Manutenção em Cativeiro e Extração de Veneno de Tityus serrulatus (Escorpião Amarelo Brasileiro) para Produção de Soro Antiofídico

Resumo

Apresentamos aqui protocolos bem sucedidos de manutenção e extração de veneno para a criação em larga escala de Tityus serrulatus Lutz e Mello, 1922 (escorpião amarelo brasileiro), com o objetivo de fornecer veneno para posterior produção de soro antiescorpião para atender à demanda do sistema de saúde brasileiro.

Resumo

O envenenamento escorpiônico é um problema de saúde pública em vários países tropicais e subtropicais. Tityus serrulatus Lutz e Mello, 1922 (escorpião amarelo brasileiro) são responsáveis por aproximadamente 150.000 casos de envenenamento por ano no Brasil, dos quais 10% necessitam de tratamento antiofídico para reverter os efeitos do veneno com risco de vida. Portanto, milhares de indivíduos de T. serrulatus são mantidos em condições controladas de cativeiro para extração do veneno, posteriormente utilizado na produção do suprimento nacional de soro antiofídico. O Instituto Butantan é o principal laboratório de fabricação de soro antiofídico do Brasil, fornecendo cerca de 70 mil frascos de soro escorpiônico para o sistema de saúde brasileiro. Assim, os protocolos de criação e as metodologias de extração de veneno são pontos-chave para o sucesso da produção padronizada de veneno em larga escala. O objetivo deste artigo é descrever os protocolos de cativeiro da criação de T. serrulatus , englobando a rotina de criação e os procedimentos de extração do veneno, seguindo boas práticas de fabricação e garantindo o bem-estar animal. Essas práticas permitem a manutenção de até 20.000 animais em cativeiro, com uma rotina de 3.000 a 5.000 escorpiões ordenhados mensalmente de acordo com a demanda de fabricação de soro antiofídico, alcançando uma média de 90% de extração positiva.

Introdução

Os escorpiões são artrópodes pertencentes à classe Arachnida, ordem Scorpiones, que compreende aproximadamente 2.621^espécies1,2. Esses animais têm ampla distribuição geográfica e estão presentes em todos os continentes, exceto na Antártida¹. O envenenamento causado por escorpiões resulta na morbidade ou morte de milhares de pessoas todos os anos no mundo^3. Em 2019, estimou-se que houve mais de 1,2 milhão de acidentes e 3,5 mil mortes anuais causadas por esses animais. No Brasil, o número de casos vem aumentando exponencialmente, chegando a mais de 100.000 casos por ano desde 2017 ^4,5,6. A urbanização descontrolada observada no Brasil nas últimas décadas, sem tratamento adequado de esgoto e coleta e destinação regulares de lixo, associada à degradação ambiental e às mudanças climáticas, tem proporcionado condições para a proliferação de escorpiões invasores, como o T. serrulatus, aumentando o contato com o homem e, consequentemente, resultando em acidentes^nocivos4,7,8. Existem cerca de 178 espécies de escorpiões no Brasil, mas picadas de importância médica são causadas pelo gênero Tityus, sendo quatro espécies (T. serrulatus, T. bahiensis, T. stigmurus e T. obscurus) de interesse médico, sendo Tityus serrulatus responsável pelos casos e óbitos mais ^graves7,9.

O Instituto Butantan é o principal laboratório de fabricação de soro antiofídico do Brasil, fornecendo aproximadamente 70.000 frascos de soro escorpiônico para o sistema de saúde brasileiro. Resumidamente, as etapas envolvidas na fabricação do soro antiofídico incluem a inoculação de antígenos derivados do veneno em equinos, a coleta e purificação do plasma rico em anticorpos, resultando em frascos de 5 mL de soro antiofídico. Cada frasco é capaz de neutralizar, no mínimo, 1 mg de veneno de escorpião por mL de soro antiofídico. O Artrópodes Bioterium é parte integrante do centro industrial, responsável por fornecer o material de origem para o soro antiofídico do escorpião.

O Biotério de Artrópodes do Instituto Butantan foi originalmente chamado de Laboratório de Artrópodes e foi criado em 1967. No entanto, somente em 1995 o Laboratório mudou-se para uma instalação exclusiva dedicada ao alojamento de artrópodes peçonhentos^10,11. Nessa ocasião, os escorpiões foram mantidos em uma sala de 12^m2 sem temperatura controlada e distribuídos em aproximadamente 13 recintos, cada um abrigando no máximo 300^animais10. Devido ao aumento da demanda por veneno ao longo dos anos e a consequente necessidade de aumento do número de animais, juntamente com melhorias no processo de extração do veneno, uma grande mudança ocorreu em 2016. O Laboratório foi integrado ao polo industrial do Instituto Butantan e passou a se chamar Biotério de Artrópodes. Além disso, em 2016, o Bioterium mudou-se para uma nova instalação construída para esse fim. A nova sala de escorpiões ocupa uma área de 24^m2 e contém aproximadamente 48 recintos de polipropileno, cada um abrigando até 300 animais, como mostra a Figura 1. Isso resulta em um total de 10.000 a 20.000 indivíduos sendo mantidos em condições controladas de cativeiro, com variações ao longo do ano. Os escorpiões são cuidadosamente manejados sob rígidos protocolos de criação para garantir seu bem-estar, atendendo às altas demandas de produção e aderindo às boas práticas e padrões éticos de cuidados com os animais. Para a extração do veneno, uma sala específica foi projetada e construída, abrigando dois armários de fluxo de ar, como mostra a Figura 2A. Esses armários servem como medidas de segurança para evitar que os técnicos inalem partículas de veneno durante o procedimento de extração. Os equipamentos de proteção individual (EPIs) são obrigatórios para os técnicos, incluindo aventais sintéticos e máscaras FFP2, para evitar qualquer contaminação e garantir sua segurança.

Figura 1: Vista geral da sala do escorpião do Biotério dos Artrópodes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Área de trabalho . (A) Vista geral da sala de extração de veneno do Biotério dos Artrópodes. (B) Superfície de trabalho do gabinete de fluxo de ar. Todos os materiais e equipamentos são preparados e dispostos na parte superior da superfície de trabalho do gabinete de fluxo de ar. A seta preta indica o aparelho eletroestimulador e a seta vermelha indica a pinça. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Cerca de 90% dos escorpiões de T. serrulatus do Biotério dos Artrópodes são originários de diferentes locais, coletados por agentes municipais de saúde como parte de um programa de vigilância e controle desses animais. Os escorpiões são capturados em áreas urbanas e depois encaminhados ao Instituto Butantan como parte de um programa colaborativo. Os escorpiões de T. serrulatus são partenogenéticos, ou seja, o nascimento ocorre como consequência do desenvolvimento da prole a partir de óvulos não fertilizados, sem a presença de um indivíduo do sexo oposto¹². Devido a esse tipo de reprodução, alguns animais nascem em cativeiro em nossa instalação e são mantidos até atingirem a fase adulta, seguindo um protocolo de criação semelhante ao descrito abaixo. Quando atingem a fase adulta, são adicionados à rotina de extração de veneno. Após a chegada, os escorpiões passam por triagem inicial, e aqueles em boas condições de saúde são mantidos em recintos coletivos contendo no máximo 350 indivíduos, divididos por sua origem. Para cada recinto, um formulário de controle é preenchido diariamente, fornecendo dados sobre a data de alimentação e o tipo de presa oferecida (grilo ou barata), abastecimento de água, procedimentos de limpeza, o número de animais mortos e o número de animais vivos restantes dentro do recinto.

Em uma agenda pré-agendada, os animais são submetidos a estimulação elétrica, e o veneno resultante de centenas de indivíduos é então liofilizado, resultando em lotes de veneno liofilizado. O veneno padronizado obtido a partir desse processo é destinado à imunização equina como parte do processo de fabricação, bem como para fornecer material de referência para controle de qualidade da substância ativa e do produto final.

Existem pouquíssimas instalações no mundo capazes de manter um número tão grande de escorpiões e realizar o volume de extrações de veneno de acordo com as boas práticas de fabricação e uso ético dos animais, como é feito no Biotério de Artrópodes do Instituto Butantan. Portanto, nosso objetivo é descrever os protocolos de manutenção do escorpião e os procedimentos de extração do veneno utilizados na criação de T. serrulatus , que fornecem com sucesso a quantidade necessária de veneno para a produção de soro antiescorpiônico.

Protocolo

Protocolos envolvendo animais invertebrados estão isentos da aprovação da Comissão de Uso e Cuidados com os Animais do Instituto Butantan. No entanto, a manutenção dos escorpiões aqui descritos segue parâmetros éticos, e o bem-estar animal é respeitado de acordo com as necessidades da espécie.

1. Habitação

1. Manter os escorpiões em recipientes comuns de polipropileno como recintos (altura 35 cm, largura 35,5 cm, comprimento 72 cm) contendo no máximo 350 animais.
2. Manter a sala onde os recintos de animais estão alojados sob uma temperatura controlada de 24 °C (±0,5 °C) em um ciclo de luz de 10 h com luzes acesas e 14 h com luzes apagadas.
3. Forre o piso do recinto (fundo) de cada recipiente com papel kraft fixado com fita adesiva nas bordas de todos os lados para que os animais não possam ficar sob o papel (Figura 3A).
4. Utilizar quatro bandejas de papelão (bandejas de ovos) como substratos verticais, empilhadas em um dos lados do recipiente, com uma folha rígida de papelão colocada entre cada bandeja (Figura 3B,C).
5. Coloque uma bandeja rasa de polipropileno (bandeja de água) no lado oposto do recinto, contendo algodão embebido como fonte de água para os animais (Figura 3B).
6. Mantenha os recipientes sem tampas para aumentar o fluxo de ar. Coloque uma tira de aproximadamente 10 cm de fita plástica autoadesiva na parte superior da superfície interna do recinto e nos cantos superiores para tornar as paredes lisas o suficiente para evitar que os animais escapem do recipiente (Figura 3A).

Figura 3: Preparação da carcaça e do compartimento . (A) As setas indicam o papel kraft na parte inferior, fixado com fita adesiva nas bordas. Linhas pontilhadas indicam a fita plástica autoadesiva colocada na parte superior da superfície interna do gabinete. (B) Substrato vertical (bandejas de ovos empilhadas em um dos lados do recipiente) e uma bandeja rasa de polipropileno (bandeja de água) colocada no lado oposto. (C) Detalhe do substrato vertical: bandejas de ovos empilhadas com uma folha de papelão rígida entre duas bandejas. (D) Folhas de papelão e bandejas de ovos posicionadas em camadas, simulando o habitat natural escuro e úmido de T. serrulatus . (E) Animais acomodados no substrato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Rotina de higiene

OBS: A rotina de higiene é dividida em dois procedimentos de manutenção: manutenção completa e manutenção parcial. A primeira é realizada 2 dias após a alimentação dos animais ou quando o recinto é selecionado para extração do veneno. A manutenção parcial é realizada quando os animais não são alimentados.

1. Manutenção completa
   1. Prepare um compartimento limpo com novo substrato (bandejas de ovos, papelão e papel kraft) e uma bandeja de água limpa, conforme descrito na seção 1.
   2. Utilizando pinças longas, remova a bandeja de água do compartimento. Se houver escorpiões na bandeja de água, remova-os e coloque-os no recinto limpo.
   3. Repetir o mesmo procedimento descrito no passo 2.1.2 com todas as bandejas de ovos e folhas de cartão, retirando todos os escorpiões e colocando-os no recinto limpo.
   4. Após a remoção das bandejas, retire todos os escorpiões deixados no chão do recinto e coloque-os no recinto limpo. Certifique-se de contabilizar todas as carcaças e descartá-las corretamente. Colete todas as presas vivas restantes (insetos) e remova-as do recinto.
   5. Retire todos os substratos descartáveis do recinto (bandejas de ovos, folha de papelão e papel kraft) e descarte-os corretamente. Envie os itens reutilizáveis (bandeja de água e recipiente de polipropileno) para higienização.
      OBS: A higienização dos itens reutilizáveis é realizada com hipoclorito 0,5% combinado com detergente neutro. É obrigatório que os materiais sejam completa e abundantemente enxaguados com água corrente após o uso de qualquer produto ou solução de saneamento.
2. Manutenção parcial
   OBS: A manutenção parcial consiste na inspeção de todos os substratos (bandejas de ovos e papel kraft) com o objetivo de remover carcaças mortas de escorpião e outros detritos indesejáveis, mas sem descartar os substratos ou trocar o recinto.
   1. Realize a inspeção usando pinças longas para levantar suavemente cada bandeja de ovos e remover os resíduos.
   2. Se necessário, substitua uma ou mais bandejas de ovos por uma limpa.
   3. Substitua completamente a bandeja de água por uma limpa usando pinças longas. Transfira os escorpiões na bandeja de água para a bandeja de ovos em outra parte do recinto.

3. Alimentação

1. Alimentar os animais a cada 15 dias de acordo com o cronograma de extração do veneno. Alimentar os animais que serão ordenhados 7 dias antes e 7 dias após a extração do veneno.
2. Para a alimentação, forneça baratas (Phoetalia pallida) e grilos (Gryllus sp.) alternadamente.
3. Calcular a quantidade de alimento de acordo com a ingestão energética dos animais; Ofereça 1 presa para cada 3 ou 5 escorpiões no recinto.
4. Contar a quantidade calculada de presas e colocá-las vivas dentro do recinto, deixando-as durante 2 dias antes da manutenção completa (secção 2.1).
5. Ao oferecer baratas, aplique um carbonato de cálcio com solução de álcool ao redor da parte superior dos recintos. A solução faz com que as baratas escorreguem e não consigam escalar a superfície lateral do recinto, evitando assim que os insetos escapem.

4. Extração de veneno

OBS: Os animais utilizados na rotina de extração do veneno são adultos ou pré-adultos. Devido à dificuldade em determinar a maturidade sexual completa do escorpião amarelo brasileiro (fase adulta), determinou-se que animais com comprimento corporal total de 5 a 7 cm são elegíveis para o procedimento.

1. Ordenhe cada animal a cada 2-3 meses.
2. No dia da extração do veneno, contar todos os animais vivos no recinto e transferi-los para um recipiente de vidro utilizando pinças longas (Figura 4).
3. Prepare e organize todos os materiais e equipamentos a serem usados na parte superior da superfície de trabalho do gabinete de fluxo de ar. Conecte o cabo de alimentação do eletroestimulador à tomada e ligue o eletroestimulador e o gabinete de fluxo de ar (Figura 2B).
   1. Use as seguintes configurações de parâmetros do eletroestimulador: potencial (diferença do potencial entre os eletrodos): 540 mV, tensão (duração do pulso elétrico): 2 ms, ação (intermitência para moderar a potência utilizada, o que reduziria o aquecimento do tecido orgânico telson): 70%, ciclo (ajustar a repetição cíclica): 1 s, e intensidade (corrente elétrica que circula pelo músculo do animal): 0,75 mA.
4. Conter manualmente cada animal de forma que o telson fique parado, seguindo os passos:
   1. Segurar o metassoma do animal com pinça reta (Figura 5A).
   2. Imobilizar o telson com pinça curva (Figura 5B).
   3. Conter o telson com a mão (Figura 5C,D).
5. Após a contenção, colocar o telson em contato direto com o condutor do eletroestimulador, sem a necessidade de utilizar uma solução condutora. O choque elétrico provoca uma contração muscular involuntária da glândula do veneno e consequente ejeção do veneno.
6. Coletar as gotas de veneno diretamente em um microtubo plástico colocado próximo ao condutor do eletroestimulador (Figura 6).
7. Em seguida, solte o animal de volta no recipiente de vidro, seguindo os passos:
   1. Transfira o telson do animal da mão para a pinça curva.
   2. Coloque o animal suavemente no fundo do recipiente de vidro.
8. Execute os passos 4.4-4.7 com cada animal no recipiente de vidro.
9. Depois que todos os animais no recipiente de vidro tiverem sido ordenhados, coloque-os de volta no recinto.
10. Armazenar o veneno coletado a -20 °C até o processo de liofilização.

Figura 4: Escorpiões no recipiente de vidro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Procedimento de contenção para extração do veneno. (A) Metassoma contido com pinça reta (seta preta). (B) Telson imobilizado com pinça curva (seta preta). (C) Transferência do telson contido da pinça para a mão. (D) Telson contido pela mão. Recomenda-se que os animais sejam manuseados com as mãos nuas, pois ao utilizar luvas, os escorpiões podem agarrar o material com suas garras, dificultando a soltura ao final do procedimento e aumentando consideravelmente o risco de acidentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Extração do veneno. Um microtubo plástico (seta branca) colocado próximo ao eletroestimulador (seta amarela). As gotas de veneno são coletadas diretamente no tubo mantido à temperatura ambiente durante o procedimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Trinta procedimentos operacionais padrão (POPs) foram desenvolvidos para cada procedimento, garantindo a repetibilidade dos procedimentos entre os técnicos e o cumprimento dos parâmetros de qualidade. A mortalidade média após o procedimento de extração é em torno de 12%, o que pode ser considerado baixo, considerando a rotina de eletroestimulação e o ambiente de cativeiro, onde os fatores de estresse são reduzidos com sucesso pela aplicação dos procedimentos.

Para manter os animai...

Discussão

A aplicação dos métodos descritos nos permite manter um grande número de indivíduos de T. serrulatus e nos dá previsibilidade consistente do número de escorpiões necessários para a produção anual de veneno. Desta forma, somos capazes de fornecer lotes suficientes de veneno com antecedência para fornecer o processo de fabricação de soro antiofídico. Ao mesmo tempo, o desenvolvimento de cronogramas pré-estabelecidos para manutenção, alimentação e extração do veneno é parte essencial das ativ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carboard sheet	NA	NA
Egg tray	NA	NA	cardboard 36 places egg trays
Electro stimulator device	Instituto Butantan	ART-FV-01	Internally designed for the venom extraction
Kraft paper	NA	NA	regular kraft paper
Making tape	NA	NA	White masking tape (24 mm x 50 m)
Polyproplene container	NA	NA	70 L Polypropylene box (H – 35 cm, W – 35.5 cm, L - 72 cm)
Polyproplene tray	NA	NA	Polypropylene tray (H – 3.0 cm, W – 18.5 cm, L - 30 cm)
Self-adhesive plastic	NA	NA