JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تبحث هذه الدراسة في العلاقة بين التعبير الجيني MLH1 في الدم المحيطي وسرطان القولون ، باستخدام نهج الحالات والشواهد لمقارنة مستويات التعبير لدى المرضى والضوابط الصحية المتطابقة.

Abstract

MutL homolog 1 (MLH1) هو أحد مكونات المركب غير المتجانس MutLα الذي يكتشف ويصلح عدم تطابق القاعدة الأساسية وحلقات الإدراج / الحذف الناتجة عن سوء دمج النيوكليوتيدات. في حالة عدم وجود بروتين MLH1 ، يزداد تواتر عدم التطابق غير الذي تم إصلاحه ، مما يؤدي إلى الإصابة بسرطان الأعضاء. سعت الدراسة الحالية إلى تحديد التعبير الجيني MLH1 وعلاقته بغزو الورم (T) وغزو العقدة الليمفاوية (N) في عينات الدم من مرضى سرطان القولون والمستقيم (CRC). تم الحصول على عينات دم من 36 مريضا بسرطان الثدي. تم استخراج الحمض النووي الريبي ، وتم تصنيع (كدنا) باستخدام مجموعة. تم بناء البادئات باستخدام نهج تقاطع exon-exon ، وتم اختبار جينات MLH1 و β-actin 3x باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي (Real-Time PCR). تم استخدام برنامج تحليل التعبير الجيني لتحليل البيانات ، وتم استخدام اختبار t لفحص التعبير عن MLH1 وعلاقته بمتغيرات T و N. في هذه الدراسة ، تم تضمين 36 مريضا مصابا بسرطان القولون والمستقيم ، بما في ذلك 15 (41.6٪) امرأة و 21 (58.4٪) رجلا ، بمتوسط عمر 57.35 ± 4.22 سنة وفي الفئة العمرية 26-87 عاما. أظهرت النتائج أن نسبة التعبير الجيني MLH1 في المرضى انخفضت مقارنة بالأفراد الأصحاء ، وكان الانخفاض في التعبير الجيني في مراحل مختلفة من المرض ملحوظا. أظهرت نتائج هذه الدراسة أن الحد من التعبير الجيني MLH1 له دور فعال في تطور CRC.

Introduction

سرطان القولون (CRC) هو أحد أكثر أنواع السرطان شيوعا. إنه السبب الرئيسي الرابع للوفاة المرتبطة بالسرطان في جميع أنحاءالعالم 1. وسرطان الأطفال أكثر شيوعا بين الذكور منه عند الإناث، وهو أكثر شيوعا في البلدان الصناعية بثلاث إلى أربع مرات منه في البلدان النامية. معدل الوقوع (العالمي) المعياري للعمر لكل 1 × 105 من حالات الإصابة بسرطان الخلايا المزمنة هو 19.7 في كلا الجنسين ، و 23.6 في الرجال ، و 16.3 عند الإناث2. أظهرت الدراسات الوبائية ارتباطات بيئية ونمط حياة قوية مع CRC. ترتبط السمنة واللحوم الحمراء / المصنعة والتبغ والكحول وعلاج الحرمان من الأندروجين واستئصال المرارة بزيادة متواضعة في مخاطر الإصابة بسرطان الغرضالمزمن 2،3.

يلعب عدم استقرار الكروموسومات ، وعدم استقرار الأقمار الصناعية الدقيقة ، والنمط الظاهري لميثيل جزيرة CpG (CIMP) دورا مهما في تكوين أورام CRC4. وفقا للدراسات السابقة ، تم تحديد ما يقرب من 250 طفرة مختلفة في مرضى سرطان الخلايا المزمن ، وهو ما يعادل ما يقرب من 55٪ من الطفرات المعروفة المتعلقة بجينات إصلاح عدم تطابق الحمض النووي (MMR ). يمكن أن تحدث العيوب في بروتينات إصلاح عدم التطابق بسبب طفرات السلالة الجرثومية في جينات MSH6 و MLH1 و PMS2 و MSH2 ، وتوجد معظم هذه الطفرات في جينات MLH1 و MSH2 4،5. أهم بروتين في نظام MMR ، والذي يشارك عادة في CRC ، هو MLH1. أظهرت الدراسات الحديثة أن أي تغيير في تعبير MLH1 قد يزيد من خطر الإصابة بسرطان الثدي المزمن. طفرات السلالة الجرثومية في MLH1 هي المسؤولة عن متلازمة لينش ، وهي نوع وراثي من CRC. بالإضافة إلى ذلك ، فإن 13٪ -15٪ من حالات سرطان القولون المنتشرة ناتجة عن نقص MLH1 بناء على فرط ميثيل المحفز الجسدي6،7،8.

يقع جين MLH1 على الذراع القصيرة للكروموسوم 3 في الموضع 22.2 ويحتوي على 21 إكسون9. يمكن للبروتين المشفر بواسطة جين MLH1 أن يتعاون مع نوكلياز داخلي يشارك في إصلاح عدم التطابق ، PMS2 ، لتوليد MutLα ، وهو جزء من نظام MMR. يشارك MutLα بشكل أساسي في إصلاح عدم تطابق القاعدة الأساسية وحلقات الحذف والإضافة نتيجة لتكرار الحمض النووي غير المكتمل. بالإضافة إلى ذلك ، يشارك البروتين المشفر في إشارات تلف الحمض النووي ويمكن تحويله إلى شكل ɣMutL مع بروتين MLH3 ، والذي يشارك في إصلاح عدم تطابق الحمض النووي الذي لوحظ في الانقسام الاختزالي10،11،12. أظهرت الدراسات أن MLH1 يشارك في أنشطة خلوية رئيسية أخرى ، بما في ذلك تنظيم نقاط تفتيش دورة الخلية ، وموت الخلايا المبرمج ، وإعادة التركيب المتقاطع ، وعدم التوافق الانقسامي13.

يلعب جين MLH1 دورا رئيسيا في نظام إصلاح عدم تطابق الحمض النووي (MMR). يمكن أن يؤدي العيب في وظيفة هذا الجين إلى تراكم الطفرات الجينية ، ونتيجة لذلك ، تطور سرطان القولون والمستقيم14. أظهرت الدراسات السابقة أن حوالي 55٪ من الطفرات المرتبطة بجينات MMR في مرضى سرطان الخلايا المزمن مرتبطة بطفرات جينية MLH1 . بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي انخفاض التعبير الجيني MLH1 إلى متلازمة لينش ، وهي شكل وراثي من سرطان القولون والمستقيم15،16. أيضا ، لوحظ عيب جيني MLH1 القائم على فرط ميثيل المحفز الجسدي في 13٪ -15٪ من حالات سرطان القولون والمستقيم المتفرقة17. تظهر هذه الأدلة العلمية أن جين MLH1 يعمل كمؤشر حيوي مهم في سرطان القولون والمستقيم ، ويمكن أن يوفر تحليل تعبيره معلومات قيمة حول وظيفة مسار MMR والمخاطر الجينية ل CRC18. يمكن أن يوفر قياس مستويات تعبير MLH1 في الدم المحيطي لمرضى سرطان القولون معلومات قيمة حول وظائف مسار MMR ، والذي غالبا ما يتعطل في سرطان القولون. يمكن استخدام هذه الطريقة لأغراض تنبؤية ولفهم القابلية الوراثية للإصابة بسرطان القولون19،20. وجدت دراسة حول العلاقة بين MLH1 415 طفرة موضع G إلى C وسرطان القولون والمستقيم المتقطع في المرضى الصينيين أن تواتر النمط الجيني MLH1 C / C كان أعلى بشكل ملحوظ في مرضى CRC المتقطع منه في الضوابط ، مما يشير إلى قابلية وراثية لسرطان الخلايا القلبية المتفرقة في المرضى الصينيين21. قارنت دراسة أخرى التعبير الجيني للمؤشرات الحيوية الوراثية CRC في الدم المحيطي وعينات الخزعة لمرضى التهاب الأمعاء (IBD) ، مما يسلط الضوء على إمكانات تحليل التعبير الجيني للدم المحيطي لفهم المؤشرات الحيوية المرتبطة بسرطان القولون22.

بالنظر إلى الدور المهم لجين MLH1 والدراسات التي أجريت في العقود الأخيرة مع التحليل الجزيئي عن طريق تحديد ملامح تعبير mRNA ، فقد تم تصنيف السرطانات بدقة أعلى. كان الغرض من هذه الدراسة هو التحقيق الكمي في التعبير عن MLH1 في عينات الدم المحيطية لمرضى سرطان الخلايا الليمفاوية باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي ، والتحقيق في علاقته بالعوامل المرضية ، ومراحل تطور الورم إلى طبقات جدار الأمعاء (T) ، ومراحل غزو الغدد الليمفاوية (N). أجريت هذه الدراسة على 36 مريضا بسرطان الخلايا القلبية المزمنة لإثبات التغيرات الكمية في التعبير الجيني كمؤشرات حيوية لفحص سرطان الخلايا العصبية المزمنة والتشخيص والتشخيص باستخدام عينات الدم المحيطية.

Protocol

تم إجراء بحث حالة وشواهد في المستشفى التابع 2 بجامعة نانتونغ بين أبريل 2021 ومايو 2023. الانخراط مع القسم الإداري بالمستشفى لوضع إطار الدراسة. تم الحصول على الموافقة الأخلاقية من خلال تقديم اقتراح الدراسة إلى لجنة الأخلاقيات بجامعة نانتونغ. تم اتباع المبادئ التوجيهية الأخلاقية لضمان السرية والموافقة المستنيرة.

1. توظيف المرضى وتصميم الدراسة

  1. أخذ العينات لإدراج المشاركين في الدراسة
    1. التحقيق في التعبير عن جين MLH1 في الدم المحيطي ل 36 فردا مصابا بسرطان القولون ومجموعة تحكم. وضع معايير إدراج واستبعاد واضحة لاختيار المشاركين.
    2. تجنيد الأفراد الذين تم تشخيص إصابتهم بأنواع معينة من سرطان القولون (سرطانات القولون المستقيمية السيني ، الأعور ، الصاعدة ، المستعرضة ، والهابطة الذين اعتبروا مصابين بأورام القولون والمستقيم) والحصول على موافقة مستنيرة.
    3. استبعاد الأفراد الذين يعانون من تشخيصات أو حالات أخرى للسرطان يمكن أن تربك تحليل التعبير الجيني. بالإضافة إلى ذلك ، استبعاد المشاركين الذين لديهم تاريخ من نقل الدم في آخر 3 أشهر ، وتاريخ من العلاج الكيميائي أو العلاج الإشعاعي في آخر 6 أشهر ، وتاريخ من تعاطي الكحول أو المخدرات ، وتاريخ من أمراض المناعة الذاتية أو أمراض الأمعاء الالتهابية.
  2. تصنيف عوامل الخطر السريرية وفقا لنظام التدريج TNM (الورم والعقد والورم الخبيث) ، مع مراعاة كتلة السرطان وحجم الورم وغزو الأعضاء المجاورة23،24.
    1. قسم مراحل السرطان المختلفة (0-4) بناء على بيانات ملف علم الأمراض المتاحة.
    2. قم بتقسيم معدل نمو الورم وتطوره في طبقات جدار الأمعاء (مؤشر T) إلى أربع مجموعات متميزة (T1-4 ، T0-TX) وغزو العقدة الليمفاوية (مؤشر N) إلى أربع مجموعات (N1-3 ، N0-NX).
  3. قم بإعداد مجموعة تحكم مع الأفراد الأصحاء.
    1. مطابقة المجموعة الضابطة مع مجموعة المرضى من حيث العمر والجنس. جمع البيانات الديموغرافية التفصيلية لكل مشارك لضمان المقارنة.
  4. عملية الموافقة المستنيرة
    1. قم بإعداد وثائق الموافقة المستنيرة التي تشرح الغرض من الدراسة وإجراءاتها والمخاطر المحتملة.
    2. تفاعل مع المشاركين ، ووفر لهم متسعا من الوقت لطرح الأسئلة. جمع نماذج الموافقة المستنيرة الموقعة قبل الشروع في جمع العينات.

2. استخراج وتنقية الحمض النووي الريبي

  1. جمع عينات الدم المحيطية
    1. احصل على أنابيب مطلية ب EDTA متوفرة تجاريا ومعتمدة للاستخدام السريري أو المختبري. تحقق من تاريخ انتهاء صلاحية الأنابيب. تحقق من سلامة عبوة الأنبوب.
    2. اطلب من المشارك الجلوس بشكل مريح. باستخدام حقنة معقمة ، اسحب 5 مل من الدم من الوريد الأمامي. تأكد من استرخاء المشارك ، مع تمديد الذراع لكشف الوريد. انقل عينات الدم على الفور إلى الأنابيب المحضرة ، مما يضمن الحد الأدنى من التعرض للهواء.
    3. الحفاظ على العينات عند 4 درجات مئوية أثناء النقل إلى المختبر للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي.
  2. استخدم مجموعة دم الحمض النووي الريبي المصغرة لعزل الحمض النووي الريبي باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    1. باختصار ، قم بتحلل خلايا الدم الحمراء عن طريق احتضان عينة الدم الكاملة باستخدام Buffer EL على الجليد. جهاز طرد مركزي لحبيبات الكريات البيض والتخلص من المادة الطافية. قم بتحليل الكريات البيض باستخدام Buffer RLT وقم بتجانس المحللة باستخدام عمود التقطيع.
    2. أضف الإيثانول إلى المحللة المتجانسة وانقله إلى عمود الدوران. اغسل العمود باستخدام Buffer RW1 و Buffer RPE. قم بإزالة الحمض النووي الريبي المنقى عن طريق إضافة الماء الخالي من RNase إلى العمود والطرد المركزي.
  3. تقييم كمية الحمض النووي الريبي وجودته
    1. القياس الكمي للحمض النووي الريبي: استخدم مقياس الطيف الضوئي لقياس تركيز الحمض النووي الريبي ونقائه. افتح البرنامج على الكمبيوتر المتصل. حدد خيار الحمض النووي من القائمة الرئيسية. ضع 1 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الريبي على منطقة العينة.
    2. اختبار نقاء وسلامة الحمض النووي الريبي
      ملاحظة: يمكن التحقق من سلامة وتوزيع حجم الحمض النووي الريبي الكلي المنقى باستخدام مجموعة دم الحمض النووي الريبي المصغرة عن طريق قياس الطيف الضوئي والرحلان الكهربائي للهلام. يجب أن تظهر الحمض النووي الريبي الريبوزومي على شكل عصابات أو قمم حادة. يجب أن تكون النسبة الظاهرة ل 28S rRNA إلى 18S rRNA حوالي 2: 1. إذا لم تكن العصابات الريبوسومية أو قمم عينة معينة حادة ولكنها تظهر على شكل مسحة نحو الحمض النووي الريبي الأصغر حجما ؛ من المحتمل أن تكون العينة قد عانت من تدهور كبير إما قبل أو أثناء تنقية الحمض النووي الريبي.
      1. لقياس قياس الطيف الضوئي، اخفض ذراع الجهاز وانقر فوق قياس للحصول على نسبة A260/A280. قم بتقييم نقاء عينة الحمض النووي الريبي ، بهدف الحصول على نسبة A260 / A280 بين 1.8 و 2.0.
      2. قم بإجراء الرحلان الكهربائي لجل الاغاروز بنسبة 1٪ كما هو موضح أدناه.
        1. تحضير محلول الاغاروز بنسبة 1٪ عن طريق تسخين مسحوق الاغاروز في محلول TAE حتى يذوب. أضف بروميد الإيثيديوم إلى محلول الاغاروز لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 0.5 ميكروغرام / مل. صب محلول بروميد الاغاروز والإيثيديوم في صينية صب الجل واتركه يتصلب.
          ملاحظة: بروميد الإيثيديوم عبارة عن صبغة فلورية تتداخل مع الحمض النووي الريبي لتمكين التصور تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
        2. امزج عينات الحمض النووي الريبي مع صبغة التحميل وقم بتحميلها بعناية في آبار الجل المتصلب. قم بتشغيل الرحلان الكهربائي للهلام عند 100 فولت لمدة 30 دقيقة تقريبا لفصل شظايا الحمض النووي الريبي حسب الحجم. تصور نطاقات الحمض النووي الريبي عن طريق وضع الجل على جهاز إضاءة للأشعة فوق البنفسجية أو نظام تصوير ، مما يتسبب في تألق الحمض النووي الريبي الملطخ ببروميد الإيثيديوم.
  4. تخزين الحمض النووي الريبي المستخرج
    1. خذ عينات الحمض النووي الريبي المستخرجة. قم بتقسيم الحمض النووي الريبي إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة معقمة ، باستخدام أحجام 10 ميكرولتر لكل حصة. قم بتخزين حصص الحمض النووي الريبي عند -80 درجة مئوية أو أقل.
  5. النسخ العكسي للحمض النووي الريبي إلى (كدنا)
    1. اتبع بروتوكول مجموعة النسخ العكسي. قم بإذابة الثلج وإعداد الكواشف اللازمة على الجليد وفي درجة حرارة الغرفة.
    2. قم بإجراء تفاعل التخلص من الحمض النووي الجيني لإزالة أي تلوث بالحمض النووي الجيني.
    3. قم بإعداد مزيج النسخ العكسي الرئيسي على الجليد ، والذي يحتوي على جميع المكونات باستثناء قالب الحمض النووي الريبي.
    4. أضف قالب الحمض النووي الريبي من خطوة إزالة الحمض النووي إلى مزيج النسخ العكسي الرئيسي. احتضان تفاعل النسخ العكسي عند 42 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    5. قم بتعطيل إنزيم النسخ العكسي عن طريق الحضانة عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. استخدم حصة من (كدنا) النهائي لتفاعل البوليميراز المتسلسل الفوري في الوقت الفعلي أو قم بتخزين (كدنا) عند -20 درجة مئوية لاستخدامه لاحقا.

3. تصميم التمهيدي لتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي

  1. اختيار الجينات المستهدفة والضوابط الداخلية
    1. اختر جين MLH1 كهدف للقياس الكمي بسبب ارتباطه بسرطان القولون. حدد β-actin كعنصر تحكم داخلي لتطبيع بيانات التعبير الجيني.
  2. عملية تصميم التمهيدي
    1. قم بتشغيل برنامج تصميم التمهيدي وأدخل التسلسل الجيني ل MLH1 الذي تم الحصول عليه من Ensemble أو متصفح الجينوم UCSC.
    2. اضبط درجة حرارة الانصهار (Tm) للبادئات بين 58-60 درجة مئوية ، ومحتوى GC الأمثل عند 40٪ -60٪ ، وطول التمهيدي بين 18-24 نيوكليوتيد.
    3. أدخل التسلسلات التمهيدية المصممة في قاعدة بيانات NCBI BLAST لتأكيد الخصوصية.
      1. انتقل إلى موقع BLAST على الويب ، وحدد Nucleotide BLAST. الصق التسلسلات التمهيدية في مربع البحث وانقر فوق BLAST.
      2. قم بتحليل النتائج للتأكد من عدم التنبؤ بتضخيم خارج الهدف. انظر الجدول 1 للاطلاع على التفاصيل.

4. تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي

  1. إعداد تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي. انظر الجدول 2 للاطلاع على التفاصيل.
    1. الطرد المركزي الكواشف عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق عند 10,000 × جم لجمع المحتويات في قاع الأنابيب.
    2. قم بإعداد مزيج رئيسي وفقا لبروتوكول المجموعة التجارية ، والذي يتضمن SYBR Green و buffer و dNTPs و MgCl2 و Taq polymerase.
    3. قم بتخصيص المزيج الرئيسي في أنابيب PCR ذات علامات ، مما يضمن الاتساق في الحجم عبر العينات.
    4. أضف الحجم المناسب من الاشعال الأمامية والعكسية ل MLH1 و β-actin في الأنابيب الخاصة بهما.
    5. قم بتخفيف عينات الحمض النووي الريبي إلى تركيز ثابت يبلغ 100 نانوغرام / ميكرولتر قبل النسخ العكسي والنسخ العكسي إلى (كدنا) باستخدام مجموعة النسخ العكسي.
  2. التضخيم وجمع البيانات
    1. ضع أنابيب PCR في نظام PCR في الوقت الفعلي.
    2. قم ببرمجة جهاز التدوير الحراري بظروف التدوير المحسنة: 95 درجة مئوية لمدة 20 ثانية للتمسخ ، و 54 درجة مئوية لمدة 30 ثانية للتلدين ، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية للتمديد. انظر الجدول 3 للاطلاع على التفاصيل.
    3. اضبط الجهاز على التشغيل لمدة 45 دورة.
    4. راقب التفاعل في الوقت الفعلي على واجهة برنامج النظام ، مع مراقبة منحنيات التضخيم لكل عينة.
    5. قم بتضمين عنصر تحكم سلبي بدون (كدنا) للتحقق من التلوث. كرر تشغيل PCR 3x لكل عينة لضمان موثوقية البيانات.
  3. تحليل البيانات
    1. بعد الانتهاء من الدورات ، استخدم برنامج النظام لتحليل قيم دورة العتبة (Ct). قم بتصدير قيم Ct إلى برنامج جداول بيانات لمزيد من التحليل.
    2. احسب التعبير الجيني النسبي باستخدام طريقة 2-ΔΔCt 25 ، وتطبيع البيانات إلى عنصر تحكم β-actin.

5. الكيمياء المناعية والتحليلات الجينية

  1. إجراء الكيمياء المناعية على أقسام الأنسجة لربط تعبير بروتين MLH1 بمستويات التعبير الجيني.
    1. قم بإعداد شرائح الأنسجة وتطبيق الجسم المضاد ل MLH1.
    2. استخدم الجسم المضاد الثانوي المترافق HRP ومجموعة الركيزة DAB (3،3'-Diaminobenzidine). قم بتطوير الشرائح وفقا لتعليمات المجموعة وتحليلها بالمجهر الضوئي.
  2. إجراء اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بالمثيلة واختبار عدم استقرار الأقمار الصناعية الدقيقة للتمييز بين متلازمة لينش وسرطان الغدد المزمن المتقطع.
    1. استخدم مجموعة استخراج الحمض النووي التجارية. اتبع بروتوكول المجموعة لكل من أنسجة الدم والورم.
    2. عالج الحمض النووي باستخدام مجموعة تحويل ثنائي الكبريتيت. استخدم بادئات خاصة بالمثيلة مصممة لمنطقة محفز MLH1. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل وفقا لبروتوكول المجموعة.
    3. قم بتشغيل الرحلان الكهربائي للهلام على منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل لتصور حالة المثيلة.
    4. لاختبار عدم استقرار الأقمار الصناعية الدقيقة (MSI) ، الرحلان الكهربائي الشعري باستخدام محلل جيني. قارن أطوال الأقمار الصناعية الدقيقة من خلال تحليل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل ذات العلامات الفلورية.

6. التحليل الإحصائي

  1. توظيف برنامج التحليل الإحصائي التجاري لتحليل البيانات.
    1. افتح البرنامج وأنشئ مجموعة بيانات جديدة للتعبير الجيني والبيانات الديموغرافية.
    2. أدخل قيم التعبير الجيني النسبي والبيانات الديموغرافية المقابلة في مجموعة البيانات.
    3. استخدم اختبار Kolmogorov-Smirnov لتقييم الحالة الطبيعية للبيانات.
      1. حدد تحليل من القائمة العلوية، واختر الاختبارات غير المعلمية، ثم مربعات الحوار القديمة.
      2. انقر فوق اختبار Kolmogorov-Smirnov وأدخل المتغير للتعبير الجيني. قم بتنفيذ الاختبار وتفسير المخرجات لأهمية التوزيع الطبيعي
    4. إجراء اختبارات T لمقارنة التعبير الجيني MLH1 بين مجموعات المريض والمجموعة الضابطة.
      1. حدد تحليل، ثم مقارنة الوسائل، واختر اختبار T للعينات المستقلة.
      2. قم بتعيين عضوية المجموعة (المريض أو التحكم) كمتغير التجميع والتعبير الجيني كمتغير الاختبار. قم بإجراء الاختبار وتفسير مستوى الأهمية ثنائي الذيل.
    5. احسب تغيرات الطيات في التعبير الجيني باستخدام طريقة 2-ΔΔCt 25.

النتائج

في هذه الدراسة ، تم فحص 36 مريضا مصابا بسرطان القولون بحثا عن التعبير الجيني MLH1 في الدم المحيطي وعلاقته بسرطان القولون. أظهر تحليل المتغيرات الديموغرافية أن 15 مريضا (41.6٪) كانوا من النساء ، و 21 مريضا (58.4٪) من الرجال. كان متوسط عمر المرضى 57.35 ± 4.22 سنة ، والفئة العمرية 26-87 س?...

Discussion

أجريت هذه الدراسة بهدف التحقيق في التعبير عن جين MLH1 . في هذه الدراسة ، تبين أن مستوى التعبير الجيني MLH1 قد انخفض لدى المرضى مقارنة بالأشخاص الأصحاء. بناء على دراسات تغيير الطية ، فقد تبين أن التعبير عن جين MLH1 في المرحلة الثانية والمرحلة الثالثة والمرحلة الرا...

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نود أن نعرب عن امتناننا وتقديرنا لكل من ساعدنا في إكمال هذا المسعى البحثي.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose Gel Electrophoresis EquipmentBio-RadMini-Sub Cell GT SystemsUsed to check RNA quality
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma-AldrichE9884Used as an anticoagulant for blood samples
NanoDropThermoFisher ScientificND-2000Spectrophotometer used to determine RNA purity
Real-time PCR MachineApplied BiosystemsA34322Used for RT-PCR reactions
RNA Extraction KitIntron Biotechnology Co#Cat 17061Used for RNA extraction from blood samples
SYBR Green PCR KitThermo Fisher Scientific4309155Reagents used for RT-PCR experiments

References

  1. Favoriti, P., et al. Worldwide burden of colorectal cancer: a review. Updates Surg. 68 (1), 7-11 (2016).
  2. Lotfollahzadeh, S., Recio-Boiles, A., Cagir, B. Colon cancer. StatPearls. , (2024).
  3. Rawla, P., Sunkara, T., Barsouk, A. Epidemiology of colorectal cancer: incidence, mortality, survival, and risk factors. Prz Gastroenterol. 14 (2), 89-103 (2019).
  4. Woischke, C., Michl, M., Neumann, J. Molecular pathology of colorectal cancer. Pathologie. 44 (5), 279-286 (2023).
  5. Lachit, K., Vinita, P. Study of mismatch repair protein expression by using immunohistochemistry in various carcinomas with special reference to colorectal adenocarcinomas-at a tertiary referral laboratory in India. Asian Pacific J Cancer Biol. 7 (4), 341-347 (2022).
  6. Cerretelli, G., Ager, A., Arends, M. J., Frayling, I. M. Molecular pathology of Lynch syndrome. J Pathol. 250 (5), 518-531 (2020).
  7. Tiwari, A. K., Roy, H. K., Lynch, H. T. Lynch syndrome in the 21st century: clinical perspectives. QJM. 109 (3), 151-158 (2016).
  8. Hinrichsen, I., et al. Reduced migration of MLH1 deficient colon cancer cells depends on SPTAN1. Mol Cancer. 13 (1), 1-12 (2014).
  9. Nissar, B., Shah, I. A., ul Afshan, F., Ganai, B. A. A decade in unravelling the etiology of gastric carcinogenesis in Kashmir, India - A high risk region. Gene Rep. 21 (1), 100832 (2020).
  10. Reyes, G. X., Schmidt, T. T., Kolodner, R. D., Hombauer, H. New insights into the mechanism of DNA mismatch repair. Chromosoma. 124 (4), 443-462 (2015).
  11. Rogacheva, M. V., et al. Mlh1-Mlh3, a meiotic crossover and DNA mismatch repair factor, is a Msh2-Msh3-stimulated endonuclease. J Biol Chem. 289 (9), 5664-5673 (2014).
  12. Martin, S. A. The DNA mismatch repair pathway. DNA Repair Cancer Ther. , 151-177 (2016).
  13. Fukuhara, S., et al. DNA mismatch repair gene MLH1 induces apoptosis in prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (22), 11297-11307 (2014).
  14. Boland, C. R., Goel, A., Patel, S. G. The genetic and epigenetic landscape of early-onset colorectal cancer. Colorectal Cancer. 9 (3), (2020).
  15. Özdemir, Z., et al. Uncommon variants detected via hereditary cancer panel and suggestions for genetic counseling. Mutat Res. 827, 111831 (2023).
  16. Sinicrope, F. A. Lynch syndrome-associated colorectal cancer. New Engl J Med. 379 (8), 764-773 (2018).
  17. Westwood, A., et al. Additional loss of MSH2 and MSH6 expression in sporadic deficient mismatch repair colorectal cancer due to MLH1 promoter hypermethylation. J Clin Pathol. 72 (6), 443-447 (2019).
  18. Chung, C. Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in colorectal cancer: A 2021 update on current development, evidence, and recommendation. J Oncol Pharm Pract. 28 (4), 850-869 (2022).
  19. Yu, H., et al. The mRNA level of MLH1 in peripheral blood is a biomarker for the diagnosis of hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Am J Cancer Res. 6 (5), 1135-1140 (2016).
  20. Kasprzak, A. Prognostic biomarkers of cell proliferation in colorectal cancer (CRC): From immunohistochemistry to molecular biology techniques. Cancers. 15 (18), 4570 (2023).
  21. Tao, W., Xie, Y. Study on relationship between NILH1 gene 415 locus G→G mutation and sporadic colorectal cancer in Chinese patients. Chinese J Exp Surg. 26 (6), 752-754 (2009).
  22. Martinez, E. C., Zevallos-Delgado, C., Joseph, M. Analysis of the genetic expression of colon cancer genetic biomarkers on inflammatory bowel disease on blood and biopsy samples. Genomics Gene Func. 164, S49 (2023).
  23. Rahiminejad, S., Maurya, M. R., Mukund, K., Subramaniam, S. Modular and mechanistic changes across stages of colorectal cancer. BMC cancer. 22 (1), 436 (2022).
  24. Alrushaid, N., Khan, F. A., Al-Suhaimi, E., Elaissari, A. Progress and perspectives in colon cancer pathology, diagnosis, and treatments. Diseases. 11 (4), 148 (2023).
  25. Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. An improvement of the 2ˆ(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostat Bioinfo Biomath. 3 (3), 71-85 (2013).
  26. Jurescu, A., et al. Colorectal carcinomas: Searching for new histological parameters associated with lymph node metastases. Medicina. 59 (10), 1761 (2023).
  27. Sawicki, T., et al. A review of colorectal cancer in terms of epidemiology, risk factors, development, symptoms and diagnosis. Cancers. 13 (9), 2025 (2021).
  28. Cardoso, R., et al. Overall and stage-specific survival of patients with screen-detected colorectal cancer in European countries: A population-based study in 9 countries. Lancet Reg Health Eur. 21 (1), 100458 (2022).
  29. Dekker, E., Tanis, P. J., Vleugels, J. L. A., Kasi, P. M., Wallace, M. B. Colorectal cancer. Lancet. 394 (10207), 1467-1480 (2019).
  30. Hull, M. A., Rees, C. J., Sharp, L., Koo, S. A risk-stratified approach to colorectal cancer prevention and diagnosis. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 17 (12), 773-780 (2020).
  31. Hossain, M. S., et al. Colorectal cancer: A review of carcinogenesis, global epidemiology, current challenges, risk factors, preventive and treatment strategies. Cancers. 14 (7), 1732 (2022).
  32. Guyot D'Asnières De Salins, A., et al. Discordance between immunochemistry of mismatch repair proteins and molecular testing of microsatellite instability in colorectal cancer. ESMO open. 6 (3), 100120 (2021).
  33. Chen, W., Swanson, B. J., Frankel, W. L. Molecular genetics of microsatellite-unstable colorectal cancer for pathologists. Diagn Pathol. 12 (1), 24 (2017).
  34. Li, J., et al. Role of MLH1 methylation in esophageal cancer carcinogenesis and its clinical significance. Onco Targets Ther. 11 (1), 651-663 (2018).
  35. Iyer, R. R., Pluciennik, A. DNA mismatch repair and its role in Huntington's disease. J Huntingtons Dis. 10 (1), 75-94 (2021).
  36. Rebuzzi, F., Ulivi, P., Tedaldi, G. Genetic predisposition to colorectal cancer: How many and which genes to test. Int J Mol Sci. 24 (3), 2137 (2023).
  37. Guo, L., Yu, Z., Li, Q., Liang, X., Yang, L. Correlation of MLH1 and MSH2 levels with clinicopathologic characteristics in colorectal cancer. Am J Transl Res. 15 (2), 1107-1116 (2023).
  38. Liu, Y., Yang, C., Li, W., Zhang, S., Li, L. Analysis of association of MLH1 and PMS2 gene expression with clinicopathological features in elderly patients with colorectal cancer. Chinese J Geriatrics. 1 (12), 927-930 (2020).
  39. Salem, M. E., et al. Molecular analyses of left- and right-sided tumors in adolescents and young adults with colorectal cancer. Oncologist. 25 (5), 404-413 (2020).
  40. Goshayeshi, L., et al. Prevalence and clinicopathological characteristics of mismatch repair-deficient colorectal carcinoma in early onset cases as compared with late-onset cases: a retrospective cross-sectional study in Northeastern Iran. BMJ open. 8 (8), e023102 (2018).
  41. Zaborowski, A. M., et al. Clinicopathological features and oncological outcomes of patients with young-onset rectal cancer. Br J Surg. 107 (5), 606-612 (2020).
  42. Paredes, S. R., Chan, C., Rickard, M. Immunohistochemistry in screening for heritable colorectal cancer: what to do with an abnormal result. ANZ J Surg. 90 (5), 702-707 (2020).
  43. Anvari, A. H., Ganji, S. M., Movahhed, T. K. Cellular MLH1 gene expression and pathologic factors in Iranian patients with colorectal cancer. Qom Univ Med Sci J. 14 (8), 62-70 (2020).
  44. Sahin, I. H., et al. Analysis of age, tumor-sidedness, and mismatch repair (MMR) genes with response to immune checkpoint inhibitors (ICIs) in MMR-deficient (dMMR) colorectal cancer (CRC) patients (pts): A multi-institutional study. J Clinl Oncol. 37 (15), e15029 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

MLH1 CDNA CRC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved