通过 Caerulein 和 Lipopolysaccharide 联合腹腔注射制备严重急性胰腺炎小鼠模型

摘要

腹腔注射药物给药是一种安全有效的非侵入性胰腺损伤方法。本研究比较了小鼠五种不同的腹腔注射方案诱导不同程度的胰腺损伤，并建立了严重胰腺损伤模型，以研究严重急性胰腺炎 （SAP） 的病理变化和治疗策略。

摘要

严重急性胰腺炎 （SAP） 的治疗死亡率高，带来了重大的临床挑战。使用动物模型研究与 SAP 相关的病理变化有助于确定潜在的治疗靶点和探索新的治疗方法。既往研究主要通过逆行胆管注射他韦罗胆酸钠诱导胰腺损伤，但手术损伤对动物模型质量的影响仍不清楚。在这项研究中，我们采用不同频率的腹腔注射 Caerulein 联合不同剂量的 LPS 诱导 C57BL/6J 小鼠胰腺损伤，并比较了五种腹腔注射方案的损伤程度。关于诱导小鼠急性胰腺炎，提出了一种腹膜内注射方案，导致 5 天内死亡率高达 80%。具体来说，小鼠每天腹膜内注射 10 次 Caerulein （50 μg/kg），然后在最后一次 Caerulein 给药后 1 小时注射 LPS （15 mg/kg）。通过调整注射药物的频率和剂量，可以有效地控制胰腺损伤的严重程度。该模型表现出较强的可控性，并且复制周期短，因此可以由单个研究人员完成，而无需昂贵的设备。它方便、准确地模拟了在人类 SAP 中观察到的关键疾病特征，同时表现出高度的可重复性。

引言

重症急性胰腺炎的特点是消化系统疾病领域¹ 内起病迅速、进展迅速、死亡率高。其高病死率一直是临床研究的突出重点。由于临床状况的不可预测变化、疾病表现的异质性以及人类标本的有限可用性，建立动物模型对于疾病研究变得越来越重要。

逆行将牛磺胆酸钠注射到胆总管中通常用于创建 SAP² 的大鼠模型。通过模拟胰胆梗阻并诱导胆汁和胰液反流，这种建模技术在复制 SAP 动物模型方面表现出很高的成功率。但是，应该注意的是，侵入性手术确实对动物模型本身有影响。此外，这种方法仅限于大型动物，例如大鼠和狗，它们主要用作实验对象。替代技术，包括十二指肠插管³ （duodenal intubation）、直接十二指肠穿刺⁴ （direct duodenal puncture） 和胆管-胰管直接穿刺⁵ （direct puncture of the bile duct-pancreatic duct），经常用于建模目的。

腹膜内注射和饮食建模方法具有非侵入性优势，可应用于任何大小的动物。通过喂养胆碱缺乏乙硫氨酸 （CDE）⁶ 诱导的 SAP 小鼠模型存在某些并发症，例如难以控制的高血糖和低钙血症，使其不适合评估新的诊断和治疗方法。另一方面，腹膜内注射 Caerulein 联合 L-精氨酸⁷ 是诱导小鼠急性胰腺炎最常用的方法。具体来说，Caerulein（一种胆囊收缩素类似物）的重复腹膜内给药为研究与这种破坏性疾病相关的各个方面提供了一种非常合适的方法，包括发病机制、炎症和再生过程。由于其结构与胆囊收缩素 （CCK） 相似，Caerulein 可有效刺激胆囊收缩和胰酶分泌，导致酶分泌失衡，随后发生自毁⁸。脂多糖 （LPS） 作为一种病原体相关分子模式分子普遍存在并被广泛研究，可通过腹腔注射与 Caerulein 结合，建立有效的 SAP 小鼠模型。这种组合会迅速触发并释放大量炎性细胞因子，导致过度的局部和全身炎症。几项研究报道了通过腹膜内注射 Caerulein 联合 LPS 在小鼠中诱导 SAP 模型。这可能是由于腹腔注射 Caerulein 可引起小鼠胰腺水肿和出血，而加入 LPS 可立即诱导胰腺坏死并加剧全身炎症反应、败血症甚至器官衰竭。目前，腹膜内 Caerulein 注射的剂量和频率存在差异，额外 LPS 剂量也存在不一致。在小鼠 SAP 模型中实现一致性具有挑战性 9,10,11,12;因此，有必要建立一个标准化的协议来获得理想的模型。在本文中，我们描述了一种小鼠腹腔注射方案，并研究了 LPS 的最佳注射频率和额外剂量。

研究方案

该协议由安徽科技大学第一附属医院（中国淮南）伦理委员会审查和批准（伦理守则:2023-KY-905-001）。该研究遵循美国国立卫生研究院 （National Institutes of Health） 关于在所有动物手术中照顾和使用研究啮齿动物的指南。本研究使用体重 20-30 g 的 C57BL/6J 成年小鼠。将小鼠在受控条件下（约 21 °C，昼夜交替循环 12 小时）在动物实验室中饲养一周。小鼠在整个过程中都可以随意获取食物和水。材料 表中列出了研究中使用的试剂和设备的详细信息。

1. 动物准备

1. 将 84 只健康的 C57BL/6J 小鼠分为 6 组，包括对照组、胰腺损伤 （PI） I、PI II、PI III、PI IV 和 PI V。
2. 在开始建模程序之前，用耳槽标记每组小鼠，并让它们禁食 12 小时。

2.诱导药物稀释剂的制备

1. 将 Caerulein （1 mg） 溶解在 1 mL PBS 中，并在 -20 °C 下冷藏。
2. 在腹膜内注射药物前 1 小时测量并记录实验小鼠的体重。
3. 根据所有小鼠的总重量，以 50 μg/kg 的比例提取所需的 Caerulein 总质量。
4. 再次用 PBS 稀释获得的 Caerulein 药物。
   注:PBS 稀释液的总体积应等于所有小鼠总重量值的 5 倍。采用相同的稀释法获得 LPS 稀释剂。

3. 腹腔注射

注意:根据 补充表 1 中概述的方案对每组小鼠进行腹膜内注射以诱导模型。另外 10 只小鼠被分组并接受治疗，观察 7 天生存率。

1. 抓住并握住小鼠，使小鼠的腹部朝上，头部的位置低于尾巴，以防止在插入注射器时损伤器官。
2. 使用 75% 酒精棉球对小鼠的腹部进行消毒。
3. 用右手握住注射器（使用测量为 ≤0.5/≥0.3 的针头），然后将针头插入腹部白线左侧的皮下皮肤。
   注:更改为右侧进行下一次进样。
4. 针头到达皮下层后，将其向前移动约 3-5 毫米，然后将注射器针头以 45° 角插入腹腔。在这一点上，人们应该感到一些阻力。
5. 保持针头不动并缓慢注入物质。
   注意:不要超过小鼠体重值的 5 倍作为单次腹膜内注射的体积。
6. 注射后，拔出针头，用无菌棉签轻轻按摩和按压注射部位，使药物充分扩散到小鼠的腹腔中。
7. 使用新注射器对下一个实验小鼠重复。

4. 旷场行为能力测试

注意:最后一次腹膜内注射后 12 小时，进行旷场行为能力测试以评估小鼠的总活动距离和不动时间。

1. 将四个相同的白色框放在相机正下方。
2. 使用视频电缆将相机连接到计算机。
3. 在开始实验之前，请确保实验盒干净且无任何异味。
4. 将动物放在网格的中间，背对实验者，并让它适应环境 10 分钟。
5. 启动视频跟踪软件，然后单击 File 菜单以创建新实验。
6. 为四个同步视野设置监控。
7. 在实时监控屏幕（30 cm × 30 cm）中标记可在箱内移动的实验物体的长度和宽度。
8. 设置完成后，开始视频监控和录制。
9. 记录小鼠的活动 15 分钟。
10. 测试后，将动物从网格中取出并放回笼子中。使用含有二氧化氯的灭菌剂彻底清洁网格。

5. 收集和检测小鼠的外周血

1. 对小鼠实施安乐死（遵循机构批准的方案）。
   1. 腹膜内注射后 36 小时对实验小鼠实施安乐死。在安乐死前测量并记录小鼠的体重。
      注意:腹膜内注射 0.18 mL 10% 水合氯醛，确保对脚趾或尾巴的刺激没有反应。
   2. 用左手固定鼠标，用右手握住剪刀修剪鼠标一侧的胡须。
   3. 轻轻按压眼睛周围的皮肤，以诱导眼球充血和突出。
   4. 使用弯曲的镊子抓住眼球并快速取出，将外周血收集在微量离心管中。
      注意:使用了两种不同类型的微量离心管，一种含有抗凝剂，另一种不含。
   5. 同时，用左手中指轻轻按压小鼠的心脏区域，以增加心脏的泵血速度。
2. 将不含抗凝剂的外周血在室温下放置 30 分钟。
3. 使用自动生化分析仪通过酶速率法和酶循环法（遵循制造商的说明）测量血清淀粉酶 （Amy） 和脂肪酶 （Lip） 的浓度。
4. 使用商用化学发光成像仪（按照制造商的说明），使用化学发光方法确定血浆中炎症指示物的水平，例如降钙素原 （PCT）。
5. 使用 ELISA 试剂盒测量小鼠血清中的 HMGB-1、IL-6 和 TNF-α 水平（遵循制造商的说明）。
6. 使用全自动血细胞分析仪分析用抗凝剂处理的外周血，以评估相关参数。

6. 收集胰脏组织并准备石蜡切片

1. 将小鼠置于仰卧位并将它们固定在泡沫板上。
2. 剃除并消毒该区域，然后在腹部中间切开，将小肠管向右翻转，以完全暴露胰腺。
3. 断开十二指肠和幽门管，找到胰腺下方的小肠。沿肠导管完全释放胰腺组织。
4. 用无牙镊子夹住脾脏，轻轻向上拉。
   注意:请勿直接接触胰组织，并在整个解离过程中避免用力过猛。
5. 锐利地解剖胰后韧带组织直至胰头，并断开胆管和血管。
6. 取出胰组织，用吸水纸拍干表面水分，称重并记录。
7. 用 4% 多聚甲醛固定一半胰腺组织，并将另一半储存在 -80 °C 的冰箱中。
8. 按照以下步骤准备胰腺石蜡切片。
   1. 用 75% 酒精清洁固定的胰腺组织，并将其修剪成大约 0.5 厘米× 0.5 厘米的尺寸。
   2. 将组织浸入 70% 乙醇中 20 分钟，再用 80% 乙醇浸泡 20 分钟，用 90% 乙醇浸泡 15 分钟。
   3. 用 95% 乙醇处理组织两次，每次 15 分钟，然后用 100% 乙醇处理两次，每次 5 分钟。
   4. 用二甲苯溶液对组织进行两轮 12 分钟和 5 分钟的处理以提高透明度。
   5. 将透明纸巾在 65 °C 的蜡罐中浸泡 1 小时。
   6. 将组织包埋在融化的石蜡中并使其冷却。用切片机（厚度:5 μm）获得胰腺石蜡切片。
   7. 将获得的石蜡切片在45°C水中压平，封片并干燥（烘烤条件:40°C持续14-16小时）。

7. 苏木精和伊红 （H&E） 染色

1. 将胰腺石蜡切片置于二甲苯 I 和 II 中 30 分钟，然后在无水、95%、85% 和 75% 酒精中各 5 分钟，在超纯水中各 5 分钟。
2. 用苏木精对细胞核染色 160 秒，然后用流水缓慢冲洗。
3. 应用盐酸醇分化液 5-10 秒，然后用流水快速冲洗。
4. 用无水酒精处理切片 5 分钟。
5. 将细胞质与伊红孵育 30 秒，然后用流水冲洗。
6. 将切片浸入 75%、85%、95% 和 100% 乙醇中各 10 秒，然后用二甲苯处理 5 分钟脱水。
7. 最后，用中性树脂密封切片并在显微镜下观察。
8. 进行病理评分和标准¹³.
   注意:根据水肿、腺泡坏死、出血、出血和脂肪坏死以及炎症和血管周围炎症等指标确定胰腺炎的严重程度。使用之前发布的¹³ 分实施指南。

8. 免疫组化染色

1. 在二甲苯中对胰腺组织的石蜡包埋切片脱蜡，然后在乙醇溶液的梯度中再水化。
2. 膜破裂 30 分钟后，使用 3% H₂O₂ 进行内源性酶封闭 20 分钟。
3. 在室温下用 5% 牛血清封闭抗体 30 分钟，然后在 4°C 下用 1:1500 稀释的兔抗 HMGB1 孵育过夜。
4. 用 PBS 冲洗切片，然后在 37 °C 下将它们与相应的二抗孵育 30 分钟。 之后，进行 DAB 显色、苏木精复染，并用中性胶密封。

9. TUNEL 方法检测胰腺切片细胞凋亡

1. 将胰腺石蜡切片在二甲苯中脱蜡 5 分钟，重复两次并用梯度乙醇洗涤（100% 5 分钟，90% 2 分钟，70% 2 分钟，蒸馏水 2 分钟）。
2. 使用 PBS 洗去石蜡切片周围多余的液体。用 100 μL 蛋白酶 K 处理每个样品，确保完全覆盖组织。将样品在 37 °C 下孵育 20 分钟。随后，将样品浸泡在 PBS 中 3 次，每次 5 分钟。
   注:蛋白酶 K 溶液的制备方法是用 PBS 以 1:9（体积）的比例稀释原始蛋白酶 K （200 μg/mL） 溶液，得到 20 μg/mL 的最终浓度（不包括 DNase）。彻底洗涤蛋白酶 K 对于避免干扰后续标记反应至关重要。
3. 在组织上加入适量的 3% H₂O₂ （用 PBS 稀释）使其完全浸润并孵育 20 分钟。用 PBS 冲洗组织 3 次，每次 5 分钟。
   注意:石蜡切片应保持湿润。为了灭活组织中的内源性过氧化物酶，孵育时间不应太长，以防止由于 3% H₂O₂ 引起的 DNA 断裂而导致假阳性。
4. 用 50 μL 平衡缓冲液覆盖待测样品的整个区域并孵育 10 分钟。
5. 去除尽可能多的平衡缓冲液。然后，向每个组织样品中加入 56 μL TdT 孵育缓冲液并孵育 1 小时（在室温下）。
   注意:不应让载玻片干燥，并应避免暴露在光线下。根据制造商的说明制备 TdT 孵育缓冲液（重组 TdT 酶:生物素-dUTP 标记混合物:平衡缓冲液 = 1 μL:5 μL:50 μL）。
6. 立即用 PBS 洗涤组织样品。冲洗 4 次，每次 5 分钟。用滤纸轻轻去除样品周围多余的 PBS 溶液。
7. 向每个组织样品中加入 100 μL 先前稀释的链霉亲和素-HRP 反应溶液（链霉亲和素-HRP:TBST = 1:300）进行链霉亲和素-HRP 反应。孵育 30 分钟。然后，用 PBS 洗涤样品并冲洗 3 次，每次 5 分钟。
8. 通过向每个石蜡切片中加入 50 μL DAB 进行 DAB 染色。在显微镜下实时观察染色。出现阳性染色后，立即将载玻片放入潮湿的盒子中。用纯水洗涤以终止反应。
9. 将载玻片浸入苏木精染色溶液中 3-5 分钟，然后用纯水冲洗。
10. 在苏木精分化溶液中分化约 2 秒，然后立即用纯水冲洗。
11. 使用苏木精 rebluing 溶液几秒钟获得蓝色，然后用纯水冲洗玻片。
    注意:核染色后进行显微镜检查。如果染色太暗，请将载玻片放回鉴别溶液中。如果染色太浅，请从细胞核染色步骤重新开始染色过程。
12. 用 4 轮新鲜无水乙醇脱水样品，每轮 5 分钟。然后，将它们浸泡在丁醇中 5 分钟，在二甲苯中浸泡 5 分钟。最后，再使用新鲜的二甲苯 5 分钟。
13. 使用中性胶安装载玻片。让它们自然风干或在 60 °C 的烤箱中干燥。
14. 使用白光显微镜进行组织学检查。凋亡细胞核呈棕色。
15. 计算相应的凋亡指数 （AI）。
    注意:以双盲方式观察载玻片。在 TUNEL 阳性载玻片中，在高放大倍率 （400x） 下随机选择 5 个阳性区域，并在每个区域中计数至少 100 个腺泡细胞以确定阳性细胞的百分比。AI =（凋亡细胞总数/细胞总数）× 100%。

10. 流式细胞术

1. 获得新鲜的胰腺组织，并在用 PBS 灌注后彻底清洗它们。
2. 准备 0.5% 胶原酶 IV 消化液，并使用无菌组织剪刀充分消化胰腺组织。
3. 根据胰腺碎片的状况和液体浊度，加入 5% BSA 消化终止溶液，并在低温下离心混合物 5 分钟（~300 x g ，4 °C）。
4. 弃去上清液以终止消化。
5. 制备含有苯基甲烷磺酰氟 （PMSF） 和 2.5% 胎牛血清细胞悬液的细胞培养基，以重悬胰腺细胞。
6. 通过 200 目尼龙网过滤胰腺腺泡细胞悬液，以通过细胞过滤获得细胞悬液。
7. 在低温下离心胰腺泡细胞悬液（遵循步骤 10.3 中提到的条件）。
8. 丢弃上清液。
9. 用预冷的 PBS 洗涤细胞。
10. 通过离心重悬，将细胞轻轻重悬于预冷的 1x 结合缓冲液中。
11. 调整细胞浓度后，根据制造商的说明用 Annexin V-FITC/PI 标记胰腺腺泡细胞。
12. 在 1 小时内使用流式细胞术检测胰腺腺泡细胞中的细胞凋亡。

11. Caspase-3 和 HMGB-1 的蛋白质印迹检测

1. 提取胰蛋白。
   1. 提取 50 毫克胰腺组织并将其切成小块。
   2. 加入 1 mL RIPA 裂解缓冲液（含有 PMSF 和磷酸化蛋白酶抑制剂）。
   3. 使用电动研磨机将胰腺组织在冰上匀浆 5 分钟。
   4. 将匀浆组织在冰上轻轻摇动孵育 2 小时。
   5. 将匀浆在 4 °C 下以 4,500 x g 离心 10 分钟。
   6. 收集上清液并储存在 -80 °C。
2. 进行蛋白质定量。
   1. 将一定量的 BSA 标准品样品 （25 mg/mL） 稀释至 0.5 mg/mL 的浓度。
   2. 通过将 50 体积的 BCA 溶液 A 与 1 体积的 BCA 溶液 B 混合，制备一定量的 BCA 工作溶液，确保充分均匀混合。
   3. 将 BSA 标准样品按量程为 0、1、2、4、8、12、16 和 20 μL 放入 96 孔板上的标准样品孔中。用蒸馏水平衡每个孔的体积，得到 20 μL 的总体积。
   4. 将 2 μL 样品加入样品孔中，然后依次加入 18 μL 蒸馏水进行稀释 （1:9）。
   5. 用 200 μL BCA 工作溶液填充每个孔，并使其在 37 °C 下静置约 20-30 分钟。
   6. 测量 562 nm 波长处的吸光度。根据标准曲线计算样品的蛋白质浓度。
   7. 加入特定体积的 RIPA 裂解液和稀释缓冲液，稀释样品直至浓度达到 5-10 μg/μL，认为这是合适的。
   8. 蛋白质变性后（100°C;10分钟），将样品储存在-20°C。
3. 进行 Western 印迹。
   1. 为 SDS-PAGE 做准备。
      1. 安装制胶模具并检查其密封性能。
      2. 将 TEMED 添加到 10% 分离胶粘剂中并混合均匀。
      3. 将混合物注入模具中，约占体积的三分之二，同时避免气泡。
      4. 将异丙醇加入模具中，压制粘合剂约 40 分钟。
      5. 使用相同的程序配置 5% 的浓缩胶粘剂。
      6. 倒出异丙醇并立即加入粘合剂。
      7. 将梳子垂直放置，直到胶水完全聚合。
   2. 执行电泳操作。
      1. 按照预期的实验对照顺序，以相反的顺序将待测样品添加到 SDS-PAGE 粘合剂的采样孔中。
      2. 同时添加 Protein Mark 以确定目标蛋白和内部参比蛋白的位置。
      3. 样品添加完成后，将样品放入电泳槽中。
      4. 最初，在 80 V 下运行 30 分钟，然后在 100 V 下运行凝胶以分离蛋白质 60 分钟。
         注意:应注意溴酚蓝的位置，以避免过度电泳。
   3. 进行蛋白质转移。
      1. 剪下右上角的 PVDF 薄膜作为标记。
      2. 将 PVDF 薄膜置于甲醇溶液中 5-10 秒以活化。
      3. 将 PVDF 膜浸泡在电泳缓冲液中约 15 分钟。
      4. 电泳后小心地去除凝胶并修剪多余的凝胶，确保凝胶在整个过程中保持湿润。
      5. 按以下顺序组装夹板: 负板→海绵 → 三层滤纸→ PVDF 膜→凝胶→三层滤纸→海绵→正板。
         注意:确保凝胶和 PVDF 薄膜之间没有气泡。
      6. 将组装好的夹子放入湿的旋转槽（黑色到黑色）中，并在其周围放置冰块。
      7. 打开电源并以 400 mA 开始胶片传输 100 分钟。
   4. 进行 PVDF 薄膜密封，以及一抗和二抗的孵育。
      1. 转移后轻轻去除 PVDF 薄膜，用 TBST 冲洗 10 分钟，重复该过程 3-5 次。
      2. 将 PVDF 薄膜密封在 5% 脱脂牛奶中 2 小时。
      3. 去除 PVDF 薄膜，用 TBST 冲洗 10 分钟，重复该过程 4 次。
      4. 将 PVDF 薄膜和稀释的一抗一起放入 4 °C 的冰箱中，轻轻摇动并孵育过夜。
      5. 第二天去除 PVDF 薄膜，用 TBST 冲洗 10 分钟，重复该过程 4 次。
      6. 将 PVDF 膜在 HRP 标记的二抗稀释剂中孵育约 2 小时。
      7. 用 TBST 冲洗 PVDF 薄膜 10 分钟，重复该过程 4 次。
   5. 曝光胶片并进行分析。
      1. 将准备好的 ECL 溶液均匀地涂在薄膜上。
      2. 将胶片在暗室中用曝光计曝光约 2-3 分钟，然后存放。
      3. 使用 Image J 软件进行分析。

结果

实验小鼠建模的过程如图 1 所示。注射完成 12 小时后，使用旷场录像机监测不同实验组小鼠的运动距离和不动持续时间 5 个周期（图 2A）。在 5 个周期中，PI V 组小鼠在 3 分钟内保持低水平的运动距离，而 3 分钟内的不动率随着随后的每个周期而增加（图 2B、C）。此外，对不同实验组小鼠在 5 个周期内?...

讨论

目前，缺乏有效的方法来改善严重急性胰腺炎患者的高死亡率。研究药物在增强免疫稳定机制方面的疗效至关重要。迫切需要一种理想的严重急性胰腺炎动物模型。具有 C57BL/6J 遗传背景的小鼠广泛用于生物医学研究，包括 SAP 病理生理学研究。B6J 小鼠 70 多年的遗传分化导致几个外显子自发缺失¹⁵，导致对 Caerulein 诱导的胰腺损伤的敏感性降低¹⁶。此外，现有的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
20× Citric Acid Antigen Repair Solution (pH 6.0)	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G1202-250 ml
Amylase	Mindray,China
Annexin V-FITC/PI	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G1511	diluted at 1:20
Anti-HMGB1 Rabbit pAB	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	GB11103	diluted at 1:1800
BCA protein quantitative detection kit	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G2026-200T
BD FACSCanto II Flow Cytometer	BD Life Sciences, San Jose, CA, 95131, USA	BD FACSCanto II
BSA	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	GC305010-100g
C57BL/6J	Cavion Experimental Animal Co., Changzhou, China		license number SCXY (Su) 2011–0003
Ceruletide	MCE, New Jersey, USA	17650-98-5	50 µg/kg
Chemiluminescence imager	Cytiva CO.,LTD.;USA
Citric acid antigen repair Solution (Dry powder pH 6.0)	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G1201-5 L
Collagenase IV	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	GC305014	0.5 mg/mL
DAB (SA-HRP) Tunel Cell Apoptosis Detection Kit	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G1507-100 T
Dimension EXL with LM Integrated Chemistry System	Siemens Healthcare Diagnostics Inc.Brookfield,USA	YZB/USA 8311-2014
ECL developer	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China
Eosin dye (alcohol soluble)	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G1001-100 ml
EthoVision XT	Noldus, Netherlands
FITC-labeled goat anti-rabbit IgG	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	GB22303	diluted at 1:50
Fully automatic blood cell analyzer	Zybio Inc. China	Zybio-Z3 CRP
GapDH	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	GB11103	diluted at 1:1500
Hematoxylin blue return solution	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G1040-500 ml
Hematoxylin differentiation solution	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G1039-500 ml
Hematoxylin dye	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G1004-100 ml
HMGB-1 ELISA kits	njjcbio Co., Ltd, China
HOMOGENIZER	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	KZ-III-F;IC111150 100222
HRP-labeled goat anti-rabbit IgG	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	GB23303	diluted at 1:1500
IL-6 ELISA kits	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	GEM0001
Lipase	Mindray,China
Lipopolysaccharide	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	GC205009	15 mg/kg
Low temperature high speed centrifuge	Changsha Pingfan Apparatus&Instrument Co.,Ltd.,China	TGL-20M
Membrane breaking liquid	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G1204
microtome	Jinhua Craftek Instrument Co., Ltd.;China	CR-601ST
Nylon mesh	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China		200-mesh
One-step TUNEL cell apoptosis detection kit (DAB staining method)	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G1507-100T
Paraffin tissue embedding machine	PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO.,LTD;Changzhou,China	PBM-A
Pathological tissue drying apparatus	PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO.,LTD;Changzhou,China	PHY-III
Phosphate-buffered saline	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G4202-100ML
PMSF	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G2008-1 ml
Positive fluorescence microscope	Olympus Corporation,Tokyo, Japan	BX53
Pro Calcitonin	Mindray,China
PVDF membrane	Millipore, USA		0.22 µm
RIPA	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G2002-100 ml
SDS-PAGE	Beyotime Biotechnology,China	P0012A
TNF-αELISA kits	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	GEM0004
Ultrasonic water bath	DONGGUAN KQAO ULTRASONIC EQUIPMENT CO.,LTD.;China	KQ-200KDE
Western Blot	Bio-Rad Laboratories, Inc.,USA
Western blot imaging System	Global Life Sciences IP Holdco LLC, JAPAN	Amersham ImageQuant 800
Whirlpool mixer	SCILOGEX;USA