JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu çalışma, periferik kandaki MLH1 gen ekspresyonu ile kolon kanseri arasındaki ilişkiyi incelemekte ve hastalardaki ekspresyon seviyelerini karşılaştırmak için bir vaka kontrol yaklaşımı ve eşleştirilmiş sağlıklı kontroller kullanmaktadır.

Özet

MutL homolog 1 (MLH1), nükleotidin yanlış birleşmesinden kaynaklanan baz-baz uyumsuzluklarını ve ekleme/silme döngülerini algılayan ve düzelten heterodimerik kompleks MutLα'nın bir bileşenidir. MLH1 proteininin yokluğunda, tamir edilemeyen uyumsuzlukların sıklığı artar ve bu da organ kanseri ile sonuçlanır. Bu çalışma, kolorektal kanserli (KRK) hastalardan alınan kan örneklerinde MLH1 gen ekspresyonunu ve bunun tümör invazyonu (T) ve lenf nodu invazyonu (N) ile ilişkisini ölçmeye çalıştı. 36 KRK hastasından kan örneği alındı. RNA ekstrakte edildi ve cDNA bir kit kullanılarak sentezlendi. Primerler, ekson-ekzon bağlantı yaklaşımı kullanılarak oluşturuldu ve MLH1 ve β-aktin genleri, gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (Gerçek Zamanlı PCR) kullanılarak 3x test edildi. Verilerin analizinde gen ekspresyon analiz yazılımı kullanılmış, MLH1 ekspresyonunun ekspresyonunu ve T ve N değişkenleri ile bağlantısını incelemek için t-testi kullanılmıştır. Bu çalışmaya yaş ortalaması 57,3±5 (%41,6) ile 4,22 yıl arasında değişen ve yaşları 26-87 arasında değişen 15 (%41,6) kadın, 21 (%58,4) erkek olmak üzere 36 kolorektal kanserli hasta dahil edildi. Sonuçlar, hastalarda MLH1 gen ekspresyonu oranının sağlıklı bireylere göre azaldığını ve hastalığın farklı aşamalarında gen ekspresyonundaki azalmanın önemli olduğunu gösterdi. Bu çalışmanın sonuçları, MLH1 gen ekspresyonunun azalmasının KRK gelişiminde etkili bir role sahip olduğunu göstermiştir.

Giriş

Kolon kanseri (KRK) en sık görülen kanser türlerinden biridir. Dünya çapında kansere bağlı ölümlerin dördüncü önde gelen nedenidir1. KRK erkeklerde kadınlara göre daha sık görülür ve sanayileşmiş ülkelerde gelişmekte olan ülkelere göre üç ila dört kat daha yaygındır. KRK insidansının 1 x 105'i başına yaşa standardize (küresel) insidans oranı her iki cinsiyette de 19.7, erkeklerde 23.6 ve kadınlarda 16.3'tür2. Epidemiyolojik çalışmalar, KRK ile güçlü çevresel ve yaşam tarzı ilişkileri olduğunu göstermiştir. Obezite, kırmızı / işlenmiş et, tütün, alkol, androjen yoksunluğu tedavisi ve kolesistektominin tümü ılımlı bir şekilde artmış KRK riskleri ile ilişkilidir 2,3.

Kromozomal instabilite, mikrosatellit instabilitesi ve CpG island metilatör fenotipi (CIMP) CRC4 tümörijenezinde önemli bir rol oynamaktadır. Önceki çalışmalara göre, KRK'li hastalarda yaklaşık 250 farklı mutasyon tanımlanmıştır ve bu, DNA uyumsuzluk onarımı (MMR) genleri ile ilgili bilinen mutasyonların yaklaşık %55'ine eşdeğerdir. Uyumsuzluk onarım proteinlerindeki kusurlar, MSH6, MLH1, PMS2 ve MSH2 genlerindeki germ hattı mutasyonlarından kaynaklanabilir ve bu mutasyonların çoğu MLH1 ve MSH2 genlerindebulunur 4,5. Genellikle KRK'de yer alan MMR sistemindeki en önemli protein MLH1'dir. Son çalışmalar, MLH1 ekspresyonundaki herhangi bir değişikliğin KRK riskini artırabileceğini göstermiştir. MLH1'deki germ hattı mutasyonları, kalıtsal bir CRC türü olan Lynch Sendromundan sorumludur. Ek olarak, diffüz kolon kanseri vakalarının %13-15'i somatik promotör hipermetilasyona dayalı MLH1 eksikliğinden kaynaklanır 6,7,8.

MLH1 geni, kromozom 3'ün kısa kolunda 22.2 pozisyonunda bulunur ve 21 ekzon9 içerir. MLH1 geni tarafından kodlanan protein, MMR sisteminin bir parçası olan MutLα'yı oluşturmak için uyumsuzluk onarımında yer alan bir endonükleaz (PMS2) ile işbirliği yapabilir. MutLα esas olarak eksik DNA replikasyonunun bir sonucu olarak baz-baz uyumsuzluklarının ve silme ve ekleme döngülerinin onarımında rol oynar. Ek olarak, kodlanmış protein, DNA hasar sinyallemesinde yer alır ve mayoz10,11,12'de gözlenen DNA uyumsuzluğu onarımında yer alan MLH3 proteini ile ɣMutL formuna dönüştürülebilir. Çalışmalar, MLH1'in hücre döngüsü kontrol noktalarının düzenlenmesi, apoptoz, çapraz rekombinasyon ve mitotik uyumsuzluk dahil olmak üzere diğer önemli hücresel aktivitelerde yer aldığını göstermiştir13.

MLH1 geni, DNA uyumsuzluk onarımı (MMR) sisteminde önemli bir rol oynar. Bu genin işlevindeki bir kusur, genetik mutasyonların birikmesine ve bunun sonucunda kolorektal kanserin gelişmesine yol açabilir14. Önceki çalışmalar, CRC'li hastalarda MMR genleri ile ilişkili mutasyonların yaklaşık% 55'inin MLH1 gen mutasyonları ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Ek olarak, azalmış MLH1 gen ekspresyonu, kalıtsal bir kolorektal kanser formu olan Lynch sendromuna yol açabilir15,16. Ayrıca, sporadik kolorektal kanser vakalarının %13-15'inde somatik promotör hipermetilasyona dayalı MLH1 gen defekti gözlenmiştir17. Bu bilimsel kanıtlar, MLH1 geninin kolorektal kanserde önemli bir biyobelirteç olarak hareket ettiğini ve ekspresyon analizinin, MMR yolunun işlevi ve CRC18'in genetik riski hakkında değerli bilgiler sağlayabileceğini göstermektedir. Kolon kanserli hastaların periferik kanındaki MLH1 ekspresyon seviyelerinin ölçülmesi, kolon kanserinde sıklıkla bozulan MMR yolunun işlevselliği hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Bu yöntem prognostik amaçlarla ve kolon kanserine genetik yatkınlığı anlamak için kullanılabilir19,20. Çinli hastalarda MLH1 415 lokus G ila C mutasyonu ile sporadik kolorektal kanser arasındaki ilişki üzerine yapılan bir araştırma, MLH1 C/C genotipinin sıklığının sporadik KRK hastalarında kontrollere göre önemli ölçüde daha yüksek olduğunu buldu ve bu da Çinli hastalarda sporadik KRK'ye genetik bir duyarlılık olduğunu düşündürdü21. Başka bir çalışma, inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD) hastalarının periferik kan ve biyopsi örneklerinde CRC genetik biyobelirteçlerinin gen ekspresyonunu karşılaştırdı ve kolon kanseri ile ilişkili biyobelirteçleri anlamak için periferik kan gen ekspresyon analizinin potansiyelini vurguladı22.

MLH1 geninin önemli rolü ve son yıllarda mRNA ekspresyonunun profillenerek moleküler analizlerle yapılan çalışmalar göz önüne alındığında, kanserler daha yüksek doğrulukla sınıflandırılmıştır. Bu çalışmanın amacı, gerçek zamanlı PCR kullanılarak KRK'li hastaların periferik kan örneklerinde MLH1 ekspresyonunu kantitatif olarak araştırmak ve patolojik faktörler, tümörün barsak duvarı katmanlarına ilerlemesinin aşamaları (T) ve lenf nodlarına invazyon aşamaları (N) ile ilişkisini araştırmaktır. Bu çalışma, periferik kan örnekleri kullanılarak KRK taraması, prognozu ve tanısı için biyobelirteçler olarak gen ekspresyonunda potansiyel olarak kantitatif değişiklikler oluşturmak için 36 KRK hastasında gerçekleştirildi.

Protokol

Nisan 2021 ile Mayıs 2023 arasında Nantong Üniversitesi Bağlı Hastanesi 2'de bir vaka kontrol araştırması yapıldı. Çalışma çerçevesini oluşturmak için hastanenin idari departmanıyla iletişim kurun. Çalışma önerisi Nantong Üniversitesi Etik Kurulu'na sunularak etik onay alınmıştır. Gizlilik ve bilgilendirilmiş onam sağlamak için etik yönergeler izlendi.

1. Hasta alımı ve çalışma tasarımı

  1. Katılımcıların çalışmaya dahil edilmesi için örnekleme
    1. Kolon kanseri olan 36 bireyin ve bir kontrol grubunun periferik kanındaki MLH1 geninin ekspresyonunu araştırın. Katılımcı seçimi için net dahil etme ve hariç tutma kriterleri geliştirin.
    2. Belirli kolon kanseri türleri (kolorektal tümörlere sahip olduğu düşünülen rektosigmoid, çekum, yükselen, enine ve azalan kolon kanserleri) teşhisi konan ve bilgilendirilmiş onam alan bireyleri işe alın.
    3. Gen ekspresyon analizini karıştırabilecek diğer kanser teşhisleri veya durumları olan bireyleri hariç tutun. Ek olarak, son 3 ayda kan transfüzyonu öyküsü, son 6 ayda kemoterapi veya radyasyon tedavisi öyküsü, alkol veya uyuşturucu kullanımı öyküsü ve otoimmün hastalıklar veya inflamatuar bağırsak hastalıkları öyküsü olan katılımcıları hariç tutun.
  2. Klinik risk faktörlerini TNM (Tümör, Nodlar ve Metastaz) evreleme sistemine göre, kanser kitlesi, tümör boyutu ve komşu organlara invazyon göz önünde bulundurarak sınıflandırın23,24.
    1. Mevcut patoloji dosyası verilerine dayanarak farklı kanser evrelerini (0-4) bölün.
    2. Bağırsak duvarı katmanlarındaki tümör büyüme ve ilerleme hızını (T indeksi) dört ayrı gruba (T1-4, T0-TX) ve lenf nodu invazyonunu (N indeksi) dört gruba (N1-3, N0-NX) ayırın.
  3. Sağlıklı bireylerden oluşan bir kontrol grubu hazırlayın.
    1. Kontrol grubunu yaş ve cinsiyet açısından hasta grubuyla eşleştirin. Karşılaştırılabilirliği sağlamak için her katılımcı için ayrıntılı demografik veriler toplayın.
  4. Bilgilendirilmiş onam süreci
    1. Çalışmanın amacını, prosedürlerini ve potansiyel risklerini açıklayan bilgilendirilmiş onam belgeleri hazırlayın.
    2. Katılımcılarla etkileşim kurun ve onlara soru sormaları için yeterli zaman tanıyın. Numune toplamaya devam etmeden önce imzalı bilgilendirilmiş onay formlarını toplayın.

2. RNA'nın ekstraksiyonu ve saflaştırılması

  1. Periferik kan örneklerinin toplanması
    1. Klinik veya laboratuvar kullanımı için sertifikalı, ticari olarak temin edilebilen EDTA kaplı tüpleri edinin. Tüplerin son kullanma tarihini doğrulayın. Tüp ambalajının bütünlüğünü kontrol edin.
    2. Katılımcıya rahatça oturmasını söyleyin. Steril bir şırınga kullanarak, antekubital venden 5 mL kan alın. Damarı ortaya çıkarmak için kol uzatılmış halde katılımcının rahat olduğundan emin olun. Kan örneklerini hemen hazırlanan tüplere aktarın ve havaya minimum maruz kalmayı sağlayın.
    3. RNA bütünlüğünü korumak için numuneleri laboratuvara taşıma sırasında 4 °C'de tutun.
  2. Üreticinin talimatlarına göre RNA izolasyonu için bir RNA kan mini kiti kullanın.
    1. Kısaca, tam kan örneğini buz üzerinde Buffer EL ile inkübe ederek kırmızı kan hücrelerini parçalayın. Lökositleri peletlemek için santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Lökositleri Buffer RLT ile parçalayın ve bir parçalayıcı sütunu kullanarak lizatı homojenize edin.
    2. Homojenize lizata etanol ekleyin ve bir spin kolonuna aktarın. Sütunu Tampon RW1 ve Tampon RPE ile yıkayın. Kolona RNaz içermeyen su ekleyerek ve santrifüjleyerek saflaştırılmış RNA'yı elute edin.
  3. RNA miktarı ve kalitesinin değerlendirilmesi
    1. RNA'nın miktar tayini: RNA konsantrasyonunu ve saflığını ölçmek için bir spektrofotometre kullanın. Bağlı bilgisayardaki yazılımı açın. Ana menüden Nükleik Asit seçeneğini seçin. Örnek alanına 1 μL RNA örneği uygulayın.
    2. RNA'nın saflığını ve bütünlüğünü test edin
      NOT: RNA kan mini kiti ile saflaştırılan toplam RNA'nın bütünlüğü ve boyut dağılımı spektrofotometri ve jel elektroforezi ile kontrol edilebilir. Ribozomal RNA'lar keskin bantlar veya tepeler olarak görünmelidir. 28S rRNA'nın 18S rRNA'ya görünen oranı yaklaşık 2:1 olmalıdır. Belirli bir numunenin ribozomal bantları veya tepeleri keskin değilse, ancak daha küçük boyutlu RNA'lara doğru bir leke olarak görünüyorsa; numunenin RNA saflaştırmasından önce veya saflaştırılması sırasında büyük bir bozulma yaşamış olması muhtemeldir.
      1. Spektrofotometri ölçümü için cihazın kolunu indirin ve A260/A280 oranını elde etmek için Ölç'e tıklayın. 1,8 ile 2,0 arasında bir A260/A280 oranını hedefleyerek RNA numunesinin saflığını değerlendirin.
      2. Aşağıda açıklandığı gibi% 1 agaroz jel elektroforezi gerçekleştirin.
        1. Agaroz tozunu eriyene kadar TAE tamponunda ısıtarak% 1'lik agaroz çözeltisini hazırlayın. 0.5 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için agaroz çözeltisine etidyum bromür ekleyin. Agaroz-etidyum bromür çözeltisini bir jel döküm tepsisine dökün ve katılaşmasına izin verin.
          NOT: Etidyum bromür, UV ışığı altında görselleştirmeyi sağlamak için RNA ile etkileşime giren bir floresan boyadır.
        2. RNA örneklerini yükleme boyası ile karıştırın ve bunları katılaşmış jelin kuyucuklarına dikkatlice yükleyin. RNA parçalarını boyutlarına göre ayırmak için jel elektroforezini yaklaşık 30 dakika boyunca 100 V'ta çalıştırın. Jeli bir UV transilluminatörü veya görüntüleme sistemi üzerine yerleştirerek RNA bantlarını görselleştirin, bu da etidyum bromür lekeli RNA'nın floresan olmasına neden olur.
  4. Ekstrakte edilen RNA'nın depolanması
    1. Çıkarılan RNA örneklerini alın. RNA'yı, alikot başına 10 μL hacim kullanarak steril mikrosantrifüj tüplerine alikot edin. RNA alikotlarını -80 °C veya daha düşük bir sıcaklıkta saklayın.
  5. RNA'nın cDNA'ya ters transkripsiyonu
    1. Ters transkripsiyon kiti protokolünü takip edin. Gerekli reaktifleri buz üzerinde ve oda sıcaklığında çözdürün ve hazırlayın.
    2. Herhangi bir genomik DNA kontaminasyonunu gidermek için bir genomik DNA eliminasyon reaksiyonu gerçekleştirin.
    3. Şablon RNA dışındaki tüm bileşenleri içeren buz üzerinde ters transkripsiyon ana karışımını hazırlayın.
    4. DNA eliminasyon adımından şablon RNA'yı ters transkripsiyon ana karışımına ekleyin. Ters transkripsiyon reaksiyonunu 42 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
    5. Ters transkriptaz enzimini 95 ° C'de 3 dakika inkübe ederek inaktive edin. Anında gerçek zamanlı PCR için bitmiş cDNA'nın bir alikotunu kullanın veya cDNA'yı daha sonra kullanmak üzere -20 °C'de saklayın.

3. Gerçek zamanlı PCR için astar tasarımı

  1. Hedef genlerin seçilmesi ve iç kontroller
    1. Kolon kanseri ile ilişkisi nedeniyle kantitasyon hedefi olarak MLH1 genini seçin. Gen ekspresyon verilerinin normalizasyonu için dahili kontrol olarak β-aktini seçin.
  2. Astar tasarım süreci
    1. Astar tasarım yazılımını başlatın ve Ensemble veya UCSC Genome Browser'dan elde edilen MLH1 gen dizisini girin.
    2. Primerler için erime sıcaklığını (Tm) 58-60 °C, optimum GC içeriğini %40-60 ve primer uzunluğunu 18-24 nükleotid arasında ayarlayın.
    3. Spesifikliği doğrulamak için tasarlanan astar dizilerini NCBI BLAST veritabanına girin.
      1. BLAST web sitesine gidin, Nucleotide BLAST'ı seçin. Başlangıç dizilerini arama kutusuna yapıştırın ve BLAST'a tıklayın.
      2. Hedef dışı amplifikasyonun tahmin edilmediğinden emin olmak için sonuçları analiz edin. Ayrıntılar için Tablo 1'e bakın.

4. Gerçek zamanlı PCR

  1. Gerçek zamanlı PCR reaksiyon kurulumu. Ayrıntılar için Tablo 2'ye bakın.
    1. Tüplerin dibindeki içeriği toplamak için reaktifleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin.
    2. SYBR Green, tampon, dNTP'ler, MgCl2 ve Taq polimeraz içeren ticari kit protokolüne göre bir ana karışım hazırlayın.
    3. Ana karışımı etiketli PCR tüplerine tahsis edin ve numuneler arasında hacim tutarlılığı sağlayın.
    4. MLH1 ve β-aktin için uygun hacimde ileri ve geri primerleri ilgili tüplerine ekleyin.
    5. Ters transkripsiyondan önce RNA örneklerini 100 ng/μL'lik tutarlı bir konsantrasyona seyreltin ve bir ters transkripsiyon kiti kullanarak cDNA'ya ters transkripsiyon yapın.
  2. Amplifikasyon ve veri toplama
    1. PCR tüplerini gerçek zamanlı PCR sistemine yerleştirin.
    2. Termal döngüleyiciyi optimize edilmiş döngü koşullarıyla programlayın: denatürasyon için 20 saniye boyunca 95 °C, tavlama için 30 saniye boyunca 54 °C ve uzatma için 30 saniye boyunca 72 °C. Ayrıntılar için Tablo 3'e bakın.
    3. Makineyi 45 döngü çalışacak şekilde ayarlayın.
    4. Reaksiyonu sistemin yazılım arayüzünde gerçek zamanlı olarak izleyin ve her numune için amplifikasyon eğrilerini gözlemleyin.
    5. Kontaminasyonu kontrol etmek için cDNA içermeyen negatif bir kontrol ekleyin. Verilerin güvenilirliğini sağlamak için PCR çalıştırmasını her numune için 3 kez tekrarlayın.
  3. Veri analizi
    1. Döngüleri tamamladıktan sonra, eşik döngüsü (Ct) değerlerini analiz etmek için sistemin yazılımını kullanın. Daha fazla analiz için Ct değerlerini bir elektronik tablo programına aktarın.
    2. Verileri β-aktin kontrolüne normalleştirerek 2-ΔΔCt yöntemini25 kullanarak bağıl gen ekspresyonunu hesaplayın.

5. İmmünohistokimya ve genetik analizler

  1. MLH1 protein ekspresyonunu gen ekspresyon seviyeleri ile ilişkilendirmek için doku kesitleri üzerinde immünohistokimya yapın.
    1. Doku slaytları hazırlayın ve anti-MLH1 antikoru uygulayın.
    2. HRP ile konjuge ikincil antikor ve DAB (3,3'-Diaminobenzidin) substrat kiti kullanın. Kit talimatlarına göre slaytlar geliştirin ve bunları bir ışık mikroskobu ile analiz edin.
  2. Lynch sendromu ve sporadik CRC arasında ayrım yapmak için metilasyona özgü PCR ve mikrosatellit instabilite testi yapın.
    1. Ticari bir DNA ekstraksiyon kiti kullanın. Hem kan hem de tümör dokuları için kit protokolünü takip edin.
    2. DNA'yı bir bisülfit dönüşüm kiti ile tedavi edin. MLH1 promotör bölgesi için tasarlanmış metilasyona özgü primerler kullanın. Kit protokolüne göre PCR gerçekleştirin.
    3. Metilasyon durumunu görselleştirmek için PCR ürünlerinde jel elektroforezi çalıştırın.
    4. Mikrosatellit instabilitesi (MSI) testi için, bir genetik analizör kullanılarak kılcal elektroforez. Floresan etiketli PCR ürünlerini analiz ederek mikrosatellit uzunluklarını karşılaştırın.

6. İstatistiksel analiz

  1. Veri analizi için ticari istatistiksel analiz yazılımı kullanın.
    1. Yazılımı açın ve gen ifadesi ve demografik veriler için yeni bir veri kümesi oluşturun.
    2. Göreceli gen ekspresyon değerlerini ve karşılık gelen demografik verileri veri kümesine girin.
    3. Veri normalliğini değerlendirmek için Kolmogorov-Smirnov testini kullanın.
      1. Üst menüden Çözümle'yi seçin, Parametrik olmayan testler'i ve ardından Eski İletişim Kutuları'nı seçin.
      2. Kolmogorov-Smirnov Testine tıklayın ve gen ifadesi için değişkeni girin. Testi yürütün ve çıktıyı dağılım normalliğinin önemi için yorumlayın.
    4. Hasta ve kontrol grupları arasında MLH1 gen ekspresyonunu karşılaştırmak için T-testleri yapın.
      1. Analiz Et'i seçin, ardından Ortalamaları Karşılaştır'ı seçin ve Bağımsız Örnekler T Testi'ni seçin.
      2. Gruplandırma değişkeni olarak grup üyeliğini (hasta veya kontrol) ve test değişkeni olarak gen ifadesini atayın. Testi çalıştırın ve iki kuyruklu anlamlılık düzeyini yorumlayın.
    5. 2-ΔΔCt yöntemini25 kullanarak gen ekspresyonundaki kıvrım değişikliklerini hesaplayın.

Sonuçlar

Bu çalışmada kolon kanserli 36 hasta periferik kanda MLH1 gen ekspresyonu ve kolon kanseri ile ilişkisi açısından incelendi. Demografik değişkenler incelendiğinde 15 hastanın (%41.6) kadın, 21 hastanın (%58.4) erkek olduğu görüldü. Hastaların yaş ortalaması 57,35 ± 4,22 yıl, yaş aralığı 26-87 yıl idi. Hastaların vücut kitle indeksi (VKİ) durumları 14 hastada (%38.8) normal VKİ'ye (%18.5 ve 24.9 kg/m2) sahipken, 22 hastada (%61.2) normal...

Tartışmalar

Bu çalışma, MLH1 geninin ekspresyonunu araştırmak amacıyla yapılmıştır. Bu çalışmada hasta kişilerde MLH1 gen ekspresyon düzeyinin sağlıklı kişilere göre azaldığı gösterilmiştir. Fold değişim çalışmalarına dayanarak, hasta kişilerde Evre II, Evre III ve Evre IV'te MLH1 geninin ekspresyonunun sağlıklı insanlara göre önemli bir azalma olduğu gösterilmiştir.

Kolorektal kanser, prevalansı ve sağk...

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu araştırma çabasını tamamlamamıza yardımcı olan herkese şükranlarımızı ve takdirlerimizi sunarız.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose Gel Electrophoresis EquipmentBio-RadMini-Sub Cell GT SystemsUsed to check RNA quality
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma-AldrichE9884Used as an anticoagulant for blood samples
NanoDropThermoFisher ScientificND-2000Spectrophotometer used to determine RNA purity
Real-time PCR MachineApplied BiosystemsA34322Used for RT-PCR reactions
RNA Extraction KitIntron Biotechnology Co#Cat 17061Used for RNA extraction from blood samples
SYBR Green PCR KitThermo Fisher Scientific4309155Reagents used for RT-PCR experiments

Referanslar

  1. Favoriti, P., et al. Worldwide burden of colorectal cancer: a review. Updates Surg. 68 (1), 7-11 (2016).
  2. Lotfollahzadeh, S., Recio-Boiles, A., Cagir, B. Colon cancer. StatPearls. , (2024).
  3. Rawla, P., Sunkara, T., Barsouk, A. Epidemiology of colorectal cancer: incidence, mortality, survival, and risk factors. Prz Gastroenterol. 14 (2), 89-103 (2019).
  4. Woischke, C., Michl, M., Neumann, J. Molecular pathology of colorectal cancer. Pathologie. 44 (5), 279-286 (2023).
  5. Lachit, K., Vinita, P. Study of mismatch repair protein expression by using immunohistochemistry in various carcinomas with special reference to colorectal adenocarcinomas-at a tertiary referral laboratory in India. Asian Pacific J Cancer Biol. 7 (4), 341-347 (2022).
  6. Cerretelli, G., Ager, A., Arends, M. J., Frayling, I. M. Molecular pathology of Lynch syndrome. J Pathol. 250 (5), 518-531 (2020).
  7. Tiwari, A. K., Roy, H. K., Lynch, H. T. Lynch syndrome in the 21st century: clinical perspectives. QJM. 109 (3), 151-158 (2016).
  8. Hinrichsen, I., et al. Reduced migration of MLH1 deficient colon cancer cells depends on SPTAN1. Mol Cancer. 13 (1), 1-12 (2014).
  9. Nissar, B., Shah, I. A., ul Afshan, F., Ganai, B. A. A decade in unravelling the etiology of gastric carcinogenesis in Kashmir, India - A high risk region. Gene Rep. 21 (1), 100832 (2020).
  10. Reyes, G. X., Schmidt, T. T., Kolodner, R. D., Hombauer, H. New insights into the mechanism of DNA mismatch repair. Chromosoma. 124 (4), 443-462 (2015).
  11. Rogacheva, M. V., et al. Mlh1-Mlh3, a meiotic crossover and DNA mismatch repair factor, is a Msh2-Msh3-stimulated endonuclease. J Biol Chem. 289 (9), 5664-5673 (2014).
  12. Martin, S. A. The DNA mismatch repair pathway. DNA Repair Cancer Ther. , 151-177 (2016).
  13. Fukuhara, S., et al. DNA mismatch repair gene MLH1 induces apoptosis in prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (22), 11297-11307 (2014).
  14. Boland, C. R., Goel, A., Patel, S. G. The genetic and epigenetic landscape of early-onset colorectal cancer. Colorectal Cancer. 9 (3), (2020).
  15. Özdemir, Z., et al. Uncommon variants detected via hereditary cancer panel and suggestions for genetic counseling. Mutat Res. 827, 111831 (2023).
  16. Sinicrope, F. A. Lynch syndrome-associated colorectal cancer. New Engl J Med. 379 (8), 764-773 (2018).
  17. Westwood, A., et al. Additional loss of MSH2 and MSH6 expression in sporadic deficient mismatch repair colorectal cancer due to MLH1 promoter hypermethylation. J Clin Pathol. 72 (6), 443-447 (2019).
  18. Chung, C. Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in colorectal cancer: A 2021 update on current development, evidence, and recommendation. J Oncol Pharm Pract. 28 (4), 850-869 (2022).
  19. Yu, H., et al. The mRNA level of MLH1 in peripheral blood is a biomarker for the diagnosis of hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Am J Cancer Res. 6 (5), 1135-1140 (2016).
  20. Kasprzak, A. Prognostic biomarkers of cell proliferation in colorectal cancer (CRC): From immunohistochemistry to molecular biology techniques. Cancers. 15 (18), 4570 (2023).
  21. Tao, W., Xie, Y. Study on relationship between NILH1 gene 415 locus G→G mutation and sporadic colorectal cancer in Chinese patients. Chinese J Exp Surg. 26 (6), 752-754 (2009).
  22. Martinez, E. C., Zevallos-Delgado, C., Joseph, M. Analysis of the genetic expression of colon cancer genetic biomarkers on inflammatory bowel disease on blood and biopsy samples. Genomics Gene Func. 164, S49 (2023).
  23. Rahiminejad, S., Maurya, M. R., Mukund, K., Subramaniam, S. Modular and mechanistic changes across stages of colorectal cancer. BMC cancer. 22 (1), 436 (2022).
  24. Alrushaid, N., Khan, F. A., Al-Suhaimi, E., Elaissari, A. Progress and perspectives in colon cancer pathology, diagnosis, and treatments. Diseases. 11 (4), 148 (2023).
  25. Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. An improvement of the 2ˆ(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostat Bioinfo Biomath. 3 (3), 71-85 (2013).
  26. Jurescu, A., et al. Colorectal carcinomas: Searching for new histological parameters associated with lymph node metastases. Medicina. 59 (10), 1761 (2023).
  27. Sawicki, T., et al. A review of colorectal cancer in terms of epidemiology, risk factors, development, symptoms and diagnosis. Cancers. 13 (9), 2025 (2021).
  28. Cardoso, R., et al. Overall and stage-specific survival of patients with screen-detected colorectal cancer in European countries: A population-based study in 9 countries. Lancet Reg Health Eur. 21 (1), 100458 (2022).
  29. Dekker, E., Tanis, P. J., Vleugels, J. L. A., Kasi, P. M., Wallace, M. B. Colorectal cancer. Lancet. 394 (10207), 1467-1480 (2019).
  30. Hull, M. A., Rees, C. J., Sharp, L., Koo, S. A risk-stratified approach to colorectal cancer prevention and diagnosis. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 17 (12), 773-780 (2020).
  31. Hossain, M. S., et al. Colorectal cancer: A review of carcinogenesis, global epidemiology, current challenges, risk factors, preventive and treatment strategies. Cancers. 14 (7), 1732 (2022).
  32. Guyot D'Asnières De Salins, A., et al. Discordance between immunochemistry of mismatch repair proteins and molecular testing of microsatellite instability in colorectal cancer. ESMO open. 6 (3), 100120 (2021).
  33. Chen, W., Swanson, B. J., Frankel, W. L. Molecular genetics of microsatellite-unstable colorectal cancer for pathologists. Diagn Pathol. 12 (1), 24 (2017).
  34. Li, J., et al. Role of MLH1 methylation in esophageal cancer carcinogenesis and its clinical significance. Onco Targets Ther. 11 (1), 651-663 (2018).
  35. Iyer, R. R., Pluciennik, A. DNA mismatch repair and its role in Huntington's disease. J Huntingtons Dis. 10 (1), 75-94 (2021).
  36. Rebuzzi, F., Ulivi, P., Tedaldi, G. Genetic predisposition to colorectal cancer: How many and which genes to test. Int J Mol Sci. 24 (3), 2137 (2023).
  37. Guo, L., Yu, Z., Li, Q., Liang, X., Yang, L. Correlation of MLH1 and MSH2 levels with clinicopathologic characteristics in colorectal cancer. Am J Transl Res. 15 (2), 1107-1116 (2023).
  38. Liu, Y., Yang, C., Li, W., Zhang, S., Li, L. Analysis of association of MLH1 and PMS2 gene expression with clinicopathological features in elderly patients with colorectal cancer. Chinese J Geriatrics. 1 (12), 927-930 (2020).
  39. Salem, M. E., et al. Molecular analyses of left- and right-sided tumors in adolescents and young adults with colorectal cancer. Oncologist. 25 (5), 404-413 (2020).
  40. Goshayeshi, L., et al. Prevalence and clinicopathological characteristics of mismatch repair-deficient colorectal carcinoma in early onset cases as compared with late-onset cases: a retrospective cross-sectional study in Northeastern Iran. BMJ open. 8 (8), e023102 (2018).
  41. Zaborowski, A. M., et al. Clinicopathological features and oncological outcomes of patients with young-onset rectal cancer. Br J Surg. 107 (5), 606-612 (2020).
  42. Paredes, S. R., Chan, C., Rickard, M. Immunohistochemistry in screening for heritable colorectal cancer: what to do with an abnormal result. ANZ J Surg. 90 (5), 702-707 (2020).
  43. Anvari, A. H., Ganji, S. M., Movahhed, T. K. Cellular MLH1 gene expression and pathologic factors in Iranian patients with colorectal cancer. Qom Univ Med Sci J. 14 (8), 62-70 (2020).
  44. Sahin, I. H., et al. Analysis of age, tumor-sidedness, and mismatch repair (MMR) genes with response to immune checkpoint inhibitors (ICIs) in MMR-deficient (dMMR) colorectal cancer (CRC) patients (pts): A multi-institutional study. J Clinl Oncol. 37 (15), e15029 (2019).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

MLH1 GeniKolon KanseriGen EkspresyonuKolorektal KanserT m r nvazyonuLenf Nodu nvazyonuRNA EkstraksiyonuCDNA SenteziGer ek Zamanl PCRGen Ekspresyon AnaliziKRK HastalarTamir Edilmeyen Uyumsuzluklar

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır