JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

إدارة الدواء داخل الصفاق هو نهج غير جراحي آمن وفعال للحث على إصابة البنكرياس. قارنت هذه الدراسة خمسة بروتوكولات متميزة للحقن داخل الصفاق على الفئران للحث على درجات متفاوتة من إصابة البنكرياس وأنشأت نموذجا لإصابة البنكرياس الشديدة للتحقيق في التغيرات المرضية واستراتيجيات العلاج لالتهاب البنكرياس الحاد الوخيم (SAP).

Abstract

يشكل علاج التهاب البنكرياس الحاد الوخيم (SAP) ، مع ارتفاع معدلات الوفيات ، تحديا سريريا كبيرا. يمكن أن يساعد التحقيق في التغيرات المرضية المرتبطة ب SAP باستخدام النماذج الحيوانية في تحديد الأهداف العلاجية المحتملة واستكشاف طرق العلاج الجديدة. الدراسات السابقة تسببت في المقام الأول في إصابة البنكرياس من خلال حقن القناة الصفراوية إلى الوراء من taviaurocholate الصوديوم ، ولكن تأثير الضرر الجراحي على جودة النموذج الحيواني لا يزال غير واضح. في هذه الدراسة ، استخدمنا ترددات مختلفة من حقن Caerulein داخل الصفاق جنبا إلى جنب مع جرعات مختلفة من LPS للحث على إصابة البنكرياس في الفئران C57BL / 6J وقارنا مدى الإصابة عبر خمسة بروتوكولات حقن داخل الصفاق. فيما يتعلق بإحداث التهاب البنكرياس الحاد في الفئران ، يقترح بروتوكول الحقن داخل الصفاق الذي يؤدي إلى معدل وفيات يصل إلى 80٪ في غضون 5 أيام. على وجه التحديد ، تلقت الفئران عشر حقن يومية داخل الصفاق من Caerulein (50 ميكروغرام / كجم) ، تليها حقنة LPS (15 مجم / كجم) بعد ساعة واحدة من آخر إعطاء Caerulein. من خلال ضبط وتيرة وجرعة الأدوية المحقونة ، يمكن للمرء أن يتلاعب بشدة إصابة البنكرياس بشكل فعال. يظهر هذا النموذج قدرة تحكم قوية وله دورة نسخ متماثل قصيرة ، مما يجعله ممكنا لإكماله من قبل باحث واحد دون الحاجة إلى معدات باهظة الثمن. إنه يحاكي بشكل ملائم ودقيق خصائص المرض الرئيسية التي لوحظت في SAP البشري مع إظهار درجة عالية من التكاثر.

Introduction

يتميز التهاب البنكرياس الحاد الوخيم ببداية سريعة وتطور سريع ومعدلات وفيات عالية في مجال أمراض الجهاز الهضمي1. لطالما كان معدل الوفيات المرتفع محورا بارزا للبحوث السريرية. نظرا للتغيرات غير المتوقعة في الظروف السريرية ، وعدم تجانس مظاهر المرض ، ومحدودية توافر العينات البشرية ، أصبح إنشاء نماذج حيوانية أمرا بالغ الأهمية بشكل متزايد لأبحاث الأمراض.

يشيع استخدام الحقن الرجعي لتوروكولات الصوديوم في القناة الصفراوية المشتركة لإنشاء نموذج فئران من SAP2. من خلال محاكاة انسداد البنكرياس الصفراوي وإحداث ارتجاع الصفراء والسائل البنكرياسي ، تظهر تقنية النمذجة هذه معدل نجاح مرتفع في تكرار نماذج SAP الحيوانية. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن الجراحة الغازية لها تأثير على النموذج الحيواني نفسه. علاوة على ذلك ، تقتصر هذه الطريقة على الكبيرة ، مثل الجرذان ، والتي تستخدم في المقام الأول كمواضيع تجريبية. كثيرا ما تستخدم التقنيات البديلة ، بما في ذلك التنبيب الاثني عشر3 ، وثقب الاثني عشر المباشر4 ، والبزل المباشر للقناة الصفراويةوالبنكرياس 5 ، لأغراض النمذجة.

يوفر الحقن داخل الصفاق وطرق النمذجة الغذائية مزايا غير جراحية يمكن تطبيقها على من أي حجم. نموذج الفأر من SAP الناجم عن تغذية نقص الكولين الإيثيونين (CDE)6 يقدم بعض المضاعفات, مثل ارتفاع السكر في الدم لا يمكن السيطرة عليه ونقص كلس الدم, مما يجعلها غير مناسبة لتقييم الأساليب التشخيصية والعلاجية الجديدة. من ناحية أخرى ، يمثل الحقن داخل الصفاق من Caerulein جنبا إلى جنب مع L-arginine7 الطريقة الأكثر استخداما لإحداث التهاب البنكرياس الحاد في الفئران. على وجه التحديد ، يوفر الإعطاء المتكرر داخل الصفاق ل Caerulein - وهو نظير cholecystokinin - نهجا مناسبا للغاية للتحقيق في الجوانب المختلفة المتعلقة بهذا المرض المدمر ، بما في ذلك عمليات التسبب في المرض والالتهاب والتجديد. نظرا لتشابهه الهيكلي مع كوليسيستوكينين (CCK) ، يحفز Caerulein بشكل فعال تقلص المرارة وإفراز إنزيم البنكرياس ، مما يؤدي إلى خلل في إفراز الإنزيم يليه تدمير ذاتي لاحق8. عديد السكاريد الشحمي (LPS) ، الذي يتم نشره في كل مكان ودراسته على نطاق واسع كجزيء نمط جزيئي مرتبط بمسببات الأمراض ، يمكن دمجه مع Caerulein عن طريق الحقن داخل الصفاق لإنشاء نموذج فئران فعال ل SAP. يؤدي هذا المزيج بسرعة إلى إطلاق عدد كبير من السيتوكينات الالتهابية وإطلاقه ، مما يؤدي إلى التهاب موضعي وجهازي مفرط. أبلغت العديد من الدراسات عن تحريض نماذج SAP في الفئران من خلال الحقن داخل الصفاق من Caerulein جنبا إلى جنب مع LPS. قد يعزى ذلك إلى حقيقة أن الحقن داخل الصفاق من Caerulein يمكن أن يسبب وذمة البنكرياس ونزيف في الفئران ، في حين أن إضافة LPS يمكن أن تحفز على الفور نخر البنكرياس وتفاقم الاستجابة الالتهابية الجهازية والإنتان وحتى فشل الأعضاء. حاليا ، هناك اختلاف في جرعة وتواتر حقن Caerulein داخل الصفاق وكذلك عدم الاتساق في جرعة LPS الإضافية. يمثل تحقيق الاتساق في نماذج SAP للماوس تحديا9،10،11،12 ؛ لذلك ، من الضروري إنشاء بروتوكول موحد للحصول على نموذج مثالي. في هذه المقالة ، وصفنا بروتوكولا للحقن داخل الصفاق في الفئران والتحقيق في تردد الحقن الأمثل والجرعة الإضافية من LPS.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت مراجعة هذا البروتوكول والموافقة عليه من قبل لجنة الأخلاقيات في أول مستشفى تابع لجامعة آنهوي للعلوم والتكنولوجيا (هواينان ، الصين) (رمز الأخلاقيات: 2023-KY-905-001). اتبعت الدراسة إرشادات المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام القوارض البحثية في جميع الإجراءات الحيوانية. تم استخدام الفئران البالغة C57BL / 6J التي تزن 20-30 جم في هذه الدراسة. تم إيواء الفئران في مختبر للحيوانات لمدة أسبوع واحد في ظل ظروف خاضعة للرقابة (حوالي 21 درجة مئوية مع دورة 12 ساعة بالتناوب ليلا ونهارا). كان لدى الفئران إمكانية الوصول إلى الطعام والماء طوال الوقت. يتم سرد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في الدراسة في جدول المواد.

1. إعداد

  1. قم بتعيين 84 فأرا سليما C57BL / 6J إلى ست مجموعات ، بما في ذلك المجموعة الضابطة ، إصابة البنكرياس (PI) I ، PI II ، PI III ، PI IV ، و PI V.
  2. قبل البدء في إجراء النمذجة ، قم بتسمية كل مجموعة من الفئران بشقوق الأذن واسمح لها بالصيام لمدة 12 ساعة.

2. إعداد مخفف المخدرات المستحثة

  1. يذوب القيرولين (1 ملغ) في 1 مل من برنامج تلفزيوني ويوضع في الثلاجة عند -20 درجة مئوية.
  2. قياس وتسجيل وزن الفئران التجريبية 1 ساعة قبل الحقن داخل الصفاق للدواء.
  3. استخرج الكتلة الكلية من Caerulein المطلوبة بنسبة 50 ميكروغرام / كجم ، بناء على الوزن الإجمالي لجميع الفئران.
  4. تمييع المخدرات Caerulein التي تم الحصول عليها مع برنامج تلفزيوني مرة أخرى.
    ملاحظة: يجب أن يكون الحجم الكلي لتخفيف PBS معادلا ل 5 أضعاف قيمة الوزن الإجمالية لجميع الفئران. تم استخدام نفس طريقة التخفيف للحصول على مخفف LPS.

3. الحقن داخل الصفاق

ملاحظة: تم إعطاء الحقن داخل الصفاق لكل مجموعة من الفئران وفقا للبروتوكول المبين في الجدول التكميلي 1 للحث على النموذج. تم تجميع 10 فئران إضافية ومعالجتها مع مراعاة معدلات البقاء على قيد الحياة لمدة 7 أيام.

  1. أمسك الفئران وامسكها بطريقة تجعل بطن الفئران متجها لأعلى ويتم وضع الرأس أسفل الذيل لمنع تلف الأعضاء عند إدخال المحقنة.
  2. تطهير بطن الفئران باستخدام كرات قطنية كحولية بنسبة 75٪.
  3. امسك المحقنة في اليد اليمنى (باستخدام إبرة قياس ≤0.5 / ≥0.3) وأدخل الإبرة في الجلد تحت الجلد على الجانب الأيسر من الخط الأبيض البطني.
    ملاحظة: التغيير إلى الجانب الأيمن للحقن التالي.
  4. بمجرد وصول الإبرة إلى الطبقة تحت الجلد ، حركها للأمام حوالي 3-5 مم ، ثم أدخل إبرة المحقنة في تجويف البطن بزاوية 45 درجة. في هذه المرحلة ، ينبغي للمرء أن يشعر ببعض المقاومة.
  5. حافظ على ثبات الإبرة وحقن المادة ببطء.
    ملاحظة: لا تتجاوز 5 أضعاف قيمة وزن الفئران كحجم حقنة واحدة داخل الصفاق.
  6. بعد الحقن ، اسحب الإبرة وقم بالتدليك برفق واضغط على موقع الحقن بقطعة قطن معقمة لنشر الدواء بالكامل في تجويف البطن للفئران.
  7. استخدم حقنة جديدة لتكرارها مع الفئران التجريبية التالية.

4. اختبار القدرة السلوكية في المجال المفتوح

ملاحظة: بعد 12 ساعة من الحقن الأخير داخل الصفاق ، تم إجراء اختبار القدرة السلوكية في المجال المفتوح لتقييم مسافة النشاط الإجمالية ووقت الجمود للفئران.

  1. ضع أربعة مربعات بيضاء متطابقة أسفل الكاميرا مباشرة.
  2. قم بتوصيل الكاميرا بالكمبيوتر باستخدام كبل فيديو.
  3. تأكد من أن الصندوق التجريبي نظيف وخالي من أي روائح قبل بدء التجربة.
  4. ضع في منتصف الشبكة ، مواجها بعيدا عن المجرب ، واتركه يتكيف مع البيئة لمدة 10 دقائق.
  5. ابدأ تشغيل برنامج تتبع الفيديو وانقر على قائمة "ملف " لإنشاء تجربة جديدة.
  6. قم بإعداد المراقبة لأربعة مجالات عرض متزامنة.
  7. حدد طول وعرض الكائن التجريبي الذي يمكن أن يتحرك داخل الصندوق في شاشة المراقبة في الوقت الفعلي (30 سم × 30 سم).
  8. بمجرد اكتمال الإعداد ، ابدأ المراقبة بالفيديو والتسجيل.
  9. سجل نشاط الفئران لمدة 15 دقيقة.
  10. بعد الاختبار ، أخرج من الشبكة وأعده إلى قفصه. قم بتنظيف الشبكة جيدا باستخدام معقم يحتوي على ثاني أكسيد الكلور.

5. جمع واختبار الدم المحيطي للفئران

  1. القتل الرحيم للفئران (باتباع البروتوكول المعتمد مؤسسيا).
    1. أداء القتل الرحيم على الفئران التجريبية 36 ساعة بعد الحقن داخل الصفاق. قياس وتسجيل وزن الجسم للفئران قبل القتل الرحيم.
      ملاحظة: يتم تطبيق 0.18 مل من 10٪ كلورال هيدرات داخل الصفاق، مع ضمان عدم وجود رد فعل لتحفيز إصبع القدم أو الذيل.
    2. باليد اليسرى ، قم بتأمين الفئران ، وباليد اليمنى ، أمسك المقص لتقليم الشعيرات على جانب واحد من الفئران.
    3. اضغطي برفق على الجلد حول العين للحث على احتقان وبروز مقلة العين.
    4. استخدم ملقط منحني للإمساك بمقلة العين وإزالتها بسرعة ، وجمع الدم المحيطي في أنبوب طرد مركزي دقيق.
      ملاحظة: تم استخدام نوعين مختلفين من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، أحدهما يحتوي على مضادات التخثر والآخر بدونها.
    5. في الوقت نفسه ، اضغط برفق على منطقة قلب الفئران بالإصبع الأوسط من اليد اليسرى لزيادة سرعة ضخ القلب.
  2. اترك الدم المحيطي بدون مضادات التخثر في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  3. قياس تركيزات الأميليز في الدم (إيمي) والليباز (الشفاه) باستخدام محلل كيميائي حيوي آلي من خلال طريقة معدل الإنزيم وطريقة دوران الإنزيم (باتباع تعليمات الشركة المصنعة).
  4. تحديد مستويات المؤشرات الالتهابية مثل Pro Calcitonin (PCT) في البلازما باستخدام طريقة التلألؤ الكيميائي باستخدام جهاز تصوير التلألؤ الكيميائي التجاري (باتباع تعليمات الشركة المصنعة).
  5. استخدم مجموعات ELISA لقياس مستويات HMGB-1 و IL-6 و TNF-α في مصل الفئران (باتباع تعليمات الشركة المصنعة).
  6. تحليل الدم المحيطي المعالج بمضادات التخثر باستخدام محلل خلايا الدم الأوتوماتيكي بالكامل لتقييم المعلمات ذات الصلة.

6. جمع أنسجة البنكرياس وإعداد قسم البارافين

  1. ضع الفئران في وضع ضعيف وقم بتثبيتها على طبق رغوي.
  2. حلق المنطقة وعهرها ، ثم قم بعمل شق متوسط في البطن واقلب أنبوب الأمعاء الدقيقة إلى اليمين لكشف البنكرياس بالكامل.
  3. افصل الاثني عشر وقناة البواب وحدد مكان الأمعاء الدقيقة أسفل البنكرياس. حرر أنسجة البنكرياس بالكامل على طول القناة المعوية.
  4. استخدم ملقط بلا أسنان لربط الطحال وسحبه برفق لأعلى.
    ملاحظة: لا تلمس أنسجة البنكرياس مباشرة ، وتجنب استخدام القوة المفرطة أثناء عملية التفكك بأكملها.
  5. تشريح أنسجة رباط البنكرياس الخلفي بحدة حتى رأس البنكرياس وفصل القناة الصفراوية والأوعية الدموية.
  6. قم بإزالة أنسجة البنكرياس ، واتركها تجف رطوبة السطح بورق ماص ، وقم بوزنها وتسجيلها.
  7. ثبت نصف أنسجة البنكرياس بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد وقم بتخزين النصف الآخر في الثلاجة عند -80 درجة مئوية.
  8. تحضير أقسام البارافين البنكرياس باتباع الخطوات أدناه.
    1. نظف أنسجة البنكرياس الثابتة بنسبة 75٪ كحول وقم بقصها إلى حجم 0.5 سم × 0.5 سم تقريبا.
    2. اغمر الأنسجة في 70٪ إيثانول لمدة 20 دقيقة ، و 80٪ إيثانول لمدة 20 دقيقة أخرى ، و 90٪ إيثانول لمدة 15 دقيقة.
    3. عالج الأنسجة مرتين بالإيثانول بنسبة 95٪ لمدة 15 دقيقة في كل مرة ثم مرتين بإيثانول 100٪ لمدة 5 دقائق في كل مرة.
    4. قم بإخضاع الأنسجة لجولتين من 12 دقيقة و 5 دقائق من العلاج بمحلول الزيلين للشفافية.
    5. نقع الأنسجة الشفافة في خزان الشمع على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    6. قم بتضمين المنديل في البارافين المذاب واتركه ليبرد. الحصول على أقسام البارافين البنكرياس مع القطاعة (سمك: 5 ميكرومتر).
    7. قم بتسطيح شرائح البارافين التي تم الحصول عليها في ماء 45 درجة مئوية ، وقم بتركيبها وتجفيفها (ظروف الخبز: 40 درجة مئوية لمدة 14-16 ساعة).

7. تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوسين (H&E & E)

  1. ضع أقسام البارافين البنكرياسية في الزيلين الأول والثاني لمدة 30 دقيقة ، ثم في اللامائية ، 95٪ ، 85٪ ، و 75٪ كحول لمدة 5 دقائق لكل منهما ، وماء عالي النقاء لمدة 5 دقائق.
  2. تلطيخ نواة الخلية مع الهيماتوكسيلين لمدة 160 ثانية ، ثم شطف بالماء الجاري ببطء.
  3. ضع محلول تمايز كحول حمض الهيدروكلوريك لمدة 5-10 ثوان ، ثم اشطفه بالماء الجاري بسرعة.
  4. عالج الأقسام بالكحول اللامائي لمدة 5 دقائق.
  5. احتضان السيتوبلازم مع يوزين لمدة 30 ثانية ، ثم شطف بالماء الجاري.
  6. اغمر الأقسام في 75٪ و 85٪ و 95٪ و 100٪ إيثانول لمدة 10 ثوان لكل منها ، ثم عالج بالزيلين لمدة 5 دقائق حتى يجف.
  7. أخيرا ، أغلق الأقسام براتنج محايد وراقبها تحت المجهر.
  8. أداء التهديف المرضي والمعايير13.
    ملاحظة: تحديد شدة التهاب البنكرياس بناء على مؤشرات مثل الوذمة ، نخر العنيبات ، النزيف ، النزف ونخر الدهون ، والالتهاب الالتهابي وحول الأوعية. استخدم إرشادات التنفيذ المنشورة مسبقا لتسجيل13.

8. تلطيخ مناعي كيميائي

  1. قم بإزالة الشمع من الأجزاء المضمنة في البارافين من أنسجة البنكرياس في الزيلين ثم أعد ترطيبها في تدرج من محاليل الإيثانول.
  2. قم بإجراء حجب الإنزيم الداخلي باستخدام 3٪ H2O2 لمدة 20 دقيقة بعد تمزق الغشاء لمدة 30 دقيقة.
  3. سد الجسم المضاد مع مصل الأبقار 5٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، ثم احتضان طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع تخفيف 1: 1500 من الأرانب المضادة HMGB1.
  4. شطف المقاطع مع برنامج تلفزيوني ، ثم احتضانها في الأجسام المضادة الثانوية المقابلة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بإجراء تطوير لون DAB ، وتلطيخ الهيماتوكسيلين ، وختمه بصمغ محايد.

9. طريقة TUNEL للكشف عن موت الخلايا المبرمج في أقسام البنكرياس

  1. قم بإزالة الشمع من أقسام البارافين البنكرياسية في الزيلين لمدة 5 دقائق ، كرر مرتين واغسلها بالإيثانول المتدرج (100٪ لمدة 5 دقائق ، 90٪ لمدة دقيقتين ، 70٪ لمدة دقيقتين ، والماء المقطر لمدة دقيقتين).
  2. اغسل السائل الزائد المحيط بأقسام البارافين باستخدام برنامج تلفزيوني. عالج كل عينة ب 100 ميكرولتر من Proteinase K ، مما يضمن تغطية كاملة للأنسجة. احتضان العينات على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، نقع العينات في برنامج تلفزيوني 3 مرات ، في كل مرة لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: تم تحضير محلول Proteinase K عن طريق تخفيف محلول Proteinase K الأصلي (200 ميكروغرام / مل) مع PBS بنسبة 1: 9 (حجم) ، مما أدى إلى تركيز نهائي قدره 20 ميكروغرام / مل ، باستثناء DNase. يعد الغسيل الشامل ل Proteinase K ضروريا لتجنب التداخل مع تفاعلات وضع العلامات اللاحقة.
  3. أضف كمية مناسبة من 3٪ H2O2 (مخففة بواسطة PBS) على الأنسجة للتسلل إليها بالكامل واحتضانها لمدة 20 دقيقة. شطف الأنسجة مع برنامج تلفزيوني 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    ملاحظة: يجب أن تبقى أقسام البارافين رطبة. لتعطيل البيروكسيديز الداخلي في الأنسجة ، يجب ألا يكون وقت الحضانة طويلا جدا لمنع الإيجابيات الكاذبة بسبب كسر الحمض النووي الناجم عن 3٪ H2O2.
  4. قم بتغطية كامل مساحة العينة المراد اختبارها ب 50 ميكرولتر من محلول التوازن واحتضانها لمدة 10 دقائق.
  5. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المخزن المؤقت للتوازن. ثم أضف 56 ميكرولتر من المخزن المؤقت لحضانة TdT إلى كل عينة من الأنسجة واحتضانها لمدة 1 ساعة (في درجة حرارة الغرفة).
    ملاحظة: يجب عدم ترك الشريحة تجف ، ويجب تجنب التعرض للضوء. تم تحضير المخزن المؤقت لحضانة TdT وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (إنزيم TdT المؤتلف: مزيج وضع العلامات Biotin-dUTP: Equilibration Buffer = 1 μL: 5 μL: 50 μL).
  6. اغسل عينات الأنسجة باستخدام برنامج تلفزيوني على الفور. شطفها 4 مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما. قم بإزالة أي محلول PBS زائد برفق حول العينات باستخدام ورق الترشيح.
  7. أضف 100 ميكرولتر من محلول تفاعل Streptavidin-HRP المخفف مسبقا (Streptavidin-HRP: TBST = 1: 300) إلى كل عينة نسيج لتفاعل Streptavidin-HRP. احتضان لمدة 30 دقيقة. ثم اغسل العينات باستخدام برنامج تلفزيوني واشطفها 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها.
  8. قم بإجراء تلطيخ DAB بإضافة 50 ميكرولتر من DAB إلى كل قسم من البارافين. مراقبة تلطيخ تحت المجهر في الوقت الحقيقي. بعد ظهور تلطيخ إيجابي ، ضع الشرائح على الفور في صندوق رطب. أوقف التفاعل عن طريق غسله بالماء النقي.
  9. اغمر الشرائح في محلول تلطيخ الهيماتوكسيلين لمدة 3-5 دقائق ، ثم اشطفها بالماء النقي.
  10. التفريق في محلول تمايز الهيماتوكسيلين لحوالي 2 ثانية ، يليه الشطف الفوري بالماء النقي.
  11. تحقيق اللون الأزرق باستخدام محلول rebluing الهيماتوكسيلين لبضع ثوان ، وشطف الشرائح نظيفة بالماء النقي.
    ملاحظة: إجراء الفحص المجهري بعد تلطيخ النووي. إذا كان التلوين مظلما جدا ، فأعد الشرائح إلى محلول التمايز. إذا كان التلوين خفيفا جدا ، فأعد تشغيل عملية التلوين من خطوة التلوين النووي.
  12. جفف العينات ب 4 جولات من الإيثانول اللامائي الطازج لمدة 5 دقائق لكل منها. ثم انقعها في البيوتانول لمدة 5 دقائق وفي الزيلين لمدة 5 دقائق. أخيرا ، استخدم الزيلين الطازج لمدة 5 دقائق أخرى.
  13. قم بتركيب الشرائح باستخدام اللثة المحايدة. اتركها تجف في الهواء بشكل طبيعي أو جففها في فرن على حرارة 60 درجة مئوية.
  14. إجراء الفحص النسيجي باستخدام مجهر الضوء الأبيض. سوف تظهر نوى موت الخلايا المبرمج باللون البني.
  15. حساب مؤشر موت الخلايا المبرمج المقابلة (الذكاء الاصطناعي).
    ملاحظة: راقب الشرائح بطريقة مزدوجة التعمية. في الشرائح الموجبة ل TUNEL ، حدد عشوائيا 5 مناطق موجبة تحت التكبير العالي (400x) ، واحسب ما لا يقل عن 100 خلية أسينار في كل منطقة لتحديد النسبة المئوية للخلايا الموجبة. الذكاء الاصطناعي = (إجمالي عدد الخلايا المبرمج / إجمالي عدد الخلايا) × 100٪.

10. قياس التدفق الخلوي

  1. الحصول على أنسجة البنكرياس الطازجة وغسلها جيدا بعد تعطير مع برنامج تلفزيوني.
  2. تحضير محلول هضم كولاجيناز IV 0.5٪ واستخدام مقص الأنسجة المعقمة لهضم أنسجة البنكرياس بشكل كاف.
  3. أضف محلول إنهاء الهضم BSA بنسبة 5٪ اعتمادا على حالة شظايا البنكرياس والعكارة السائلة ، وطرد الخليط في درجة حرارة منخفضة لمدة 5 دقائق (~ 300 × جم ، 4 درجات مئوية).
  4. تخلص من المادة الطافية لإنهاء عملية الهضم.
  5. تحضير وسط زراعة الخلايا الذي يحتوي على فلوريد فينيل ميثان سلفونيل (PMSF) و 2.5٪ معلق لخلايا مصل الأبقار الجنينية لإعادة تعليق خلايا البنكرياس.
  6. قم بتصفية معلقات الخلايا العنيبية البنكرياسية من خلال شبكة نايلون مكونة من 200 شبكة للحصول على معلقات الخلايا من خلال ترشيح الخلايا.
  7. أجهزة الطرد المركزي تعليق خلية acinar البنكرياس في درجة حرارة منخفضة (اتبع الشروط كما هو مذكور في الخطوة 10.3).
  8. تخلص من المادة الطافية.
  9. اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني مبرد مسبقا.
  10. أعد تعليق الخلايا برفق في مخزن مؤقت ربط 1x مبرد مسبقا من خلال تعليق الطرد المركزي.
  11. قم بتسمية خلايا acinar البنكرياسية ب Annexin V-FITC / PI وفقا لتعليمات الشركة المصنعة بعد ضبط تركيز الخلية.
  12. استخدم قياس التدفق الخلوي في غضون 1 ساعة للكشف عن موت الخلايا المبرمج في خلايا أسينار البنكرياس.

11. الكشف عن اللطخة الغربية ل Caspase-3 و HMGB-1

  1. استخراج بروتين البنكرياس.
    1. استخراج 50 ملغ من أنسجة البنكرياس وقطعها إلى شظايا صغيرة.
    2. أضف 1 مل من محلول تحلل RIPA (يحتوي على PMSF ومثبط الأنزيم البروتيني المفسفر).
    3. تجانس أنسجة البنكرياس على الثلج لمدة 5 دقائق باستخدام مطحنة كهربائية.
    4. احتضان الأنسجة المتجانسة على الجليد مع هز لطيف لمدة 2 ساعة.
    5. جهاز طرد مركزي متجانس عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق عند 4500 × جم.
    6. اجمع المحلول الطافي واحفظه في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
  2. أداء كمية البروتين.
    1. خفف حجما معينا من عينة BSA القياسية (25 مجم / مل) إلى تركيز 0.5 مجم / مل.
    2. قم بإعداد كمية محددة من محلول عمل BCA عن طريق خلط 50 مجلدا من محلول BCA A مع حجم 1 من محلول BCA B ، مما يضمن خلطا شاملا ومتساويا.
    3. ضع عينة BSA القياسية في فتحات العينة القياسية على لوحة 96 بئرا بترتيب 0 و 1 و 2 و 4 و 8 و 12 و 16 و 20 ميكرولتر. وازن حجم كل ثقب بالماء المقطر ، مما ينتج عنه حجم إجمالي يبلغ 20 ميكرولتر.
    4. أضف 2 ميكرولتر من العينات إلى فتحات العينة ، ثم أضف بالتتابع 18 ميكرولتر من الماء المقطر للتخفيف (1: 9).
    5. املأ كل بئر ب 200 ميكرولتر من محلول عمل BCA واتركه يقف عند 37 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة تقريبا.
    6. قم بقياس الامتصاص بطول موجي 562 نانومتر. احسب تركيز البروتين للعينات بناء على المنحنى القياسي.
    7. أضف حجما محددا من محلول تكسير RIPA ومخفف المخزن المؤقت لتخفيف العينات حتى يصل التركيز إلى 5-10 ميكروغرام / ميكرولتر ، وهو ما يعتبر مناسبا.
    8. قم بتخزين العينات في درجة حرارة -20 درجة مئوية بعد تمسخ البروتين (100 درجة مئوية ؛ 10 دقائق).
  3. أداء النشاف الغربي.
    1. قم بالاستعدادات ل SDS-PAGE.
      1. قم بتركيب قوالب صنع الغراء وفحص أداء الختم.
      2. أضف TEMED إلى لاصق الفصل بنسبة 10٪ واخلطه بالتساوي.
      3. حقن الخليط في القالب ، وهو ما يمثل ما يقرب من ثلثي الحجم ، مع تجنب الفقاعات.
      4. أضف الأيزوبروبانول إلى القالب واضغط على المادة اللاصقة لمدة 40 دقيقة تقريبا.
      5. استخدم نفس البرنامج لتكوين المادة اللاصقة المركزة بنسبة 5٪.
      6. اسكب الأيزوبروبانول وأضف المادة اللاصقة على الفور.
      7. ضع المشط عموديا حتى يتبلمر الغراء تماما.
    2. إجراء عملية الكهربائي.
      1. أضف العينة المراد اختبارها بترتيب التحكم التجريبي المتوقع ، بترتيب عكسي ، في فتحات أخذ العينات للمادة اللاصقة SDS-PAGE.
      2. أضف علامة البروتين في نفس الوقت لتحديد موقع البروتين المستهدف والبروتين المرجعي الداخلي.
      3. ضع العينة في خزان الرحلان الكهربائي بعد اكتمال إضافة العينة.
      4. في البداية ، قم بتشغيل 80 فولت لمدة 30 دقيقة ، متبوعا بتشغيل الجل لفصل البروتين عند 100 فولت لمدة 60 دقيقة.
        ملاحظة: يجب الانتباه إلى موضع البروموفينول الأزرق لتجنب الرحلان الكهربائي المفرط.
    3. إجراء نقل البروتين.
      1. قص فيلم PVDF في الزاوية اليمنى العليا ليكون بمثابة علامة.
      2. ضع فيلم PVDF في محلول ميثانول لمدة 5-10 ثوان للتنشيط.
      3. انقع فيلم PVDF في محلول كهربائي لمدة 15 دقيقة تقريبا.
      4. قم بإزالة الجل بعناية بعد الرحلان الكهربائي وقم بقص الجل الزائد ، مع ضمان بقاء الجل رطبا طوال العملية.
      5. قم بتجميع الجبيرة بالترتيب التالي: لوحة سالبة → إسفنجة → ثلاث طبقات من ورق الترشيح → هلام → فيلم PVDF → ثلاث طبقات من ورق الترشيح → الإسفنج → اللوحة الموجبة.
        ملاحظة: تأكد من عدم وجود فقاعات بين الجل وفيلم PVDF.
      6. ضع المشبك المجمع في الأخدود الدوار الرطب (أسود إلى أسود) مع وضع مكعبات الثلج حوله.
      7. قم بتشغيل الطاقة وابدأ نقل الفيلم عند 400 مللي أمبير لمدة 100 دقيقة.
    4. أداء ختم فيلم PVDF ، وحضانة الأجسام المضادة الأولية والثانوية.
      1. قم بإزالة فيلم PVDF برفق بعد النقل واشطفه باستخدام TBST لمدة 10 دقائق ، كرر العملية 3-5 مرات.
      2. أغلق فيلم PVDF في 5٪ حليب خالي الدسم لمدة 2 ساعة.
      3. قم بإزالة فيلم PVDF واشطفه باستخدام TBST لمدة 10 دقائق ، كرر العملية 4 مرات.
      4. ضع فيلم PVDF والجسم المضاد الأولي المخفف معا في الثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية مع رج لطيف واحتضانه طوال الليل.
      5. قم بإزالة فيلم PVDF في اليوم التالي واشطفه باستخدام TBST لمدة 10 دقائق ، وكرر العملية 4 مرات.
      6. احتضان فيلم PVDF في مخفف الأجسام المضادة الثانوية المسمى HRP لمدة 2 ساعة تقريبا.
      7. شطف فيلم PVDF مع TBST لمدة 10 دقائق ، كرر العملية 4 مرات.
    5. فضح الفيلم وتحليله.
      1. ضع محلول ECL المحضر على الفيلم بالتساوي.
      2. قم بتعريض الفيلم في غرفة مظلمة باستخدام مقياس التعرض لمدة 2-3 دقائق تقريبا ثم قم بتخزينه.
      3. قم بإجراء التحليل باستخدام برنامج image J.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يوضح الشكل 1 عملية النمذجة التجريبية للفأر. بعد 12 ساعة من اكتمال الحقن ، تم استخدام مسجل فيديو مفتوح المجال لمراقبة مسافة الحركة ومدة الجمود لمجموعات تجريبية مختلفة من الفئران لمدة 5 دورات (الشكل 2 أ). خلال الدورات الخمس ، حافظت الفئران في مجموعة PI V ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

حاليا ، هناك نقص في الوسائل الفعالة لتحسين معدل الوفيات المرتفع في المرضى الذين يعانون من التهاب البنكرياس الحاد الوخيم. من الأهمية بمكان التحقيق في فعالية الأدوية في تعزيز آليات الاستقرار المناعي. توجد حاجة ملحة لنموذج حيواني مثالي لالتهاب البنكرياس الحاد الشديد. تستخدم الفئران ذات الخ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذه الدراسة من خلال مشاريع بحثية في مجال الصحة والعلوم الطبية في مدينة هواينان (No. HNWJ2023005) ؛ برنامج خطة العلوم والتكنولوجيا التوجيهية البلدية في مدينة هواينان (رقم 2023151) ؛ برنامج التدريب على الابتكار وريادة الأعمال لطلاب كلية مقاطعة آنهوي (رقم S202310361254) ؛ الدفعة التاسعة من "50· نجوم العلوم والتكنولوجيا" فرق الابتكار في مدينة هواينان ومشروع البناء التخصصي السريري الرئيسي في مقاطعة آنهوي. نود أن نعرب عن امتناننا لقسم المختبرات في المستشفى التابع الأول لجامعة آنهوي للعلوم والتكنولوجيا لتوفير بيانات الاختبار ذات الصلة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
20× Citric Acid Antigen Repair Solution (pH 6.0)Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaG1202-250 ml
AmylaseMindray,China
Annexin V-FITC/PIWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China G1511  diluted at 1:20
Anti-HMGB1 Rabbit pABWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaGB11103  diluted at 1:1800
BCA protein quantitative detection kitWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaG2026-200T
BD FACSCanto II Flow CytometerBD Life Sciences, San Jose, CA, 95131, USABD FACSCanto II
BSAWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaGC305010-100g
C57BL/6JCavion Experimental Animal Co., Changzhou, Chinalicense number SCXY (Su) 2011–0003
Ceruletide MCE, New Jersey, USA17650-98-5 50 µg/kg
Chemiluminescence imagerCytiva CO.,LTD.;USA
Citric acid antigen repair Solution (Dry powder pH 6.0)Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaG1201-5 L
Collagenase IVWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China GC3050140.5 mg/mL
DAB (SA-HRP) Tunel Cell Apoptosis Detection KitWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaG1507-100 T
Dimension EXL with LM Integrated Chemistry SystemSiemens Healthcare Diagnostics Inc.Brookfield,USAYZB/USA 8311-2014
ECL developerWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China
Eosin dye (alcohol soluble)Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaG1001-100 ml
EthoVision XT Noldus, Netherlands
FITC-labeled goat anti-rabbit IgGWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaGB22303  diluted at 1:50
Fully automatic blood cell analyzerZybio Inc. China Zybio-Z3 CRP
GapDHWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaGB11103  diluted at 1:1500
Hematoxylin blue return solutionWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaG1040-500 ml
Hematoxylin differentiation solutionWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaG1039-500 ml
Hematoxylin dyeWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaG1004-100 ml
HMGB-1 ELISA kitsnjjcbio Co., Ltd, China
HOMOGENIZERWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaKZ-III-F;IC111150 100222
HRP-labeled goat anti-rabbit IgGWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaGB23303  diluted at 1:1500
IL-6 ELISA kitsWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaGEM0001
Lipase Mindray,China
Lipopolysaccharide Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaGC20500915 mg/kg
Low temperature high speed centrifugeChangsha Pingfan Apparatus&Instrument Co.,Ltd.,ChinaTGL-20M
Membrane breaking liquidWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaG1204
microtomeJinhua Craftek Instrument Co., Ltd.;ChinaCR-601ST
Nylon meshWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China200-mesh
One-step TUNEL cell apoptosis detection kit (DAB staining method)Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaG1507-100T
Paraffin tissue embedding machinePRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO.,LTD;Changzhou,ChinaPBM-A
Pathological tissue drying apparatusPRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO.,LTD;Changzhou,ChinaPHY-III
Phosphate-buffered salineWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaG4202-100ML
PMSFWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaG2008-1 ml
Positive fluorescence microscopeOlympus Corporation,Tokyo, JapanBX53
Pro CalcitoninMindray,China
PVDF membraneMillipore, USA0.22 µm
RIPAWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaG2002-100 ml
SDS-PAGEBeyotime Biotechnology,ChinaP0012A
TNF-αELISA kitsWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaGEM0004
Ultrasonic water bathDONGGUAN KQAO ULTRASONIC EQUIPMENT CO.,LTD.;ChinaKQ-200KDE
Western BlotBio-Rad Laboratories, Inc.,USA
Western blot imaging SystemGlobal Life Sciences IP Holdco LLC, JAPANAmersham ImageQuant 800 
Whirlpool mixerSCILOGEX;USA

References

  1. Gliem, N., Ammer-Herrmenau, C., Ellenrieder, V., Neesse, A. Management of severe acute pancreatitis: An update. Digestion. 102 (4), 503-507 (2021).
  2. Duan, F., et al. GDF11 ameliorates severe acute pancreatitis through modulating macrophage M1 and M2 polarization by targeting the TGFbetaR1/SMAD-2 pathway. Int Immunopharmacol. 108, 108777(2022).
  3. Zhang, X. P., et al. Preparation method of an ideal model of multiple organ injury of rat with severe acute pancreatitis. World J Gastroenterol. 13 (34), 4566-4573 (2007).
  4. Bluth, M. H., Patel, S. A., Dieckgraefe, B. K., Okamoto, H., Zenilman, M. E. Pancreatic regenerating protein (reg I) and reg I receptor mRNA are upregulated in rat pancreas after induction of acute pancreatitis. World J Gastroenterol. 12 (28), 4511-4516 (2006).
  5. Qiu, F., Lu, X. S., Huang, Y. K. Effect of low molecular weight heparin on pancreatic micro-circulation in severe acute pancreatitis in a rodent model. Chin Med J (Engl). 120 (24), 2260-2263 (2007).
  6. Lombardi, B., Estes, L. W., Longnecker, D. S. Acute hemorrhagic pancreatitis (massive necrosis) with fat necrosis induced in mice by DL-ethionine fed with a choline-deficient diet. Am J Pathol. 79 (3), 465-480 (1975).
  7. Liu, Y., et al. Deletion of XIAP reduces the severity of acute pancreatitis via regulation of cell death and nuclear factor-kappaB activity. Cell Death Dis. 8 (3), e2685(2017).
  8. Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: Protective effects of proglumide, benzotript, and secretin. Gastroenterology. 88, 5 Pt 1 1192-1204 (1985).
  9. Zhou, X., et al. DPP4 inhibitor attenuates severe acute pancreatitis-associated intestinal inflammation via Nrf2 signaling. Oxid Med Cell Longev. 2019, 6181754(2019).
  10. Yang, J., et al. Heparin protects severe acute pancreatitis by inhibiting HMGB-1 active secretion from macrophages. Polymers (Basel). 14 (12), 2470(2022).
  11. Kong, L., et al. Sitagliptin activates the p62-Keap1-Nrf2 signalling pathway to alleviate oxidative stress and excessive autophagy in severe acute pancreatitis-related acute lung injury. Cell Death Dis. 12 (10), 928(2021).
  12. Tan, J. H., et al. ATF6 aggravates acinar cell apoptosis and injury by regulating p53/AIFM2 transcription in severe acute pancreatitis. Theranostics. 10 (18), 8298-8314 (2020).
  13. Schmidt, J., et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy. Ann Surg. 215 (1), 44-56 (1992).
  14. Luo, C., et al. Abdominal paracentesis drainage attenuates severe acute pancreatitis by enhancing cell apoptosis via PI3K/AKT signaling pathway. Apoptosis. 25 (3-4), 290-303 (2020).
  15. Fontaine, D. A., Davis, D. B. Attention to background strain is essential for metabolic research: C57BL/6 and the international knockout mouse consortium. Diabetes. 65 (1), 25-33 (2016).
  16. Wan, J., et al. Pancreas-specific CHRM3 activation causes pancreatitis in mice. JCI Insight. 6 (17), e132585(2021).
  17. Sah, R. P., et al. Cerulein-induced chronic pancreatitis does not require intra-acinar activation of trypsinogen in mice. Gastroenterology. 144 (5), 1076-1085 (2013).
  18. Wang, K., et al. Activation of AMPK ameliorates acute severe pancreatitis by suppressing pancreatic acinar cell necroptosis in obese mice models. Cell Death Discov. 9 (1), 363(2023).
  19. Jin, C., Li, J. C. Establishment of a severe acute pancreatitis model in mice induced by combined Rain Frog Peptide and lipopolysaccharide and exploration of its mechanism. Acta Exp Bio Sinica. 36 (2), 91-96 (2003).
  20. Tan, J. H., et al. ATF6 aggravates acinar cell apoptosis and injury by regulating p53/AIFM2 transcription in severe acute pancreatitis. Theranostics. 10 (18), 8298-8314 (2020).
  21. Roy, R. V., et al. Pancreatic Ubap2 deletion regulates glucose tolerance, inflammation, and protection from Caerulein-induced pancreatitis. Cancer Lett. 578, 216455(2023).
  22. Chen, R., Kang, R., Tang, D. The mechanism of HMGB1 secretion and release. Exp Mol Med. 54 (2), 91-102 (2022).
  23. Murao, A., Aziz, M., Wang, H., Brenner, M., Wang, P. Release mechanisms of major DAMPs. Apoptosis. 26 (3-4), 152-162 (2021).
  24. Liu, T., et al. Accuracy of circulating histones in predicting persistent organ failure and mortality in patients with acute pancreatitis. Br J Surg. 104 (9), 1215-1225 (2017).
  25. Li, N., Wang, B. M., Cai, S., Liu, P. L. The role of serum high mobility Group Box 1 and Interleukin-6 levels in acute pancreatitis: A meta-analysis. J Cell Biochem. 119 (1), 616-624 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

207 C57BL 6J

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved