MLH1 Espressione genica nel sangue periferico nei pazienti con cancro del colon e loro associazione con il cancro del colon

Riepilogo

Questo studio esamina l'associazione tra l'espressione del gene MLH1 nel sangue periferico e nel cancro del colon, utilizzando un approccio caso-controllo per confrontare i livelli di espressione nei pazienti e nei controlli sani abbinati.

Abstract

L'omologo 1 di MutL (MLH1) è un componente del complesso eterodimerico MutLα che rileva e corregge le discrepanze base-base e i loop di inserzione/delezione causati dalla mancata incorporazione di nucleotidi. In assenza della proteina MLH1, la frequenza dei disallineamenti non riparati aumenta, con conseguente cancro d'organo. L'attuale studio ha cercato di quantificare l'espressione del gene MLH1 e la sua relazione con l'invasione tumorale (T) e l'invasione linfonodale (N) in campioni di sangue di pazienti con cancro del colon-retto (CRC). I campioni di sangue sono stati ottenuti da 36 pazienti con CRC. L'RNA è stato estratto e il cDNA è stato sintetizzato utilizzando un kit. I primer sono stati costruiti utilizzando l'approccio della giunzione esone-esone e i geni MLH1 e β-actina sono stati testati 3 volte utilizzando la reazione a catena della polimerasi in tempo reale (Real-Time PCR). Per analizzare i dati è stato utilizzato un software di analisi dell'espressione genica e un t-test è stato utilizzato per esaminare l'espressione di MLH1 e la sua connessione con le variabili T e N. In questo studio sono stati inclusi 36 pazienti con carcinoma colorettale, di cui 15 (41,6%) donne e 21 (58,4%) uomini, con un'età media di 57,35 ± 4,22 anni e nella fascia di età 26-87 anni. I risultati hanno mostrato che il rapporto di espressione del gene MLH1 nei pazienti è diminuito rispetto a quello negli individui sani e la diminuzione dell'espressione genica nelle diverse fasi della malattia è stata significativa. I risultati di questo studio hanno dimostrato che la riduzione dell'espressione genica di MLH1 ha un ruolo efficace nello sviluppo del CRC.

Introduzione

Il cancro del colon (CRC) è uno dei tipi più comuni di cancro. È la quarta causa di morte correlata al cancro in tutto il mondo¹. Il CRC è più frequente nei maschi che nelle femmine ed è da tre a quattro volte più comune nei paesi industrializzati che nei paesi in via di sviluppo. Il tasso di incidenza standardizzato per età (globale) per 1 x 10⁵ di incidenza di CRC è di 19,7 in entrambi i sessi, 23,6 negli uomini e 16,3 nelle femmine². Studi epidemiologici hanno dimostrato forti associazioni ambientali e di stile di vita con il CRC. L'obesità, la carne rossa/lavorata, il tabacco, l'alcol, la terapia di deprivazione androgenica e la colecistectomia sono tutti associati a un modesto aumento dei rischi di CRC ^2,3.

L'instabilità cromosomica, l'instabilità dei microsatelliti e il fenotipo metilatore dell'isola CpG (CIMP) svolgono un ruolo importante nella tumorigenesi del CRC⁴. Secondo studi precedenti, sono state identificate circa 250 diverse mutazioni nei pazienti con CRC, che equivalgono a circa il 55% delle mutazioni note correlate ai geni di riparazione del mismatch del DNA (MMR). I difetti nelle proteine di riparazione del mismatch possono essere causati da mutazioni germinali nei geni MSH6, MLH1, PMS2 e MSH2 e la maggior parte di queste mutazioni si trova nei geni MLH1 e MSH2 ^4,5. La proteina più importante nel sistema MMR, che di solito è coinvolta nel CRC, è MLH1. Studi recenti hanno dimostrato che qualsiasi cambiamento nell'espressione di MLH1 può aumentare il rischio di CRC. Le mutazioni germinali in MLH1 sono responsabili della sindrome di Lynch, un tipo ereditario di CRC. Inoltre, il 13%-15% dei casi di cancro diffuso del colon è causato da deficit di MLH1 basato sull'ipermetilazione del promotore somatico ^6,7,8.

Il gene MLH1 si trova sul braccio corto del cromosoma 3 in posizione 22.2 e contiene 21 esoni⁹. La proteina codificata dal gene MLH1 può cooperare con un'endonucleasi coinvolta nella riparazione del mismatch, PMS2, per generare MutLα, che fa parte del sistema MMR. MutLα è principalmente coinvolto nella riparazione di disallineamenti base-base e loop di delezione e addizione come risultato di una replicazione incompleta del DNA. Inoltre, la proteina codificata è coinvolta nella segnalazione del danno al DNA e può essere convertita nella forma ɣMutL con la proteina MLH3, che è coinvolta nella riparazione del mismatch del DNA osservata nella meiosi 10,11,12. Gli studi hanno dimostrato che MLH1 è coinvolto in altre importanti attività cellulari, tra cui la regolazione dei checkpoint del ciclo cellulare, l'apoptosi, la ricombinazione crossover e l'incompatibilità mitotica¹³.

Il gene MLH1 svolge un ruolo chiave nel sistema di riparazione del mismatch del DNA (MMR). Un difetto nella funzione di questo gene può portare all'accumulo di mutazioni genetiche e, di conseguenza, allo sviluppo del cancro del colon-retto¹⁴. Studi precedenti hanno dimostrato che circa il 55% delle mutazioni associate ai geni MPR nei pazienti con CRC sono correlate alle mutazioni del gene MLH1. Inoltre, la diminuzione dell'espressione genica di MLH1 può portare alla sindrome di Lynch, che è una forma ereditaria di cancro del colon-retto^15,16. Inoltre, il difetto del gene MLH1 basato sull'ipermetilazione del promotore somatico è stato osservato nel 13%-15% dei casi sporadici di cancro del colon-retto¹⁷. Queste prove scientifiche dimostrano che il gene MLH1 agisce come un importante biomarcatore nel cancro del colon-retto e la sua analisi dell'espressione può fornire informazioni preziose sulla funzione della via MMR e sul rischio genetico di CRC¹⁸. La misurazione dei livelli di espressione di MLH1 nel sangue periferico dei pazienti con cancro del colon può fornire informazioni preziose sulla funzionalità della via MMR, che è spesso interrotta nel cancro del colon. Questo metodo può essere utilizzato a scopo prognostico e per comprendere la suscettibilità genetica al cancro del colon ^19,20. Uno studio sulla relazione tra la mutazione MLH1 415 locus G to C e il cancro colorettale sporadico nei pazienti cinesi ha rilevato che la frequenza del genotipo MLH1 C/C era significativamente più alta nei pazienti con CRC sporadico rispetto ai controlli, suggerendo una suscettibilità genetica al CRC sporadico nei pazienti cinesi²¹. Un altro studio ha confrontato l'espressione genica dei biomarcatori genetici del CRC nel sangue periferico e nei campioni bioptici di pazienti con malattia infiammatoria intestinale (IBD), evidenziando il potenziale dell'analisi dell'espressione genica del sangue periferico per la comprensione dei biomarcatori correlati al cancro del colon²².

Considerando l'importante ruolo del gene MLH1 e gli studi condotti negli ultimi decenni con l'analisi molecolare attraverso il profilo dell'espressione dell'mRNA, i tumori sono stati classificati con maggiore accuratezza. Lo scopo di questo studio è stato quello di studiare quantitativamente l'espressione di MLH1 in campioni di sangue periferico di pazienti con CRC utilizzando la PCR in tempo reale e di indagare la sua relazione con fattori patologici, stadi di progressione del tumore agli strati della parete intestinale (T) e stadi di invasione ai linfonodi (N). Questo studio è stato condotto su 36 pazienti con CRC per stabilire potenzialmente cambiamenti quantitativi nell'espressione genica come biomarcatori per lo screening, la prognosi e la diagnosi del CRC utilizzando campioni di sangue periferico.

Protocollo

Una ricerca caso-controllo è stata condotta presso l'Affiliated Hospital 2 dell'Università di Nantong tra aprile 2021 e maggio 2023. Impegnarsi con il dipartimento amministrativo dell'ospedale per stabilire il quadro di studio. L'approvazione etica è stata ottenuta presentando la proposta di studio al Comitato Etico dell'Università di Nantong. Sono state seguite linee guida etiche per garantire la riservatezza e il consenso informato.

1. Reclutamento dei pazienti e disegno dello studio

1. Campionamento per l'inclusione dei partecipanti allo studio
   1. Studiare l'espressione del gene MLH1 nel sangue periferico di 36 individui con cancro del colon e di un gruppo di controllo. Sviluppare chiari criteri di inclusione ed esclusione per la selezione dei partecipanti.
   2. Reclutare individui con diagnosi di tipi specifici di cancro del colon (cancro del colon rettosigmoideo, cieco, ascendente, trasverso e discendente che sono stati considerati affetti da tumori del colon-retto) e avere il consenso informato.
   3. Escludere individui con altre diagnosi di cancro o condizioni che potrebbero confondere l'analisi dell'espressione genica. Inoltre, escludere i partecipanti con una storia di trasfusioni di sangue negli ultimi 3 mesi, una storia di chemioterapia o radioterapia negli ultimi 6 mesi, una storia di uso di alcol o droghe e una storia di malattie autoimmuni o malattie infiammatorie intestinali.
2. Classificare i fattori di rischio clinico in base al sistema di stadiazione TNM (Tumore, Nodi e Metastasi), considerando la massa del cancro, le dimensioni del tumore e l'invasione degli organi adiacenti^23,24.
   1. Dividi i diversi stadi del cancro (0-4) in base ai dati del file patologico disponibili.
   2. Segmentare il tasso di crescita e progressione del tumore negli strati della parete intestinale (indice T) in quattro gruppi distinti (T1-4, T0-TX) e l'invasione linfonodale (indice N) in quattro gruppi (N1-3, N0-NX).
3. Prepara un gruppo di controllo con individui sani.
   1. Abbinare il gruppo di controllo al gruppo di pazienti in termini di età e sesso. Raccogli dati demografici dettagliati per ogni partecipante per garantire la comparabilità.
4. Processo di consenso informato
   1. Preparare documenti di consenso informato che spieghino lo scopo, le procedure e i potenziali rischi dello studio.
   2. Interagisci con i partecipanti, fornendo loro tutto il tempo per porre domande. Raccogli i moduli di consenso informato firmati prima di procedere con la raccolta del campione.

2. Estrazione e purificazione dell'RNA

1. Raccolta di campioni di sangue periferico
   1. Procuratevi provette rivestite in EDTA disponibili in commercio, certificate per uso clinico o di laboratorio. Verificare la data di scadenza delle provette. Verificare l'integrità dell'imballaggio del tubo.
   2. Chiedi al partecipante di sedersi comodamente. Utilizzando una siringa sterile, prelevare 5 mL di sangue dalla vena antecubitale. Assicurarsi che il partecipante sia rilassato, con il braccio teso per esporre la vena. Trasferire immediatamente i campioni di sangue nelle provette preparate, garantendo un'esposizione minima all'aria.
   3. Mantenere i campioni a 4 °C durante il trasporto in laboratorio per preservarne l'integrità.
2. Utilizzare un mini kit di sangue RNA per l'isolamento dell'RNA seguendo le istruzioni del produttore.
   1. In breve, lisare i globuli rossi incubando l'intero campione di sangue con Buffer EL su ghiaccio. Centrifugare per pellettare i leucociti e scartare il surnatante. Lisi i leucociti con il tampone RLT e omogeneizzare il lisato utilizzando una colonna trituratrice.
   2. Aggiungere etanolo al lisato omogeneizzato e trasferire in una colonna di rotazione. Lavare la colonna con Buffer RW1 e Buffer RPE. Eluire l'RNA purificato aggiungendo acqua priva di RNasi alla colonna e centrifugando.
3. Valutazione della quantità e della qualità dell'RNA
   1. Quantificazione dell'RNA: utilizzare uno spettrofotometro per misurare la concentrazione e la purezza dell'RNA. Aprire il software sul computer collegato. Seleziona l'opzione Acido nucleico dal menu principale. Applicare 1 μL di campione di RNA sull'area del campione.
   2. Testare la purezza e l'integrità dell'RNA
      NOTA: L'integrità e la distribuzione dimensionale dell'RNA totale purificato con il mini kit di sangue RNA possono essere verificate mediante spettrofotometria ed elettroforesi su gel. Gli RNA ribosomiali dovrebbero apparire come bande o picchi acuti. Il rapporto apparente tra l'rRNA 28S e l'rRNA 18S dovrebbe essere di circa 2:1. Se le bande ribosomiali o i picchi di un campione specifico non sono taglienti ma appaiono come una striscia verso RNA di dimensioni più piccole; è probabile che il campione abbia subito una degradazione maggiore prima o durante la purificazione dell'RNA.
      1. Per la misurazione spettrofotometrica, abbassare il braccio del dispositivo e fare clic su Misura per ottenere il rapporto A260/A280. Valutare la purezza del campione di RNA, puntando a un rapporto A260/A280 compreso tra 1,8 e 2,0.
      2. Eseguire l'elettroforesi su gel di agarosio all'1% come descritto di seguito.
         1. Preparare la soluzione di agarosio all'1% riscaldando la polvere di agarosio nel tampone TAE fino a dissoluzione. Aggiungere bromuro di etidio alla soluzione di agarosio per ottenere una concentrazione finale di 0,5 μg/mL. Versare la soluzione di bromuro di agarosio ed etidio in un vassoio di colata di gel e lasciarla solidificare.
            NOTA: Il bromuro di etidio è un colorante fluorescente che si intercala con l'RNA per consentire la visualizzazione sotto la luce UV.
         2. Mescolare i campioni di RNA con il colorante di caricamento e caricarli con cura nei pozzetti del gel solidificato. Eseguire l'elettroforesi su gel a 100 V per circa 30 minuti per separare i frammenti di RNA in base alle dimensioni. Visualizza le bande di RNA posizionando il gel su un transilluminatore UV o su un sistema di imaging, che provoca la fluorescenza dell'RNA colorato con bromuro di etidio.
4. Conservazione dell'RNA estratto
   1. Prelevare i campioni di RNA estratti. Aliquotare l'RNA in provette sterili per microcentrifuga, utilizzando volumi di 10 μl per aliquota. Conservare le aliquote di RNA a -80 °C o meno.
5. Trascrizione inversa dell'RNA in cDNA
   1. Segui il protocollo del kit di trascrizione inversa. Scongelare e preparare i reagenti necessari su ghiaccio e a temperatura ambiente.
   2. Eseguire una reazione di eliminazione del DNA genomico per rimuovere qualsiasi contaminazione del DNA genomico.
   3. Preparare la master mix di trascrizione inversa su ghiaccio, che contiene tutti i componenti tranne l'RNA stampo.
   4. Aggiungere l'RNA stampo dalla fase di eliminazione del DNA al master mix di trascrizione inversa. Incubare la reazione di trascrizione inversa a 42 °C per 15 minuti.
   5. Inattivare l'enzima trascrittasi inversa incubando a 95 °C per 3 minuti. Utilizzare un'aliquota del cDNA finito per la PCR immediata in tempo reale o conservare il cDNA a -20 °C per un uso successivo.

3. Progettazione di primer per la PCR in tempo reale

1. Selezione dei geni bersaglio e controlli interni
   1. Scegli il gene MLH1 come bersaglio per la quantificazione a causa della sua associazione con il cancro del colon. Selezionare la β-actina come controllo interno per la normalizzazione dei dati di espressione genica.
2. Processo di progettazione del primer
   1. Avvia il software di progettazione del primer e inserisci la sequenza genica di MLH1 ottenuta dall'Ensemble o dall'UCSC Genome Browser.
   2. Impostare la temperatura di fusione (Tm) per i primer tra 58-60 °C, il contenuto ottimale di GC al 40%-60% e la lunghezza del primer tra 18-24 nucleotidi.
   3. Inserire le sequenze di primer progettate nel database NCBI BLAST per confermare la specificità.
      1. Vai al sito web di BLAST, seleziona Nucleotide BLAST. Incolla le sequenze di primer nella casella di ricerca e fai clic su BLAST.
      2. Analizza i risultati per assicurarti che non sia prevista alcuna amplificazione fuori bersaglio. Vedere la Tabella 1 per i dettagli.

4. PCR in tempo reale

1. Configurazione della reazione PCR in tempo reale. Vedere la Tabella 2 per i dettagli.
   1. Centrifugare i reagenti a 4 °C per 5 minuti a 10.000 x g per raccogliere il contenuto sul fondo delle provette.
   2. Preparare una master mix secondo il protocollo del kit commerciale, che include SYBR Green, tampone, dNTP, MgCl₂ e Taq polimerasi.
   3. Allocare la miscela master in provette PCR etichettate, garantendo la coerenza del volume tra i campioni.
   4. Aggiungere il volume appropriato di primer diretti e inversi per MLH1 e β-actina nelle rispettive provette.
   5. Diluire i campioni di RNA a una concentrazione costante di 100 ng/μL prima della trascrizione inversa e trascrivere inversamente in cDNA utilizzando un kit di trascrizione inversa.
2. Amplificazione e raccolta dati
   1. Posizionare le provette per PCR nel sistema PCR in tempo reale.
   2. Programmare il termociclatore con le condizioni di ciclo ottimizzate: 95 °C per 20 s per la denaturazione, 54 °C per 30 s per la ricottura e 72 °C per 30 s per l'estensione. Vedere la Tabella 3 per i dettagli.
   3. Impostare la macchina in modo che funzioni per 45 cicli.
   4. Monitorare la reazione in tempo reale sull'interfaccia software del sistema, osservando le curve di amplificazione per ogni campione.
   5. Includere un controllo negativo senza cDNA per verificare la presenza di contaminazione. Ripetere l'esecuzione della PCR 3 volte per ogni campione per garantire l'affidabilità dei dati.
3. Analisi dei dati
   1. Dopo aver completato i cicli, utilizzare il software del sistema per analizzare i valori del ciclo di soglia (Ct). Esporta i valori Ct in un foglio di calcolo per ulteriori analisi.
   2. Calcolare l'espressione genica relativa utilizzando il metodo ^25-ΔΔCt, normalizzando i dati al controllo β-actina.

5. Immunoistochimica e analisi genetiche

1. Condurre immunoistochimica su sezioni di tessuto per correlare l'espressione della proteina MLH1 con i livelli di espressione genica.
   1. Preparare i vetrini di tessuto e applicare l'anticorpo anti-MLH1.
   2. Utilizzare un anticorpo secondario coniugato HRP e un kit di substrati DAB (3,3'-diaminobenzidina). Sviluppare i vetrini secondo le istruzioni del kit e analizzarli con un microscopio ottico.
2. Eseguire la PCR specifica per la metilazione e i test di instabilità dei microsatelliti per distinguere tra sindrome di Lynch e CRC sporadico.
   1. Usa un kit di estrazione del DNA commerciale. Seguire il protocollo del kit sia per il sangue che per i tessuti tumorali.
   2. Trattare il DNA con un kit di conversione del bisolfito. Utilizzare primer specifici per la metilazione progettati per la regione del promotore MLH1. Eseguire la PCR come da protocollo del kit.
   3. Eseguire l'elettroforesi su gel sui prodotti PCR per visualizzare lo stato di metilazione.
   4. Per i test di instabilità dei microsatelliti (MSI), elettroforesi capillare utilizzando un analizzatore genetico. Confronta le lunghezze dei microsatelliti analizzando i prodotti PCR marcati in fluorescenza.

6. Analisi statistica

1. Utilizzare software di analisi statistica commerciale per l'analisi dei dati.
   1. Apri il software e crea un nuovo set di dati per l'espressione genica e i dati demografici.
   2. Inserire i valori relativi di espressione genica e i dati demografici corrispondenti nel set di dati.
   3. Utilizzare il test di Kolmogorov-Smirnov per valutare la normalità dei dati.
      1. Selezionare Analizza dal menu in alto, scegliere Test non parametrici, quindi Finestre di dialogo legacy.
      2. Fare clic su Test di Kolmogorov-Smirnov e inserire la variabile per l'espressione genica. Eseguire il test e interpretare l'output per il significato della normalità della distribuzione.
   4. Condurre test T per confrontare l'espressione del gene MLH1 tra i pazienti e i gruppi di controllo.
      1. Selezionare Analizza, quindi Confronta medie e scegliere Test T a campioni indipendenti.
      2. Assegna l'appartenenza al gruppo (paziente o controllo) come variabile di raggruppamento e l'espressione genica come variabile di test. Esegui il test e interpreta il livello di significatività a due code.
   5. Calcolare le variazioni di piegatura nell'espressione genica utilizzando il metodo ^{2-ΔΔCt 25}.

Risultati

In questo studio, 36 pazienti con cancro del colon sono stati esaminati per l'espressione del gene MLH1 nel sangue periferico e la sua relazione con il cancro del colon. L'analisi delle variabili demografiche ha mostrato che 15 pazienti (41,6%) erano donne e 21 pazienti (58,4%) erano uomini. L'età media dei pazienti era di 57,35 ± 4,22 anni e la fascia di età era di 26-87 anni. Lo stato dell'indice di massa corporea (BMI) dei pazienti ha mostrato che 14 pazienti (38,8%) aveva...

Discussione

Questo studio è stato condotto con l'obiettivo di indagare l'espressione del gene MLH1 . In questo studio, è stato dimostrato che il livello di espressione del gene MLH1 era diminuito nelle persone malate rispetto alle persone sane. Sulla base di studi sul cambiamento di piega, è stato dimostrato che l'espressione del gene MLH1 in stadio II, stadio III e stadio IV nelle persone malate rispetto alle persone sane ha avuto una diminuzione significativa.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose Gel Electrophoresis Equipment	Bio-Rad	Mini-Sub Cell GT Systems	Used to check RNA quality
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E9884	Used as an anticoagulant for blood samples
NanoDrop	ThermoFisher Scientific	ND-2000	Spectrophotometer used to determine RNA purity
Real-time PCR Machine	Applied Biosystems	A34322	Used for RT-PCR reactions
RNA Extraction Kit	Intron Biotechnology Co	#Cat 17061	Used for RNA extraction from blood samples
SYBR Green PCR Kit	Thermo Fisher Scientific	4309155	Reagents used for RT-PCR experiments