אחזקה בשבי והפקת ארס של עקרב צהוב ברזילאי ( Tityus serrulatus ) לייצור אנטי-ארס

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקולי תחזוקה והפקת ארס מוצלחים עבור גידול בקנה מידה גדול של Tityus serrulatus Lutz and Mello, 1922 (עקרב צהוב ברזילאי), במטרה לספק ארס לייצור אנטי-ארס עקרב לאחר מכן כדי לענות על הביקוש של מערכת הבריאות הברזילאית.

Abstract

ארס העקרב הוא בעיה של בריאות הציבור במספר מדינות טרופיות וסובטרופיות. Tityus serrulatus לוץ ומלו, 1922 (עקרב צהוב ברזילאי) אחראים לכ-150,000 מקרי ארס בשנה בברזיל, מתוכם 10% דורשים טיפול נגד ארס כדי להפוך את השפעות הארס מסכנות החיים. לכן, אלפי פרטים של T. serrulatus מוחזקים בתנאי שבי מבוקרים לצורך הפקת ארס, ולאחר מכן משמשים לייצור האספקה הארצית של אנטי-ארס עקרב. מכון בוטאנטן הוא המעבדה העיקרית לייצור ארס בברזיל, המספקת כ-70,000 בקבוקונים של ארס נגד עקרב עבור מערכת הבריאות הברזילאית. לפיכך, פרוטוקולי הגידול ומתודולוגיות מיצוי הארס הם נקודות מפתח להצלחה של ייצור ארס בקנה מידה גדול וסטנדרטי. מטרת מאמר זה היא לתאר את פרוטוקולי השבי של גידול T. serrulatus , הכוללים את שגרת הגידול ואת הליכי מיצוי הארס, שמירה על נוהלי ייצור נאותים והבטחת רווחת בעלי החיים. שיטות אלה מאפשרות החזקה של עד 20,000 בעלי חיים בשבי, עם שגרה של 3,000 עד 5,000 עקרבים הנחלבים מדי חודש בהתאם לביקוש לייצור אנטי-ארס, ומשיגים בממוצע 90% מיצוי חיובי.

Introduction

עקרבים הם פרוקי רגליים השייכים לסוג ארכנידה (Arachnida), מסדר עקרבים, הכולל כ-2,621 מינים ^1,2. לבעלי חיים אלה טווח גיאוגרפי רחב והם נמצאים בכל היבשות למעט אנטארקטיקה¹. ארס הנגרם על ידי עקרבים גורם לתחלואה או למוות של אלפי אנשים מדי שנה ברחבי העולם³. בשנת 2019 הוערך כי היו יותר מ -1.2 מיליון תאונות ו -3,500 מקרי מוות שנתיים שנגרמו על ידי בעלי חיים אלה. בברזיל, מספר המקרים גדל באופן אקספוננציאלי, והגיע ליותר מ -100,000 מקרים בשנה מאז 2017 ^4,5,6. העיור הבלתי מבוקר שנצפה בברזיל בעשורים האחרונים, ללא טיפול הולם בשפכים ואיסוף וסילוק סדיר של אשפה, הקשורים להתדרדרות סביבתית ושינויי אקלים, סיפק תנאים לשגשוג עקרבים פולשים, כגון T. serrulatus, מה שהגביר את המגע עם בני אדם ובכך גרם לתאונות מזיקות ^4,7,8. ישנם כ-178 מיני עקרבים בברזיל, אך עקיצות בעלות חשיבות רפואית נגרמות על ידי הסוג Tityus, כאשר ארבעה מינים (T. serrulatus, T. bahiensis, T. stigmurus ו-T. obscurus) מהווים בעיה רפואית, כאשר Tityus serrulatus אחראי למקרים החמורים ביותר ולמקרי המוות 7,9.

מכון בוטאנטן הוא המעבדה העיקרית לייצור ארס בברזיל, המספקת כ-70,000 בקבוקונים של אנטי-ארס עקרב למערכת הבריאות הברזילאית. בקצרה, השלבים המעורבים בייצור אנטי-ארס כוללים חיסון אנטיגנים שמקורם בארס בסוסים, איסוף וטיהור של פלזמה עשירה בנוגדנים, וכתוצאה מכך בקבוקונים של 5 מ"ל של אנטי-ארס עקרב. כל בקבוקון מסוגל לנטרל, לפחות, 1 מ"ג ארס עקרב לכל מ"ל של אנטי-ארס. ביוטריום פרוקי הרגליים הוא חלק בלתי נפרד מהמרכז התעשייתי, האחראי על אספקת חומר המקור לנוגד הארס של העקרב.

ביוטריום פרוקי הרגליים במכון בוטאנטן נקרא במקור המעבדה לפרוקי רגליים והוקם בשנת 1967. עם זאת, רק בשנת 1995 עברה המעבדה למתקן בלעדי המוקדש לשיכון פרוקי רגליים ארסיים^10,11. באותה תקופה הוחזקו העקרבים בחדר של 12^מ"ר ללא טמפרטורה מבוקרת ופוזרו בין כ-13 מתחמים, שבכל אחד מהם התגוררו מקסימום 300 בעלי חיים¹⁰. בשל הביקוש הגובר לארס לאורך השנים והצורך להגדיל את מספר בעלי החיים, לצד שיפורים בתהליך הפקת הארס, חל שינוי משמעותי בשנת 2016. המעבדה שולבה במרכז התעשייתי של מכון בוטנטן ושמה שונה לביוטריום פרוקי הרגליים. בנוסף, בשנת 2016, הביוטריום עבר למתקן ייעודי חדש. חדר העקרב החדש משתרע על שטח של 24 מ"^{ר ומכיל} כ-48 מארזי פוליפרופילן, שכל אחד מהם מאכלס עד 300 בעלי חיים, כפי שמוצג באיור 1. התוצאה היא שבסך הכל 10,000 עד 20,000 פרטים מוחזקים בתנאי שבי מבוקרים, עם שינויים לאורך השנה. העקרבים מנוהלים בקפידה תחת פרוטוקולי גידול קפדניים כדי להבטיח את רווחתם תוך עמידה בדרישות הייצור הגבוהות והקפדה על שיטות עבודה טובות וסטנדרטים אתיים לטיפול בבעלי חיים. לצורך שאיבת ארס תוכנן ונבנה חדר ספציפי, ובו שני ארונות זרימת אוויר כפי שמוצג באיור 2A. ארונות אלה משמשים כאמצעי בטיחות למניעת שאיפה של חלקיקי ארס על ידי טכנאים במהלך הליך השאיבה. ציוד מגן אישי (PPE) הוא חובה עבור הטכנאים, כולל סינרים סינתטיים ומסכות FFP2, כדי למנוע כל זיהום ולהבטיח את בטיחותם.

איור 1: מבט כללי על חדר העקרב של ביוטריום פרוקי הרגליים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: אזור עבודה . (A) מבט כללי על חדר מיצוי הארס של ביוטריום פרוקי הרגליים. (B) משטח עבודה של ארון זרימת אוויר. כל החומרים והציוד מוכנים ומסודרים על גבי משטח העבודה של ארון זרימת האוויר. החץ השחור מציין את מכשיר האלקטרוסטימולטור, והחץ האדום מציין את המלקחיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

כ-90% מעקרבי T. serrulatus בביוטריום פרוקי הרגליים מקורם באתרים שונים, שנאספו על ידי גורמי בריאות עירוניים כחלק מתוכנית מעקב ובקרה לבעלי חיים אלה. העקרבים נלכדים באזורים עירוניים ולאחר מכן נשלחים למכון בוטאנטן כחלק מתוכנית שיתופית. עקרבים מסוג T. serrulatus הם פרתנוגנטיים, כלומר הלידה מתרחשת כתוצאה מהתפתחות צאצאים מביציות לא מופרות, ללא נוכחות של פרט מהמין השני¹². בשל סוג זה של רבייה, חלק מבעלי החיים נולדים בשבי במתקן שלנו ומוחזקים עד שהם מגיעים לשלב הבוגר, בהתאם לפרוטוקול גידול דומה כמתואר להלן. ברגע שהם מגיעים לשלב הבוגר, הם מתווספים לשגרת מיצוי הארס. עם הגעתם, העקרבים עוברים סינון ראשוני, ואלה במצב בריאותי טוב מוחזקים במתחמים קולקטיביים המכילים מקסימום של 350 פרטים, חלקי מוצאם. עבור כל מתחם ממלאים מדי יום טופס בקרה, המספק נתונים על תאריך ההאכלה וסוג הטרף המוצע (צרצר או תיקן), אספקת מים, נהלי ניקוי, מספר בעלי החיים המתים ומספר החיות הנותרות בתוך המתחם.

בסדר יום שנקבע מראש, בעלי חיים נתונים לגירוי חשמלי, והארס שנוצר כתוצאה מכך של מאות פרטים עובר ליופיליזציה, וכתוצאה מכך נוצרות קבוצות של ארס מיובש בהקפאה. הארס המתוקנן המתקבל מתהליך זה מיועד לחיסון סוסים כחלק מתהליך הייצור, וכן לספק חומר עזר לבקרת איכות החומר הפעיל והמוצר הסופי.

ישנם מעט מאוד מתקנים בעולם המסוגלים להחזיק מספר כה גדול של עקרבים ולבצע את נפח מיצוי הארס בהתאם לנוהלי ייצור נאותים ושימוש אתי בבעלי החיים, כפי שנעשה בביוטריום פרוקי הרגליים של מכון בוטנטן. לכן, מטרתנו היא לתאר את פרוטוקולי תחזוקת העקרב ואת הליכי מיצוי הארס המשמשים בגידול T. serrulatus , אשר מספקים בהצלחה את כמות הארס הדרושה לייצור אנטי-ארס עקרב.

Protocol

פרוטוקולים הנוגעים לבעלי חיים חסרי חוליות פטורים מאישור הוועדה לשימוש וטיפול בבעלי חיים של מכון בוטנטאן. עם זאת, תחזוקת העקרבים המתוארת כאן עוקבת אחר פרמטרים אתיים, ורווחת בעלי החיים מכובדת בהתאם לצרכי המין.

1. דיור

1. החזיקו את העקרבים במיכלי פוליפרופילן משותפים כמארזים (גובה 35 ס"מ, רוחב 35.5 ס"מ, אורך 72 ס"מ) המכילים עד 350 בעלי חיים.
2. שמור על החדר שבו מכלאות בעלי החיים שוכנים תחת טמפרטורה מבוקרת של 24 ° C (±0.5 ° C) במחזור אור של 10 שעות עם אורות דולקים ו 14 שעות עם אורות כבויים.
3. רפדו את רצפת המתחם (למטה) של כל מכל בנייר קראפט קבוע עם מסקינג טייפ בקצוות מכל הצדדים, כך שהחיות לא יוכלו להיכנס מתחת לנייר (איור 3A).
4. השתמשו בארבעה מגשי קרטון (מגשי ביצים) כמצעים אנכיים, שנערמו בצד אחד של המיכל, עם יריעת קרטון קשיחה הממוקמת בין כל מגש (איור 3B,C).
5. הניחו מגש פוליפרופילן רדוד (מגש מים) בצד הנגדי של המארז, המכיל כותנה ספוגה כמקור מים לבעלי החיים (איור 3B).
6. שמור את המיכלים ללא מכסים כדי להגביר את זרימת האוויר. הניחו רצועה של כ-10 ס"מ של סרט פלסטיק נדבק מעצמו על החלק העליון של המשטח הפנימי של המארז ועל הפינות העליונות כדי שהקירות יהיו חלקים מספיק כדי למנוע מהחיות לברוח מהמכל (איור 3A).

איור 3: הכנת דיור ומארז . (A) חצים מציינים את נייר הקראפט בתחתית, קבוע עם מסקינג טייפ בקצוות. קווים מקווקוים מציינים את סרט הפלסטיק הנדבק מעצמו המונח על גבי המשטח הפנימי של המארז. (B) מצע אנכי (מגשי ביצים שנערמו בצד אחד של המיכל) ומגש פוליפרופילן רדוד (מגש מים) שהונח בצד הנגדי. (ג) פרטי המצע האנכי: מגשי ביצים עם יריעת קרטון קשיחה בין שני מגשים. (D) יריעות קרטון ומגשי ביצים הממוקמים בשכבות, המדמים את בית הגידול הטבעי הכהה והלח של T. serrulatus . (ה) בעלי חיים השוכנים במצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

2. שגרת היגיינה

הערה: שגרת ההיגיינה נחלקת לשני הליכי תחזוקה: תחזוקה מלאה ותחזוקה חלקית. הראשון מבוצע 2 ימים לאחר האכלת בעלי החיים או כאשר המתחם נבחר עבור מיצוי ארס. תחזוקה חלקית מתבצעת כאשר בעלי החיים אינם מוזנים.

1. תחזוקה מלאה
   1. הכינו מארז נקי עם מצע חדש (מגשי ביצים, קרטון ונייר קראפט) ומגש מים נקיים, כמתואר בסעיף 1.
   2. בעזרת מלקחיים ארוכים, הסר את מגש המים מהמארז. אם יש עקרבים על מגש המים, הסר אותם והנח אותם במתחם הנקי.
   3. חזור על אותו הליך המתואר בשלב 2.1.2 עם כל מגשי הביצים ויריעות הקרטון, הסר את כל העקרבים והניח אותם במתחם הנקי.
   4. לאחר הסרת המגשים, מוציאים את כל העקרבים שנותרו על רצפת המתחם ומניחים אותם במתחם הנקי. הקפד לקחת בחשבון את כל הפגרים ולהשליך אותם כראוי. אספו את כל הטרף החי שנותר (חרקים) והוציאו אותם מהמכלאה.
   5. מוציאים את כל המצעים החד פעמיים מהמארז (מגשי ביצים, יריעת קרטון ונייר קראפט) ומשליכים אותם כראוי. שלח את הפריטים לשימוש חוזר (מגש מים ומיכל פוליפרופילן) לתברואה.
      הערה: התברואה של הפריטים לשימוש חוזר מתבצעת עם 0.5% היפוכלוריט בשילוב עם חומר ניקוי ניטרלי. חובה לשטוף את החומרים ביסודיות ובשפע במים זורמים לאחר השימוש בכל מוצר או תמיסת תברואה.
2. תחזוקה חלקית
   הערה: תחזוקה חלקית כוללת בדיקת כל המצעים (מגשי ביצים ונייר קראפט) במטרה להסיר פגרי עקרב מתים ופסולת לא רצויה אחרת, אך מבלי להשליך את המצעים או לשנות את המארז.
   1. בצעו את הבדיקה באמצעות מלקחיים ארוכים כדי להרים בעדינות כל מגש ביצים ולפנות את הפסולת.
   2. במידת הצורך, החליפו מגש ביצים אחד או יותר במגש נקי.
   3. החליפו לחלוטין את מגש המים במגש נקי באמצעות מלקחיים ארוכים. העבירו את כל העקרבים שעל מגש המים למגש הביצים בחלק אחר של המארז.

3. האכלה

1. האכילו את בעלי החיים כל 15 יום בהתאם ללוח הזמנים של מיצוי הארס. להאכיל בעלי חיים שייחלבו 7 ימים לפני ו-7 ימים אחרי שאיבת הארס.
2. להאכלה, ספקו ג'וקים (Phoetalia pallida) וצרצרים (Gryllus sp.) לסירוגין.
3. חישוב כמות המזון על פי צריכת האנרגיה של בעלי החיים; הציעו טרף אחד לכל 3 או 5 עקרבים במכלאה.
4. ספרו את הכמות המחושבת של פריטי הטרף והניחו אותם חיים בתוך המכלאה, והשאירו אותם יומיים לפני התחזוקה המלאה (סעיף 2.1).
5. כאשר מציעים ג'וקים, מרחו סידן פחמתי עם תמיסת אלכוהול סביב החלק העליון של המארזים. התמיסה גורמת לתיקנים להחליק ולא להיות מסוגלים לטפס על המשטח הצדדי של המכלאה, ובכך מונעת מהחרקים לברוח.

4. מיצוי ארס

הערה: בעלי החיים המשמשים בשגרת מיצוי הארס הם מבוגרים או טרום בוגרים. בשל הקושי לקבוע את הבשלות המינית המלאה של העקרב הצהוב הברזילאי (השלב הבוגר), נקבע כי בעלי חיים באורך גוף כולל של 5 עד 7 ס"מ זכאים להליך.

1. חלב כל חיה כל 2-3 חודשים.
2. ביום הפקת הארס, ספרו את כל החיות החיות במתחם והעבירו אותן למיכל זכוכית בעזרת מלקחיים ארוכים (איור 4).
3. הכינו וסדרו את כל החומרים והציוד שישמשו בחלק העליון של משטח העבודה של ארון זרימת האוויר. חברו את כבל החשמל של ה-electrostimulator לשקע והפעילו את ה-electrostimulator ואת ארון זרימת האוויר (איור 2B).
   1. השתמש בהגדרות הפרמטרים הבאים של אלקטרו סטימולטור: פוטנציאל (הפרש הפוטנציאל בין האלקטרודות): 540 mV, מתח (משך הדופק החשמלי): 2 אלפיות השנייה, פעולה (לסירוגין כדי למתן את העוצמה המשמשת, אשר תפחית את החימום של הרקמה האורגנית של טלסון): 70%, מחזור (התאם את החזרה המחזורית): 1 שניות, ועוצמה (זרם חשמלי הזורם דרך שריר החיה): 0.75 mA.
4. יש לרסן ידנית כל בעל חיים באופן שהטלסון יעמוד במקום, בהתאם לשלבים:
   1. החזיקו את המטסומה של החיה בעזרת מלקחיים ישרים (איור 5A).
   2. לשתק את הטלזון בעזרת מלקחיים מעוקלים (איור 5B).
   3. לרסן את הטלסון ביד (איור 5C,D).
5. לאחר האיפוק, הניחו את הטלזון במגע ישיר עם מוליך האלקטרוסטימולטור, ללא צורך להשתמש בתמיסה מוליכה. השוק החשמלי גורם להתכווצות שרירים לא רצונית של בלוטת הארס וכתוצאה מכך לפליטה של הארס.
6. אספו את טיפות הארס ישירות לתוך מיקרו-צינורית פלסטיק הממוקמת קרוב למוליך האלקטרוסטימולטור (איור 6).
7. לאחר מכן, שחררו את בעל החיים בחזרה למיכל הזכוכית, בהתאם לשלבים:
   1. מעבירים את הטלזון של החיה מהיד למלקחיים המעוקלים.
   2. הניחו את בעל החיים בעדינות על תחתית מיכל הזכוכית.
8. בצע את שלבים 4.4-4.7 עם כל בעל חיים במקבל הזכוכית.
9. לאחר שכל בעלי החיים במקבל הזכוכית נחלבו, החזירו אותם למכלאה.
10. אחסנו את הארס שנאסף בטמפרטורה של -20°C עד לתהליך הליאופיליזציה.

איור 4: עקרבים במיכל הזכוכית. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: הליך ריסון לשאיבת ארס. (A) מטסומה מרוסנת במלקחיים ישרים (חץ שחור). (B) טלסון משותק עם מלקחיים מעוקלים (חץ שחור). (ג) העברת הטלזון הכבול מהמלקחיים ליד. (ד) טלסון כבול ביד. מומלץ לטפל בבעלי החיים בידיים חשופות שכן בעת שימוש בכפפות, העקרבים יכולים לתפוס את החומר בציפורניהם, מה שמקשה על שחרורם בסוף ההליך ומגדיל משמעותית את הסיכון לתאונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: מיצוי ארס. מיקרו-צינור פלסטיק (חץ לבן) הממוקם קרוב לאלקטרוסטימולטור (חץ צהוב). טיפות הארס נאספות ישירות לתוך הצינור הנשמר בטמפרטורת החדר במהלך ההליך. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות

שלושים נהלים תפעוליים סטנדרטיים (SOPs) פותחו עבור כל הליך, המבטיחים את חזרתיות הנהלים בקרב הטכנאים ועמידה בפרמטרים של איכות. שיעור התמותה הממוצע לאחר הליך החילוץ הוא סביב 12%, אשר עשוי להיחשב נמוך, בהתחשב בשגרת הגירוי החשמלי ובסביבת השבי, שם גורמי הלחץ מופחתים בהצלחה על ידי יישום ההליכים.

Discussion

יישום השיטות המתוארות מאפשר לנו לשמור על מספר גדול של פרטים של T. serrulatus ונותן לנו יכולת חיזוי עקבית של מספר העקרבים הדרושים לייצור ארס שנתי. בדרך זו, אנו מסוגלים לספק מספיק אצוות של ארס מראש כדי לספק את תהליך הייצור נגד ארס. יחד עם זאת, פיתוח לוחות זמנים קבועים מראש לתחזוקה, הזנה והפקת אר...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carboard sheet	NA	NA
Egg tray	NA	NA	cardboard 36 places egg trays
Electro stimulator device	Instituto Butantan	ART-FV-01	Internally designed for the venom extraction
Kraft paper	NA	NA	regular kraft paper
Making tape	NA	NA	White masking tape (24 mm x 50 m)
Polyproplene container	NA	NA	70 L Polypropylene box (H – 35 cm, W – 35.5 cm, L - 72 cm)
Polyproplene tray	NA	NA	Polypropylene tray (H – 3.0 cm, W – 18.5 cm, L - 30 cm)
Self-adhesive plastic	NA	NA