também significa que eles fornecem informações limitadas sobre eventos metastáticos transitórios e o cenário da doença em diferentes pontos de tempo.

Em modelos animais, avanços tecnológicos recentes permitem o mapeamento filogenético prospectivo com alta resolução espacial e temporal 17,18,19,20. Essas técnicas utilizam a edição do genoma CRISPR/Cas9 para projetar células com um código de barras em evolução - mutações hereditárias que se acumulam ao longo do tempo. Após o sequenciamento, a linhagem de cada célula pode ser traçada com base no perfil mutacional de seu código de barras 17,18,19,20. De fato, essa tecnologia já está sendo usada para mapear a semeadura de metástase para metástase. Em trabalho recente, Zhang e col. demonstraram que células de câncer de mama e próstata em metástases ósseas se redisseminam do osso para semear metástases secundárias em múltiplosórgãos21.

Embora esses novos métodos tenham grande potencial para gerar mapas filogenéticos detalhados e de alta resolução da progressão do câncer, eles são altamente impraticáveis para aqueles que estudam o momento exato dos eventos de semeadura de metástase para metástase e o que os promove ou impede. Preencher essas lacunas de conhecimento é crucial para refinar nossa compreensão e tratamento do câncer metastático, mas há uma notável falta de tecnologias para facilitar tais estudos. Para atender a essa necessidade, desenvolvemos recentemente - e apresentamos aqui - uma nova técnica que nos permite marcar especificamente células tumorais via fotoconversão em um sítio metastático (o pulmão) e, posteriormente, reidentificá-las em órgãos terciários. Recentemente, com essa técnica, demonstramos que células de câncer de mama se redisseminam a partir de metástases pulmonares e de órgãos terciários desementes13. Esta técnica também pode ser utilizada para determinar o momento dos eventos de redisseminação dentro de uma janela estreita e quantificar as células tumorais redisseminadas, facilitando o estudo do organotropismo das células redisseminadas e o que promove/impede a redisseminação.

Embora a fotoconversão e os sistemas cre/lox localmente induzíveis que substituem permanentemente uma proteína fluorescente por outra tenham sido usados anteriormente para marcar e rastrear células tumorais11,22,23, até onde sabemos, nenhuma abordagem para marcação espaço-temporal de células tumorais foi otimizada para atingir o pulmão - um dos sítios mais comuns de metástase entre homens e mulheres diagnosticados com qualquer um dos 14 cânceres mais comuns24. Qualquer tipo de célula cancerosa e qualquer protocolo para geração de metástases pulmonares podem ser usados com nosso procedimento, tornando-o amplamente útil para pesquisadores de metástases. Todas as células cancerosas usadas para gerar metástases pulmonares devem expressar uma proteína fotoconversível ou fotocomutável, e os pesquisadores podem escolher qual proteína usar com base em suas necessidades e recursos específicos. Neste estudo, usamos 6DT1 células de câncer de mama que expressaram de forma estável a proteína fluorescente fotoconversível verde-vermelho Dendra2 (células 6DT1-Dendra2)25 marcadas com a histona H2B. Foram injetadas 5,0 × 104 células 6DT1-Dendra2 no quarto coxim gorduroso mamário de fêmeas de camundongos Rag2-/-. Os tumores primários foram palpáveis entre 12 e 16 dias após a injeção e não foram ressecados durante todo o experimento. Metástases pulmonares espontâneas se desenvolveram entre 19 e 26 dias após a injeção de células tumorais. As cirurgias de fotoconversão foram realizadas entre 26 e 29 dias após a injeção das células tumorais. Os camundongos foram sacrificados 72 h após a cirurgia devido à carga de metástases pulmonares.

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Protocolo

Todos os procedimentos descritos neste protocolo foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos para o uso de animais vertebrados, incluindo a aprovação prévia pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina Albert Einstein.

Antes da cirurgia, as metástases pulmonares devem ser geradas em camundongos usando células cancerosas que expressam uma proteína fotoconversível/fotocomutável; Vários protocolos para geração de metástases pulmonares foram publicados 26,27,28.

1. Preparo para a cirurgia

  1. Prepare áreas de trabalho distintas para preparação de camundongos (depilação e intubação), cirurgia e recuperação.
  2. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos em autoclave.
    NOTA: Como uma técnica somente de pontas é usada para esta cirurgia, um esterilizador de esferas quentes pode ser usado para reesterilizar instrumentos para procedimentos subsequentes.
  3. Ligue a plataforma cirúrgica aquecida e deixe-a alcançar e estabilizar a 37-40 °C.
  4. Induzir anestesia com isoflurano a 5% e, em seguida, baixar o isoflurano para 3%. Realizar testes de pinça dos dedos dos pés periodicamente durante todo o procedimento para avaliar a adequação da anestesia.
  5. Coloque o camundongo anestesiado em decúbito lateral direito. Remova os pelos da parte superior esquerda do tórax/corpo lateral (ver Figura 1A) aplicando creme depilatório na área. Umedeça um pedaço de gaze ou papel toalha com água e limpe o cabelo e o creme depilatório. Repita conforme necessário até que todo o cabelo seja removido do campo cirúrgico.
    NOTA: Não deixe o creme depilatório no mouse por mais de 20 s, pois isso pode danificar a pele.
  6. Amarre um nó duplo ~3 mm acima da base de um cateter 22G com fio de seda 2-0. Deixe caudas de 2 polegadas de comprimento.
  7. Intubar o camundongo com esse cateter conforme previamente descrito29,30. Para confirmar o sucesso da intubação, conecte um bulbo de insuflação na extremidade do cateter e aperte suavemente.
    NOTA: Camundongos que foram intubados com sucesso experimentarão elevação torácica bilateral com aperto de bulbo.
  8. Fixe firmemente a sutura de seda 2-0 ao redor do focinho do rato com um nó duplo para manter o cateter de intubação no lugar.

2. Cirurgia para exposição do pulmão

OBS: Realizar todas as etapas da cirurgia (Figura 1), inclusive a fotoconversão, em capuz ou gabinete de fluxo laminar para evitar contaminação do campo cirúrgico.

  1. Lave as mãos com sabão antisséptico e use luvas estéreis novas.
    NOTA: Como uma técnica somente de pontas é usada para esta cirurgia, luvas não estéreis também podem ser usadas. Recomenda-se higienizar luvas não estéreis com um desinfetante à base de álcool.
  2. Preparar uma dose de 0,1 mg/kg de buprenorfina (0,03 mg/mL) e injetar por via subcutânea para analgesia.
    NOTA: A analgesia multimodal, incluindo bloqueadores da dor locais e anti-inflamatórios não esteroides, deve ser usada em conjunto com a buprenorfina se não se espera que interfiram com a biologia de interesse.
  3. Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos de camundongo para evitar danos na córnea.
  4. Posicionar o camundongo em decúbito lateral direito sobre a plataforma cirúrgica aquecida.
  5. Conecte o ventilador ao cateter de intubação. Tome cuidado para manter o cateter estável, pois mesmo pequenos movimentos podem atrapalhar o posicionamento do cateter e levar a uma ventilação deficiente.
  6. Observar elevação e queda torácica bilateral, estável e controlada pelo ventilador.
  7. Fixar os membros à plataforma cirúrgica com fita adesiva. Estabilizar o campo cirúrgico colocando outro pedaço de fita ao longo do dorso do camundongo e prendendo a pele dorsal e a pele à plataforma cirúrgica (Figura 1A).
  8. Abra os instrumentos cirúrgicos esterilizados.
  9. Aplicar solução de clorexidina na pele do rato para esterilizar o sítio cirúrgico.
  10. Identificar a área ~7 mm à esquerda do esterno e ~7 mm acima do rebordo subcostal. Levante a pele sobre esta área com pinça e faça uma incisão circular de ~10 mm usando uma tesoura microdissecante afiada, tomando o cuidado de cortar apenas a pele.
  11. Retirar o tecido mole sobre a caixa torácica (Figura 1B). Cauterizar os vasos principais em ambas as extremidades com uma caneta cauterizada.
    NOTA: Além de excisar todo o tecido mole subjacente à incisão circular de 10 mm na pele, a remoção de algum tecido mole não muscular adicional do perímetro facilita as etapas futuras do procedimento.
  12. Com uma mão, use pinças para elevar a6ª ou7ª costela. Por outro lado, utilizar uma única lâmina da tesoura romba microdissecante - angulada paralela à parede torácica, borda arredondada voltada para baixo - e perfurar cuidadosamente o6º ou7º músculo intercostal para entrar na cavidade torácica (Figura 1C). Gire suavemente a tesoura conforme necessário e corte para fazer uma incisão de ~10 mm no espaço intercostal, tomando cuidado para evitar tocar o tecido pulmonar e cortar as costelas.
  13. Descarregar delicadamente ar comprimido em direção à incisão intercostal para aumentar o espaço entre o pulmão e a parede torácica. Descarregar o ar primeiro no pulso ou na mão para encontrar a força de fluxo adequada e limpar o bico de quaisquer detritos, depois em rajadas curtas na incisão para evitar lesões pulmonares.
  14. Com uma mão, use pinças para elevar a6ª ou7ª costela. Com a outra mão, segure o afastador fechado e insira-o na incisão intercostal. Orientar as lâminas do espaçador de forma que fiquem paralelas à parede torácica, tomando cuidado para não tocar o próprio pulmão (Figura 1D).
  15. Uma vez instalado o afastador, solte lentamente a alça, permitindo que o afastador abra e exponha o pulmão (Figura 1E). A Figura 2A mostra imagens representativas de metástases pulmonares expostas antes da fotoconversão, incluindo sua aparência a olho nu, e nos canais fluorescentes FITC (verde, não fotoconvertido) e TRITC (vermelho, fotoconvertido) usando iluminação de campo amplo.

3. Fotoconversão de metástases pulmonares

Observação : detalhes e variações sobre as etapas a seguir podem ser encontrados na discussão.

  1. Aplique suavemente 2-3 gotas de PBS estéril aquecido a 37 °C no tecido pulmonar exposto para evitar a secagem.
  2. Coloque um pedaço de papel alumínio estéril com um pequeno recorte sobre o mouse. Posicione o recorte diretamente sobre o tecido pulmonar exposto e dimensione-o para expor apenas a porção aberta do tórax e alguns milímetros de tecido mole circundante e pele para garantir a fotoconversão apenas do pulmão exposto.
  3. Coloque uma caixa com um recorte sobre o mouse e papel alumínio. Certifique-se de que o recorte esteja diretamente sobre o pulmão exposto.
  4. Coloque a lâmpada de fotoconversão diretamente sobre o recorte da caixa (Figura 1F).
  5. Ligue a lâmpada de fotoconversão e permita 6 min de iluminação contínua do tecido pulmonar exposto.
    NOTA: Monitore os sinais vitais do mouse usando os programas de monitoramento fisiológico no ventilador.
  6. Após a fotoconversão, desligue a lâmpada e remova a lâmpada, a caixa e a máscara de folha de alumínio do mouse.

4. Procedimento para fechamento da parede torácica

  1. Repetir o passo 2.13 para separar o pulmão da parede torácica.
  2. Segure cuidadosamente a alça do afastador e aperte para fechar as lâminas.
  3. Manobrar o afastador fechado para fora do espaço intercostal, tomando cuidado para não tocar o tecido pulmonar.
  4. Com fio de seda 5-0, fechar a incisão intercostal com um padrão de sutura simples e contínua que incorpora a costela em ambos os lados da incisão (Figura 1G). Puxe a sutura com força para garantir que as bordas da ferida sejam aposicionais e restabelecer a integridade da parede torácica (Figura 1H). Tome cuidado para não apertar demais a sutura, pois isso pode rasgar os músculos intercostais.
  5. Fixar a sutura amarrando as duas extremidades da sutura juntas 4x. Corte a cauda da sutura o mais próximo possível do nó.
  6. Feche a pele com grampos cirúrgicos.
  7. Retire o excesso de ar da cavidade torácica com uma seringa de insulina de 1 mL com uma agulha de 28 G acoplada. Localize o processo xifoide tactilmente e insira a agulha logo abaixo, avançando em direção ao ombro esquerdo para entrar na cavidade torácica através do diafragma. Retirar a seringa para ~1 mL; Retire a agulha do rato e descarregue o ar da seringa. Repita este processo 3-4x.
    OBS: Tome cuidado para não perfurar nenhum órgão interno. Além disso, é importante usar uma seringa de 1 mL e repetir o procedimento 3-4x em vez de usar uma seringa de maior volume e tentar remover todo o ar de uma só vez. O uso de uma seringa de maior volume pode resultar em um vácuo muito grande na cavidade torácica e levar à distensão e danos ao tecido pulmonar.
  8. Desligue o isoflurano.
  9. Continue a ventilação com oxigênio a 100% até que o camundongo mostre sinais de despertar.
  10. Quando o mouse mostrar sinais de despertar, desconecte o cateter de intubação do ventilador, corte a sutura ao redor do focinho e extube o camundongo.
  11. Destape o mouse e transfira-o para uma gaiola limpa colocada ~2 pés abaixo de uma lâmpada de calor. Monitore até que esteja totalmente recuperado. Se o camundongo apresentar sinais de dificuldade respiratória ou falta de mobilidade, anestesiar-se com isoflurano a 5% por 5 min, garantir anestesia adequada observando perda de reflexos ao pinçar os dedos dos pés e sacrificar por luxação cervical.
  12. Assim que o camundongo acordar completamente da anestesia e começar a se mover, prepare outra dose de 0,1 mg/kg de buprenorfina e injete-a por via subcutânea para analgesia pós-operatória.
  13. Após a cirurgia, certifique-se de que os ratos sejam alojados individualmente. Fornecer antibióticos na água potável (enrofloxacina, concentração final 0,4 mg/mL).
  14. Nos 3 dias seguintes à cirurgia, verifique o rato duas vezes por dia em busca de sinais de angústia. Para o controle da dor, administrar 0,1 mg/kg de buprenorfina (0,03 mg/mL) por via subcutânea a cada 4-6 horas. Eutanasie o rato se ele mostrar sinais de infecção, imobilidade ou dificuldade respiratória. Após o terceiro dia, os ratos podem ser verificados uma vez por dia.

5. Processamento de amostras e detecção de células fotoconvertidas usando limpeza de tecidos

  1. Entre 3 e 5 dias (ou o tempo desejado) após a cirurgia de fotoconversão, anestesiar o camundongo com isoflurano a 5%, reduzir o isoflurano de 5% para 2,5% após a indução, assegurar anestesia adequada observando perda dos reflexos ao pinçar os dedos dos pés e realizar perfusão transcárdica terminal com 10 mL de PBS à temperatura ambiente, seguido de 10 mL de paraformaldeído a 4% resfriado a 4 °C, conforme descrito anteriormente31.
  2. Coletar os órgãos de interesse e limpá-los opticamente conforme descrito anteriormente31.
  3. Obtenha imagens dos tecidos clareados com um microscópio de lâmina de luz, conforme descrito anteriormente31. Alternativamente, coloque os tecidos limpos em uma placa de fundo de vidro e imagem nos canais FITC e TRITC para visualizar células verdes (não fotoconvertidas) e vermelhas (fotoconvertidas) usando um microscópio confocal, disco giratório ou microscópio multifóton.

6. Processamento de amostras e detecção de células fotoconvertidas usando desagregação tecidual

  1. Anestesiar o camundongo com isoflurano a 5% por 5 min, garantir anestesia adequada observando perda de reflexos ao pinçar os dedos e sacrificar via luxação cervical 3-5 dias após a fotoconversão.
  2. Coletar e digerir os órgãos de interesse conforme descrito anteriormente13.
  3. Plaquear os tecidos digeridos e colocá-los em uma incubadora para aderir durante a noite, como descrito anteriormente13.
  4. No dia seguinte, obter imagens das células plaqueadas nos canais FITC e TRITC para visualizar as células verdes (não fotoconvertidas) e vermelhas (fotoconvertidas), conforme descrito anteriormente13.

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Resultados

Os passos da cirurgia descritos neste protocolo estão ilustrados na Figura 1. Em resumo, o camundongo é anestesiado e os pelos são removidos do tórax esquerdo. O camundongo é então intubado e ventilado, o que permite que o camundongo receba oxigênio enquanto a cavidade torácica está aberta. O tecido mole é removido para expor a caixa torácica, e uma incisão é feita no6º ou7º músculo intercostal. Um afastador é inserido na brecha intercostal e liberado p...

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Discussão

Neste trabalho, descrevemos um protocolo cirúrgico para a fotoconversão seletiva de células tumorais no pulmão. Essa técnica permite que os pesquisadores marquem seletivamente as células tumorais no pulmão e rastreiem seu destino, reidentificando-as em todo o corpo em um momento posterior, facilitando o estudo de metástases de metástases pulmonares. Com esse protocolo, foi possível visualizar células fotoconvertidas no cérebro, fígado e pulmão direito não fotoconvertido de camundongos submetidos à cirurgi...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer a Wade Koba por sua assistência com microtomografia computadorizada (S10RR029545), Vera DesMarais e Hillary Guzik do Analytical Imaging Facility por seu treinamento e assistência com microscopia, ao Einstein Montefiore Cancer Center, ao National Cancer Institute (P30CA013330, R01CA21248, R01CA255153), ao Gruss Lipper Biophotonics Center, ao Integrated Imaging Program for Cancer Research, uma bolsa de pós-doutorado Sir Henry Wellcome (221647/Z/20/Z) e um Prêmio METAvivor de Desenvolvimento de Carreira.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
0-30 V, 0-3 A Power SupplyMPJA9616 PS
12 VDC, 1.2 A Unregulated Plug SupplyMPJA17563 PD
28 G 1 mL BD Insulin SyringeBD329410
400 nm light emitting diode array lampLedEngin Inc.897-LZPD0UA00Photoconversion lamp, custom-built (individual parts included below)
5-0 braided silk suture with RB-1 cutting needleEthicon, Inc.774B
9 cm 2-0 silk tieEthicon, Inc.LA55G
Baytril 100 (enrofloxacin)Bayer (Santa Cruz Biotechnology)sc-362890RxAntibiotic used in drinking water
BuprenorphineHospira0409-2012-32Analgesic
Cables (Cable Assemblies) 2.5 JK-ST 72" ZIP CDMouser172-0250
Chlorhexidine solutionDurvet7-45801-10258-3Chlorhexidine Disinfectant Solution
Compressed air canisterFalconDPSJB-12
Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mmRoboz SurgicalRS-5912Sharp Micro Dissecting Scissors
Fiber-optic illuminatorO.C. White CompanyFL3000Used during mouse intubation
Gemini Cautery KitHarvard Apparatus726067Cautery pen
Germinator 500CellPoint ScientificGER 5287-120VBead Sterilizer
Graefe forcepsRobozRS-5135
High power LEDs - single color ultraviolet 90 wattsMouserLZP-D0UA00
Infrared heat lampBraintree ScientificHL-1
Isoflurane SOL 250 mL PVLCovetrus29405Anesthetic
Isoflurane vaporizerSurgiVetVCT302
Jacobson needle holder with lockKalson SurgicalT1-140
Labeling tapeFisher ScientificS68702
LED Lighting Reflectors CREE MP-L SNGL LENS REFLECTOR & LOC PINMouser928-C11395TM
Long cotton tip applicatorsMedline IndustriesMDS202055
Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4/Celeron up to 3.4GHz / Ball Bearing / Copper Core / CPU Cooling FanCompUSA#S457-1023
Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/BluntRoboz SurgicalRS-5980Blunt Micro Dissecting Scissors
Murine ventilatorKent Scientific PS-02PhysioSuite
Nair Hair Removal LotionAmazonB001RVMR7KDepilatory cream
Personnet mini retractorRobozRS-6504Retractor
Phosphate Buffered Saline 1xFisher Scientific14190144PBS
pLenti.CAG.H2B-Dendra2.WAddgene51005Dendra2 lentivirus
PuralubeHenry Schein Animal Health008897Eye Lubricant
Rodent intubation standBraintree ScientificRIS 100
Small animal lung inflation bulbHarvard Apparatus72-9083
SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with WarmingKent ScientificSURGI-M02Heated surgical platform
Test Leads 48" TEST LEAD BANANA - BlackMouser565-1440-48-0
Test Leads 48" TEST LEAD BANANA - RedMouser565-1440-48-2
Tracheal catheter Exelint International2674622 G catheter
Wound closing system veterinary kitClay AdamsIN015Veterinary surgical stapling kit

Referências

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