الصيانة الأسيرة واستخراج السم من Tityus serrulatus (العقرب الأصفر البرازيلي) لإنتاج مضادات السموم

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولات صيانة واستخراج السموم الناجحة لتربية Tityus serrulatus Lutz and Mello ، 1922 (العقرب الأصفر البرازيلي) على نطاق واسع ، بهدف توفير السم لإنتاج مضادات السموم اللاحقة للعقارب لتلبية طلب النظام الصحي البرازيلي.

Abstract

تسمم العقرب هو مشكلة صحية عامة في العديد من البلدان الاستوائية وشبه الاستوائية. تيتيوس سيرولاتوس Lutz and Mello ، 1922 (العقرب الأصفر البرازيلي) مسؤولان عن حوالي 150000 حالة تسمم سنويا في البرازيل ، منها 10٪ تتطلب علاجا مضادا للسموم لعكس آثار السم التي تهدد الحياة. لذلك ، يتم الاحتفاظ بالآلاف من أفراد T. serrulatus تحت ظروف الأسر الخاضعة للرقابة لاستخراج السم ، والتي تستخدم لاحقا في إنتاج الإمداد الوطني لمضادات السموم العقرب. معهد بوتانتان هو المختبر الرئيسي لتصنيع مضادات السموم في البرازيل ، حيث يوفر حوالي 70000 قارورة من مضادات السموم العقارب للنظام الصحي البرازيلي. وبالتالي ، فإن بروتوكولات التربية ومنهجيات استخراج السموم هي نقاط رئيسية لنجاح إنتاج السموم على نطاق واسع وموحد. الهدف من هذه المقالة هو وصف بروتوكولات الأسر لتربية T. serrulatus ، والتي تشمل روتين التربية وإجراءات استخراج السم ، واتباع ممارسات التصنيع الجيدة ، وضمان رفاهية. تسمح هذه الممارسات بالحفاظ على ما يصل إلى 20000 في الأسر ، مع روتين من 3000 إلى 5000 عقرب يتم حلبها شهريا وفقا لطلب تصنيع مضادات السموم ، مما يحقق في المتوسط 90٪ من الاستخراج الإيجابي.

Introduction

العقارب هي مفصليات الأرجل التي تنتمي إلى طائفة العناكب ، رتبة العقارب ، والتي تضم ما يقرب من 2621 نوعا ^1,2. هذه لها نطاق جغرافي واسع وهي موجودة في جميع القارات باستثناء القارة القطبية الجنوبية¹. يؤدي التسمم الناجم عن العقارب إلى اعتلال أو وفاة آلاف الأشخاص كل عام^{على مستوى العالم 3}. في عام 2019 ، قدر أن هناك أكثر من 1.2 مليون حادث و 3500 حالة وفاة سنوية ناجمة عن هذه. في البرازيل ، يتزايد عدد الحالات بشكل كبير ، حيث وصل إلى أكثر من 100,000 حالة سنويا منذ^عام 2017 ^4,5,6. إن التحضر غير المنضبط الذي لوحظ في البرازيل في العقود الماضية ، دون معالجة كافية لمياه الصرف الصحي وجمع القمامة والتخلص منها بانتظام ، المرتبط بالتدهور البيئي والتغيرات المناخية ، قد وفر الظروف لانتشار العقارب الغازية ، مثل T. serrulatus ، مما زاد من الاتصال بالبشر وبالتالي أدى إلى حوادث ضارة⁴،^7،8. هناك حوالي 178 نوعا من العقارب في البرازيل ، ولكن اللسعات ذات الأهمية الطبية ناتجة عن جنس Tityus ، مع أربعة أنواع (T. serrulatus و T. bahiensis و T. stigmurus و T. obscurus) تثير قلقا طبيا ، مع كون Tityus serrulatus مسؤولا عن أشد الحالات والوفيات ^7,9.

معهد بوتانتان هو المختبر الرئيسي لتصنيع مضادات السموم في البرازيل ، حيث يوفر ما يقرب من 70000 قارورة من مضادات السموم العقارب للنظام الصحي البرازيلي. باختصار ، تشمل الخطوات التي ينطوي عليها تصنيع مضادات السموم تلقيح المستضدات المشتقة من السم في الخيول ، وجمع وتنقية بلازما الأجسام المضادة الغنية ، مما ينتج عنه 5 مل قارورة من مضاد السم العقرب. كل قارورة قادرة على تحييد ، على الأقل ، 1 ملغ من سم العقرب لكل مل من مضادات السموم. المفصليات Bioterium هو جزء لا يتجزأ من المركز الصناعي ، المسؤول عن توفير المواد المصدر لمضاد العقرب.

تم تسمية المفصليات Bioterium في معهد بوتانتان في الأصل مختبر المفصليات وتم تأسيسه في عام 1967. ومع ذلك ، في عام 1995 فقط انتقل المختبر إلى منشأة حصرية مخصصة لإيواء المفصليات السامة^10,11. في ذلك الوقت ، تم الاحتفاظ بالعقارب في غرفة مساحتها 12 م² بدون درجة حرارة خاضعة للرقابة وتوزيعها على ما يقرب من 13 حاوية ، كل منها يضم 300 كحد أقصى¹⁰. نظرا للطلب المتزايد على السم على مر السنين وما يترتب على ذلك من حاجة إلى زيادة عدد ، إلى جانب التحسينات في عملية استخراج السم ، حدث تغيير كبير في عام 2016. تم دمج المختبر في المركز الصناعي لمعهد بوتانتان وتم تغيير اسمه إلى مفصليات الأرجل Bioterium. بالإضافة إلى ذلك ، في عام 2016 ، انتقل Bioterium إلى منشأة جديدة مبنية لهذا الغرض. تغطي غرفة العقرب الجديدة مساحة 24 م² وتحتوي على حوالي 48 حاوية من مادة البولي بروبيلين ، كل منها يضم ما يصل إلى 300 ، كما هو موضح في الشكل 1. وينتج عن ذلك ما مجموعه 10,000 إلى 20,000 فرد يتم الاحتفاظ بهم في ظل ظروف أسيرة خاضعة للرقابة، مع اختلافات على مدار العام. تتم إدارة العقارب بعناية بموجب بروتوكولات تربية صارمة لضمان رفاهيتها مع تلبية متطلبات الإنتاج العالية والالتزام بالممارسات الجيدة والمعايير الأخلاقية لرعاية. لاستخراج السم ، تم تصميم وبناء غرفة محددة ، تضم خزانتين لتدفق الهواء كما هو موضح في الشكل 2 أ. تعمل هذه الخزانات كتدابير أمان لمنع الفنيين من استنشاق جزيئات السم أثناء إجراء الاستخراج. معدات الحماية الشخصية (PPE) إلزامية للفنيين ، بما في ذلك المآزر الاصطناعية وأقنعة FFP2 ، لتجنب أي تلوث وضمان سلامتهم.

الشكل 1: منظر عام لغرفة العقرب في المفصليات Bioterium. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: منطقة العمل . (أ) منظر عام لغرفة استخراج السم في المفصليات Bioterium. (ب) سطح عمل خزانة تدفق الهواء. يتم إعداد جميع المواد والمعدات وترتيبها على الجزء العلوي من سطح عمل خزانة تدفق الهواء. يشير السهم الأسود إلى جهاز التحفيز الكهربائي ، ويشير السهم الأحمر إلى الملقط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

حوالي 90 ٪ من العقارب T. serrulatus في المفصليات Bioterium تنشأ من مواقع مختلفة ، تم جمعها من قبل وكلاء الصحة البلدية كجزء من برنامج المراقبة والسيطرة لهذه. يتم اصطياد العقارب في المناطق الحضرية ثم يتم إرسالها إلى معهد بوتانتان كجزء من برنامج تعاوني. العقارب T. serrulatus هي parthenogenetic ، وهذا يعني أن الولادة تحدث نتيجة لتطور النسل من البيض غير المخصب ، دون وجود فرد من الجنس الآخر¹². بسبب هذا النوع من التكاثر ، تولد بعض في الأسر في منشأتنا ويتم الحفاظ عليها حتى تصل إلى مرحلة البلوغ ، باتباع بروتوكول تربية مماثل كما هو موضح أدناه. بمجرد وصولهم إلى مرحلة البلوغ ، تتم إضافتهم إلى روتين استخراج السم. عند الوصول، تخضع العقارب لفحص أولي، ويتم الاحتفاظ بالعقارب التي تعيش في ظروف صحية جيدة في حظائر جماعية تحتوي على 350 فردا كحد أقصى، مقسمة حسب أصلها. لكل حاوية ، يتم ملء نموذج مراقبة يوميا ، يوفر بيانات عن تاريخ التغذية ونوع الفريسة المقدمة (الكريكيت أو الصرصور) ، وإمدادات المياه ، وإجراءات التنظيف ، وعدد النافقة ، وعدد الحية المتبقية داخل العلبة.

في جدول أعمال محدد مسبقا ، تخضع للتحفيز الكهربائي ، ثم يتم تجفيف السم الناتج لمئات الأفراد بالتجميد ، مما ينتج عنه دفعات من السم المجفف بالتجميد. السم الموحد الذي تم الحصول عليه من هذه العملية مخصص لتحصين الخيول كجزء من عملية التصنيع ، وكذلك لتوفير مادة مرجعية لمراقبة جودة المادة الفعالة والمنتج النهائي.

هناك عدد قليل جدا من المرافق في العالم القادرة على الاحتفاظ بمثل هذا العدد الكبير من العقارب وإجراء عمليات استخراج السموم وفقا لممارسات التصنيع الجيدة والاستخدام الأخلاقي للحيوانات ، كما هو الحال في المفصليات Bioterium التابع لمعهد بوتانتان. لذلك ، هدفنا هو وصف بروتوكولات صيانة العقارب وإجراءات استخراج السم المستخدمة في تربية T. serrulatus ، والتي توفر بنجاح الكمية اللازمة من السم لإنتاج مضاد سم العقرب.

Protocol

البروتوكولات التي تنطوي على اللافقارية معفاة من موافقة لجنة استخدام ورعايتها التابعة لمعهد بوتانتان. ومع ذلك ، فإن الحفاظ على العقارب الموصوفة هنا يتبع المعايير الأخلاقية ، ويتم احترام رعاية وفقا لاحتياجات الأنواع.

1. الإسكان

1. احتفظ بالعقارب في حاويات البولي بروبلين المشتركة كحاويات (ارتفاع 35 سم ، عرض 35.5 سم ، طول 72 سم) تحتوي على 350 كحد أقصى.
2. حافظ على الغرفة التي توجد فيها حظائر تحت درجة حرارة مضبوطة تبلغ 24 درجة مئوية (±0.5 درجة مئوية) في دورة ضوئية مدتها 10 ساعات مع إضاءة الأنوار و 14 ساعة مع إطفاء الأنوار.
3. قم بتبطين أرضية العلبة (أسفل) كل حاوية بورق كرافت مثبت بشريط لاصق على الحواف من جميع الجوانب حتى لا تتمكن من الدخول تحت الورق (الشكل 3 أ).
4. استخدم أربعة صواني من الورق المقوى (صواني البيض) كركائز رأسية ، مكدسة على جانب واحد من الحاوية ، مع وضع ورقة من الورق المقوى الصلب بين كل صينية (الشكل 3B ، C).
5. ضع صينية بولي بروبيلين ضحلة (صينية ماء) على الجانب الآخر من العلبة ، تحتوي على قطن منقوع كمصدر للمياه للحيوانات (الشكل 3 ب).
6. احتفظ بالحاويات بدون أغطية لزيادة تدفق الهواء. ضع شريطا يبلغ طوله حوالي 10 سم من الشريط البلاستيكي ذاتي اللصق أعلى السطح الداخلي للحاوية وعلى الزوايا العلوية لجعل الجدران ناعمة بدرجة كافية لمنع من الهروب من الحاوية (الشكل 3 أ).

الشكل 3: إعداد السكن والعلبة. ( أ) تشير الأسهم إلى ورق الكرافت الموجود في الأسفل ، مثبتا بشريط لاصق على الحواف. تشير الخطوط المنقطة إلى الشريط البلاستيكي ذاتي اللصق الموضوع أعلى السطح الداخلي للحاوية. (ب) الركيزة الرأسية (صواني البيض مكدسة على جانب واحد من الحاوية) وصينية البولي بروبلين الضحلة (صينية الماء) موضوعة على الجانب الآخر. (ج) تفاصيل الركيزة الرأسية: صواني البيض المغطاة بورقة من الورق المقوى الصلب بين صينيتين. (د) صفائح من الورق المقوى وصواني البيض موضوعة في طبقات ، تحاكي الموائل الطبيعية المظلمة والرطبة ل T. serrulatus. ه: الموجودة في الركيزة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. روتين النظافة

ملاحظة: ينقسم روتين النظافة إلى إجراءين للصيانة: الصيانة الكاملة والجزئية. يتم تنفيذ أول واحد 2 أيام بعد إطعام أو عندما يتم اختيار العلبة لاستخراج السم. يتم إجراء الصيانة الجزئية عندما لا يتم تغذية.

1. صيانة كاملة
   1. قم بإعداد حاوية نظيفة بركيزة جديدة (صواني البيض والكرتون وورق الكرافت) وصينية مياه نظيفة ، كما هو موضح في القسم 1.
   2. باستخدام ملقط طويل ، قم بإزالة صينية الماء من العلبة. إذا كان هناك أي عقارب على صينية المياه ، فقم بإزالتها ووضعها في العلبة النظيفة.
   3. كرر نفس الإجراء الموضح في الخطوة 2.1.2 مع جميع صواني البيض وألواح الكرتون ، وإزالة جميع العقارب ووضعها في العلبة النظيفة.
   4. بعد إزالة الصواني ، قم بإزالة جميع العقارب المتبقية على أرضية العلبة ووضعها في العلبة النظيفة. تأكد من حساب أي جثث والتخلص منها بشكل صحيح. جمع كل الفريسة الحية المتبقية (الحشرات) وإزالتها من العلبة.
   5. قم بإزالة جميع الركائز التي تستخدم لمرة واحدة من العلبة (صواني البيض ، ورقة الكرتون ، وورق الكرافت) وتخلص منها بشكل صحيح. أرسل العناصر القابلة لإعادة الاستخدام (صينية المياه وحاوية البولي بروبلين) للصرف الصحي.
      ملاحظة: يتم تنفيذ الصرف الصحي للعناصر القابلة لإعادة الاستخدام باستخدام 0.5٪ هيبوكلوريت مع منظف محايد. من الضروري شطف المواد جيدا وبوفرة بالماء الجاري بعد استخدام أي منتج أو محلول للصرف الصحي.
2. الصيانة الجزئية
   ملاحظة: تتكون الصيانة الجزئية من فحص جميع الركائز (صواني البيض وورق الكرافت) بهدف إزالة جثث العقارب الميتة وغيرها من الحطام غير المرغوب فيه ، ولكن دون التخلص من الركائز أو تغيير العلبة.
   1. قم بإجراء الفحص باستخدام ملقط طويل لرفع كل صينية بيض برفق وإزالة النفايات.
   2. إذا لزم الأمر ، استبدل صينية بيض واحدة أو أكثر بأخرى نظيفة.
   3. استبدل صينية الماء تماما بأخرى نظيفة باستخدام ملقط طويل. انقل أي عقارب على صينية الماء إلى صينية البيض في جزء آخر من العلبة.

3. التغذية

1. إطعام كل 15 يوما وفقا لجدول استخراج السم. إطعام التي سيتم حلبها قبل 7 أيام و 7 أيام بعد استخراج السم.
2. للتغذية ، قم بتزويد الصراصير (Phoetalia pallida) والصراصير (Gryllus sp.) بالتناوب.
3. حساب كمية الطعام وفقا لاستهلاك الطاقة للحيوانات ؛ عرض 1 فريسة لكل 3 أو 5 عقارب في العلبة.
4. عد الكمية المحسوبة من عناصر الفرائس وضعها حية داخل العلبة ، واتركها لمدة يومين قبل الصيانة الكاملة (القسم 2.1).
5. عند تقديم الصراصير ، ضع كربونات الكالسيوم بمحلول الكحول حول الجزء العلوي من العبوات. يتسبب المحلول في انزلاق الصراصير وعدم القدرة على تسلق السطح الجانبي للحاوية ، وبالتالي منع الحشرات من الهروب.

4. استخراج السم

ملاحظة: المستخدمة في روتين استخراج السم هي البالغين أو ما قبل البالغين. نظرا لصعوبة تحديد النضج الجنسي الكامل للعقرب الأصفر البرازيلي (مرحلة البالغين) ، فقد تقرر أن التي يبلغ طول جسمها الإجمالي من 5 إلى 7 سم مؤهلة لهذا الإجراء.

1. حليب كل كل 2-3 أشهر.
2. في يوم استخراج السم ، عد جميع الحية في العلبة وانقلها إلى وعاء زجاجي باستخدام ملقط طويل (الشكل 4).
3. قم بإعداد وترتيب جميع المواد والمعدات التي سيتم استخدامها في الجزء العلوي من سطح عمل خزانة تدفق الهواء. قم بتوصيل سلك طاقة المحفز الكهربائي بالمأخذ وقم بتشغيل المحفز الكهربائي وخزانة تدفق الهواء (الشكل 2 ب).
   1. استخدم إعدادات معلمات المحفز الكهربائي التالية: الجهد (فرق الجهد بين الأقطاب الكهربائية): 540 مللي فولت ، الإجهاد (مدة النبضة الكهربائية): 2 مللي ثانية ، الإجراء (التقطع لتخفيف الفاعلية المستخدمة ، مما يقلل من تسخين الأنسجة العضوية telson): 70٪ ، دورة (ضبط التكرار الدوري): 1 ثانية ، والشدة (التيار الكهربائي الذي يدور عبر عضلة): 0.75 مللي أمبير.
4. قم بتقييد كل يدويا بطريقة تجعل التلسون ثابتا ، باتباع الخطوات:
   1. امسك metassoma للحيوان بالملقط المستقيم (الشكل 5 أ).
   2. شل حركة التلسون بالملقط المنحني (الشكل 5 ب).
   3. تقييد التلسون باليد (الشكل 5C ، D).
5. بعد ضبط النفس ، ضع التلسون على اتصال مباشر مع موصل التحفيز الكهربائي ، دون الحاجة إلى استخدام محلول موصل. تسبب الصدمة الكهربائية تقلصا عضليا لا إراديا للغدة السامة وما يترتب على ذلك من طرد السم.
6. اجمع قطرات السم مباشرة في أنبوب بلاستيكي دقيق يوضع بالقرب من موصل المحفز الكهربائي (الشكل 6).
7. بعد ذلك ، حرر مرة أخرى في الحاوية الزجاجية ، باتباع الخطوات:
   1. نقل تيلسون من اليد إلى ملقط منحني.
   2. ضع برفق في قاع الوعاء الزجاجي.
8. نفذ الخطوات 4.4-4.7 مع كل في مستلم الزجاج.
9. بعد حلب جميع الموجودة في مستلم الزجاج ، ضعها مرة أخرى في العلبة.
10. قم بتخزين السم الذي تم جمعه في -20 درجة مئوية حتى عملية التجفيد.

الشكل 4: عقارب في وعاء زجاجي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5: الإجراء التقييدي لاستخراج السم. (أ) ميتاسوما مقيدة بالملقط المستقيم (سهم أسود). (ب) تلسون يجمد بالملقط المنحني (سهم أسود). ج: نقل التلسون المقيد من الملقط إلى اليد. د: تيلسون مقيد باليد. يوصى بالتعامل مع بأيد عارية لأنه عند استخدام القفازات ، يمكن للعقارب الاستيلاء على المواد بمخالبها ، مما يجعل من الصعب إطلاقها في نهاية الإجراء ويزيد بشكل كبير من خطر وقوع الحوادث. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: استخراج السم. أنبوب دقيق بلاستيكي (سهم أبيض) يوضع بالقرب من المحفز الكهربائي (السهم الأصفر). يتم جمع قطرات السم مباشرة في الأنبوب الذي يتم الحفاظ عليه في درجة حرارة الغرفة أثناء العملية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

النتائج

تم تطوير ثلاثين إجراء تشغيليا قياسيا (SOPs) لكل إجراء ، مما يضمن تكرار الإجراءات بين الفنيين والامتثال لمعايير الجودة. يبلغ متوسط معدل الوفيات بعد إجراء الاستخراج حوالي 12٪ ، والتي يمكن اعتبارها منخفضة ، مع الأخذ في الاعتبار روتين التحفيز الكهربائي وبيئة الأسر ، حيث يتم تقليل عوامل الإجهاد ب...

Discussion

يسمح لنا تطبيق الطرق الموصوفة بالاحتفاظ بعدد كبير من أفراد T. serrulatus ويعطينا إمكانية التنبؤ المستمر بعدد العقارب اللازمة لإنتاج السم السنوي. بهذه الطريقة ، نحن قادرون على توفير دفعات كافية من السم مقدما لتزويد عملية تصنيع مضادات السموم. في الوقت نفسه ، يعد تطوير الجداول الزمنية المحدد...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carboard sheet	NA	NA
Egg tray	NA	NA	cardboard 36 places egg trays
Electro stimulator device	Instituto Butantan	ART-FV-01	Internally designed for the venom extraction
Kraft paper	NA	NA	regular kraft paper
Making tape	NA	NA	White masking tape (24 mm x 50 m)
Polyproplene container	NA	NA	70 L Polypropylene box (H – 35 cm, W – 35.5 cm, L - 72 cm)
Polyproplene tray	NA	NA	Polypropylene tray (H – 3.0 cm, W – 18.5 cm, L - 30 cm)
Self-adhesive plastic	NA	NA