Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
В этом исследовании изучается связь между экспрессией гена MLH1 в периферической крови и раке толстой кишки с использованием подхода случай-контроль для сравнения уровней экспрессии у пациентов и здоровых людей из контрольной группы.
Гомолог MutL 1 (MLH1) является компонентом гетеродимерного комплекса MutLα, который обнаруживает и исправляет несоответствия оснований и основания, а также петли вставки/делеции, вызванные неправильным включением нуклеотидов. При отсутствии белка MLH1 частота неустраненных несоответствий увеличивается, что приводит к раку органов. В текущем исследовании была предпринята попытка количественно оценить экспрессию гена MLH1 и ее связь с инвазией опухоли (T) и инвазией лимфатических узлов (N) в образцах крови пациентов с колоректальным раком (CRC). Образцы крови были получены у 36 пациентов с КРР. Была выделена РНК, а кДНК синтезирована с помощью набора. Праймеры были построены с использованием подхода экзон-экзонного перехода, а гены MLH1 и β-актина были протестированы 3 раза с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР в реальном времени). Для анализа данных использовалось программное обеспечение для анализа экспрессии генов, а для изучения экспрессии MLH1 и его связи с T и N переменными был использован t-критерий. В исследование было включено 36 пациентов с колоректальным раком, в том числе 15 (41,6%) женщин и 21 (58,4%) мужчина, со средним возрастом 57,35 ± 4,22 года и в возрастном диапазоне 26-87 лет. Результаты показали, что коэффициент экспрессии гена MLH1 у пациентов снижался по сравнению с здоровыми лицами, а снижение экспрессии генов на разных стадиях заболевания было значимым. Результаты данного исследования показали, что снижение экспрессии гена MLH1 играет эффективную роль в развитии КРР.
Рак толстой кишки (КРР) является одним из наиболее распространенных видов рака. Это четвертая по значимости причина смертности от ракаво всем мире 1. КРР чаще встречается у мужчин, чем у женщин, и в три-четыре раза чаще встречается в промышленно развитых странах, чем в развивающихся. Стандартизированный по возрасту (глобальный) показатель заболеваемости на 1 x 105 случаев КРР составляет 19,7 для обоих полов, 23,6 для мужчин и 16,3 для женщин2. Эпидемиологические исследования показали сильную связь окружающей среды и образа жизни с КРР. Ожирение, красное / обработанное мясо, табак, алкоголь, андрогенная депривационная терапия и холецистэктомия связаны с умеренно повышенным риском КРР 2,3.
Хромосомная нестабильность, микросателлитная нестабильность и фенотип метилатора острова CpG (CIMP) играют важную роль в онкогенезе CRC4. Согласно предыдущим исследованиям, у пациентов с КРР было выявлено около 250 различных мутаций, что эквивалентно примерно 55% известных мутаций, связанных с генами репарации несоответствия ДНК (MMR). Дефекты белков репарации несоответствия могут быть вызваны мутациями зародышевой линии в генах MSH6, MLH1, PMS2 и MSH2, и большинство этих мутаций обнаружено в генах MLH1 и MSH2 4,5. Самым важным белком в системе MMR, который обычно участвует в CRC, является MLH1. Недавние исследования показали, что любое изменение экспрессии MLH1 может увеличить риск развития КРР. Мутации зародышевой линии в MLH1 ответственны за синдром Линча, наследственный тип КРР. Кроме того, 13-15% случаев диффузного рака толстой кишки вызваны дефицитом MLH1 на основе гиперметилирования соматического промотора 6,7,8.
Ген MLH1 расположен на коротком плече хромосомы 3 в положении 22.2 и содержит 21 экзон9. Белок, кодируемый геном MLH1, может сотрудничать с эндонуклеазой, участвующей в репарации несоответствия, PMS2, для генерации MutLα, который является частью системы MMR. MutLα в основном участвует в исправлении несоответствий между основаниями и петлями делеции и добавления в результате неполной репликации ДНК. Кроме того, кодируемый белок участвует в передаче сигналов о повреждении ДНК и может быть преобразован в форму ɣMutL с белком MLH3, который участвует в репарации несоответствия ДНК, наблюдаемой при мейозе 10,11,12. Исследования показали, что MLH1 участвует в других основных клеточных активностях, включая регуляцию контрольных точек клеточного цикла, апоптоз, кроссинговерную рекомбинацию и митотическую несовместимость.
Ген MLH1 играет ключевую роль в системе репарации несоответствия ДНК (MMR). Дефект функции этого гена может привести к накоплению генетических мутаций и, как следствие, развитию колоректальногорака14. Предыдущие исследования показали, что около 55% мутаций, связанных с генами MMR у пациентов с КРР, связаны с мутациями гена MLH1. Кроме того, снижение экспрессии гена MLH1 может привести к синдрому Линча, который является наследственной формой колоректального рака15,16. Кроме того, дефект гена MLH1, основанный на гиперметилировании соматического промотора, наблюдался в 13-15% случаев спорадического колоректального рака17. Эти научные данные показывают, что ген MLH1 действует как важный биомаркер колоректального рака, и анализ его экспрессии может предоставить ценную информацию о функции пути MMR и генетическом риске CRC18. Измерение уровня экспрессии MLH1 в периферической крови пациентов с раком толстой кишки может предоставить ценную информацию о функциональности пути MMR, который часто нарушается при раке толстой кишки. Этот метод может быть использован в прогностических целях и для понимания генетической предрасположенности к раку толстой кишки19,20. Исследование взаимосвязи между мутацией MLH1 415 locus G to C и спорадическим колоректальным раком у китайских пациентов показало, что частота генотипа MLH1 C/C была значительно выше у пациентов со спорадическим КРР, чем в контрольной группе, что свидетельствует о генетической восприимчивости к спорадическому КРР у китайских пациентов21. В другом исследовании сравнивалась экспрессия генов генетических биомаркеров КРР в периферической крови и биопсийных образцах пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК), подчеркивая потенциал анализа экспрессии генов периферической крови для пониманиябиомаркеров, связанных с раком толстой кишки.
Учитывая важную роль гена MLH1 и проведенные в последние десятилетия исследования с молекулярным анализом путем профилирования экспрессии мРНК, рак был классифицирован с более высокой точностью. Целью данного исследования явилось количественное изучение экспрессии MLH1 в образцах периферической крови пациентов с КРР с помощью ПЦР в реальном времени, а также изучение ее взаимосвязи с патологическими факторами, стадиями прогрессирования опухоли в слои кишечной стенки (Т) и стадиями инвазии в лимфатические узлы (N). Это исследование было проведено на 36 пациентах с КРР с целью потенциального установления количественных изменений в экспрессии генов в качестве биомаркеров для скрининга КРР, прогноза и диагностики с использованием образцов периферической крови.
В период с апреля 2021 года по май 2023 года в аффилированной больнице No2 Университета Наньтун было проведено исследование типа «случай-контроль». Взаимодействуйте с административным отделом больницы для создания основы исследования. Этическое одобрение было получено путем подачи предложения об исследовании в Комитет по этике Наньтунского университета. Этические принципы были соблюдены для обеспечения конфиденциальности и информированного согласия.
1. Набор пациентов и дизайн исследования
2. Экстракция и очистка РНК
3. Дизайн праймера для ПЦР в реальном времени
4. ПЦР в реальном времени
5. Иммуногистохимия и генетические анализы
6. Статистический анализ
В этом исследовании 36 пациентов с раком толстой кишки были обследованы на экспрессию гена MLH1 в периферической крови и его связь с раком толстой кишки. Анализ демографических переменных показал, что 15 пациентов (41,6%) были женщинами, а 21 пациент (58,4%) – мужчинами. Сре?...
Данное исследование было проведено с целью изучения экспрессии гена MLH1 . В данном исследовании было показано, что уровень экспрессии гена MLH1 был снижен у больных людей по сравнению со здоровыми людьми. На основании исследований изменения складок было показа...
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Мы хотели бы выразить нашу благодарность и признательность всем, кто помог нам завершить эту исследовательскую работу.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agarose Gel Electrophoresis Equipment | Bio-Rad | Mini-Sub Cell GT Systems | Used to check RNA quality |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | Used as an anticoagulant for blood samples |
NanoDrop | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | Spectrophotometer used to determine RNA purity |
Real-time PCR Machine | Applied Biosystems | A34322 | Used for RT-PCR reactions |
RNA Extraction Kit | Intron Biotechnology Co | #Cat 17061 | Used for RNA extraction from blood samples |
SYBR Green PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | Reagents used for RT-PCR experiments |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены