Préparation d’un modèle murin de pancréatite aiguë sévère par une combinaison de céruleine et d’injection intrapéritonéale de lipopolysaccharide

Résumé

L’administration intrapéritonéale de médicaments est une approche non invasive sûre et efficace pour induire des lésions pancréatiques. Cette étude a comparé cinq protocoles d’injection intrapéritonéale distincts sur des souris pour induire divers degrés de lésions pancréatiques et a établi un modèle de lésions pancréatiques sévères pour étudier les changements pathologiques et les stratégies de traitement de la pancréatite aiguë sévère (PAS).

Résumé

Le traitement de la pancréatite aiguë sévère (PAS), avec des taux de mortalité élevés, pose un défi clinique important. L’étude des changements pathologiques associés au SAP à l’aide de modèles animaux peut aider à identifier des cibles thérapeutiques potentielles et à explorer de nouvelles approches de traitement. Des études antérieures ont principalement induit des lésions pancréatiques par injection rétrograde de taviaurocholate de sodium dans les voies biliaires, mais l’impact des lésions chirurgicales sur la qualité du modèle animal reste incertain. Dans cette étude, nous avons utilisé différentes fréquences d’injections intrapéritonéales de Cærulein combinées à différentes doses de LPS pour induire des lésions pancréatiques chez les souris C57BL/6J et avons comparé l’étendue des lésions dans cinq protocoles d’injection intrapéritonéale. En ce qui concerne l’induction d’une pancréatite aiguë chez la souris, un protocole d’injection intrapéritonéale est proposé qui entraîne un taux de mortalité pouvant atteindre 80% en 5 jours. Plus précisément, les souris ont reçu dix injections intrapéritonéales quotidiennes de céruleine (50 μg/kg), suivies d’une injection de LPS (15 mg/kg) une heure après la dernière administration de céruleine. En ajustant la fréquence et la posologie des médicaments injectés, on peut manipuler efficacement la gravité des lésions pancréatiques. Ce modèle présente une forte contrôlabilité et a un cycle de réplication court, ce qui permet à un seul chercheur de le réaliser sans nécessiter d’équipement coûteux. Il simule de manière pratique et précise les principales caractéristiques de la maladie observées dans le SAP humain tout en démontrant un haut degré de reproductibilité.

Introduction

La pancréatite aiguë sévère se caractérise par une apparition rapide, une progression rapide et des taux de mortalité élevés dans le domaine¹ des maladies du système digestif. Son taux de mortalité élevé a toujours été un objectif majeur de la recherche clinique. En raison de l’évolution imprévisible des conditions cliniques, de l’hétérogénéité des manifestations de la maladie et de la disponibilité limitée d’échantillons humains, l’établissement de modèles animaux est devenu de plus en plus crucial pour la recherche sur les maladies.

L’injection rétrograde de taurocholate de sodium dans le canal cholédoque est couramment utilisée pour créer un modèle de rat de SAP². En simulant l’obstruction pancréaticobiliaire et en induisant un reflux de la bile et du liquide pancréatique, cette technique de modélisation présente un taux de réussite élevé dans la réplication de modèles animaux SAP. Cependant, il convient de noter que la chirurgie invasive a un impact sur le modèle animal lui-même. De plus, cette méthode est limitée aux animaux plus grands, tels que les rats et les chiens, qui sont principalement utilisés comme sujets d’expérience. D’autres techniques, notamment l’intubation duodénale³, la ponction duodénale directe⁴ et la ponction directe du canal biliaire-canal pancréatique⁵, sont fréquemment utilisées à des fins de modélisation.

Les méthodes d’injection intrapéritonéale et de modélisation diététique offrent des avantages non invasifs qui peuvent être appliqués à des animaux de toutes tailles. Le modèle murin de SAP induit par l’alimentation de l’éthionine déficiente en choline (CDE)⁶ présente certaines complications, telles qu’une hyperglycémie et une hypocalcémie peu contrôlables, ce qui le rend impropre à l’évaluation de nouvelles approches diagnostiques et thérapeutiques. D’autre part, l’injection intrapéritonéale de Caerulein associée à la L-arginine⁷ représente la méthode la plus couramment utilisée pour induire une pancréatite aiguë chez la souris. Plus précisément, l’administration intrapéritonéale répétée de Caerulein, un analogue de la cholécystokinine, constitue une approche très appropriée pour étudier divers aspects liés à cette maladie destructrice, notamment la pathogenèse, l’inflammation et les processus de régénération. En raison de sa similitude structurelle avec la cholécystokinine (CCK), la céruleine stimule efficacement la contraction de la vésicule biliaire et la sécrétion d’enzymes pancréatiques, entraînant un déséquilibre de la sécrétion d’enzymes suivi d’une autodestruction ultérieure⁸. Le lipopolysaccharide (LPS), omniprésent et largement étudié en tant que molécule moléculaire associée à un agent pathogène, peut être combiné à la céruleine par injection intrapéritonéale pour établir un modèle de souris efficace de SAP. Cette combinaison déclenche et libère rapidement un nombre important de cytokines inflammatoires, entraînant une inflammation locale et systémique excessive. Plusieurs études ont rapporté l’induction de modèles SAP chez la souris par injection intrapéritonéale de Caerulein combinée à du LPS. Cela peut être attribué au fait que l’injection intrapéritonéale de Caerulein peut provoquer un œdème pancréatique et une hémorragie chez la souris, tandis que l’ajout de LPS peut induire immédiatement une nécrose pancréatique et exacerber la réponse inflammatoire systémique, la septicémie et même la défaillance d’organe. À l’heure actuelle, il existe des variations dans la posologie et la fréquence des injections intrapéritonéales de céruleine, ainsi qu’une incohérence dans la posologie supplémentaire de LPS. Assurer la cohérence des modèles SAP de souris est un défi 9,10,11,12 ; Par conséquent, il est nécessaire d’établir un protocole standardisé pour obtenir un modèle idéal. Dans cet article, nous décrivons un protocole d’injection intrapéritonéale chez la souris et étudions la fréquence d’injection optimale et la dose supplémentaire de LPS.

Protocole

Ce protocole a été examiné et approuvé par le comité d’éthique du premier hôpital affilié de l’Université des sciences et technologies d’Anhui (Huainan, Chine) (Code d’éthique : 2023-KY-905-001). L’étude a suivi les directives des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des rongeurs de recherche dans toutes les procédures animales. Des souris adultes C57BL/6J pesant de 20 à 30 g ont été utilisées pour la présente étude. Les souris ont été hébergées dans un laboratoire animalier pendant une semaine dans des conditions contrôlées (environ 21 °C avec un cycle alterné jour-nuit de 12 heures). Les souris avaient un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau partout. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation des animaux

1. Attribuez 84 souris C57BL/6J en bonne santé à six groupes, y compris le groupe témoin, Lésion pancréatique (PI) I, PI II, PI III, PI IV et PI V.
2. Avant de lancer la procédure de modélisation, étiquetez chaque groupe de souris avec des encoches d’oreille et laissez-les jeûner pendant 12 h.

2. Préparation du diluant médicamenteux induit

1. Dissoudre la céruleine (1 mg) dans 1 mL de PBS et réfrigérer à -20 °C.
2. Mesurer et consigner le poids des souris expérimentales 1 h avant l’injection intrapéritonéale du médicament.
3. Extraire la masse totale de céruleine requise dans un rapport de 50 μg/kg, sur la base du poids total de toutes les souris.
4. Diluez à nouveau le médicament Caerulein obtenu avec du PBS.
   REMARQUE : Le volume total de dilution PBS doit être équivalent à 5 fois la valeur pondérale totale de toutes les souris. La même méthode de dilution a été utilisée pour obtenir le diluant LPS.

3. Injection intrapéritonéale

REMARQUE : Des injections intrapéritonéales ont été administrées à chaque groupe de souris selon le protocole décrit dans le tableau supplémentaire 1 pour induire le modèle. 10 autres souris ont été regroupées et traitées pour observer les taux de survie à 7 jours.

1. Saisissez et tenez les souris de manière à ce que le ventre des souris soit orienté vers le haut et que la tête soit positionnée plus bas que la queue pour éviter d’endommager les organes lors de l’insertion de la seringue.
2. Désinfectez l’abdomen des souris à l’aide de boules de coton à 75 % d’alcool.
3. Tenez la seringue dans la main droite (à l’aide d’une aiguille mesurant ≤0,5/≥0,3) et insérez l’aiguille dans la peau sous-cutanée du côté gauche de la ligne blanche abdominale.
   REMARQUE :Passez du côté droit pour la prochaine injection.
4. Une fois que l’aiguille a atteint la couche sous-cutanée, avancez-la d’environ 3 à 5 mm, puis insérez l’aiguille de la seringue dans la cavité abdominale à un angle de 45°. À ce stade, on devrait ressentir une certaine résistance.
5. Gardez l’aiguille immobile et injectez la substance lentement.
   REMARQUE : Ne dépassez pas 5 fois la valeur du poids des souris par rapport au volume d’une seule injection intrapéritonéale.
6. Après l’injection, retirez l’aiguille et massez doucement et appuyez sur le site d’injection avec un coton-tige stérile pour diffuser complètement le médicament dans la cavité abdominale des souris.
7. Utilisez une nouvelle seringue pour répéter avec les prochaines souris expérimentales.

4. Test d’aptitude comportementale en plein champ

REMARQUE : 12 h après la dernière injection intrapéritonéale, des tests d’aptitude comportementale en champ libre ont été effectués pour évaluer la distance d’activité totale et le temps d’immobilité des souris.

1. Placez quatre cases blanches identiques directement sous l’appareil photo.
2. Connectez l’appareil photo à l’ordinateur à l’aide d’un câble vidéo.
3. Assurez-vous que la boîte expérimentale est propre et exempte de toute odeur avant de commencer l’expérience.
4. Placez l’animal au milieu de la grille, face à l’expérimentateur, et laissez-le s’adapter à l’environnement pendant 10 min.
5. Démarrez le logiciel de suivi vidéo et cliquez sur le menu Fichier pour créer une nouvelle expérience.
6. Configurez la surveillance pour quatre champs de vision simultanés.
7. Marquez la longueur et la largeur de l’objet expérimental qui peut se déplacer à l’intérieur de la boîte sur l’écran de surveillance en temps réel (30 cm × 30 cm).
8. Une fois la configuration terminée, commencez la surveillance vidéo et l’enregistrement.
9. Enregistrez l’activité des souris pendant 15 min.
10. Après le test, retirez l’animal de la grille et remettez-le dans sa cage. Nettoyez soigneusement la grille à l’aide d’un stérilisant contenant du dioxyde de chlore.

5. Prélèvement et analyse du sang périphérique de souris

1. Euthanasier les souris (selon le protocole approuvé par l’établissement).
   1. Effectuer l’euthanasie sur les souris expérimentales 36 h après l’injection intrapéritonéale. Mesurer et consigner le poids corporel des souris avant l’euthanasie.
      REMARQUE : Administrer 0,18 mL d’hydrate de chloral à 10 % par voie intrapéritonéale, en s’assurant qu’il n’y a pas de réaction à la stimulation de l’orteil ou de la queue.
   2. Avec la main gauche, fixez les souris, et avec la main droite, tenez les ciseaux pour couper les moustaches d’un côté des souris.
   3. Appuyez doucement sur la peau autour de l’œil pour induire la congestion et la protrusion du globe oculaire.
   4. À l’aide d’une pince incurvée, saisissez le globe oculaire et retirez-le rapidement, en recueillant le sang périphérique dans un tube de microcentrifugation.
      REMARQUE : Deux types différents de tubes de microcentrifugation ont été utilisés, l’un contenant de l’anticoagulant et l’autre sans.
   5. Simultanément, appuyez légèrement sur la zone du cœur de la souris avec le majeur de la main gauche pour augmenter la vitesse de pompage du cœur.
2. Laissez le sang périphérique sans anticoagulant à température ambiante pendant 30 min.
3. Mesurez les concentrations sériques d’amylase (Amy) et de lipase (Lip) à l’aide d’un analyseur biochimique automatisé selon la méthode du taux enzymatique et la méthode de circulation enzymatique (en suivant les instructions du fabricant).
4. Déterminez les niveaux d’indicateurs inflammatoires tels que la pro-calcitonine (PCT) dans le plasma à l’aide de la méthode de chimiluminescence à l’aide d’un imageur de chimiluminescence commercial (en suivant les instructions du fabricant).
5. Utilisez des kits ELISA pour mesurer les niveaux de HMGB-1, IL-6 et TNF-α dans le sérum de souris (en suivant les instructions du fabricant).
6. Analysez le sang périphérique traité avec un anticoagulant à l’aide d’un analyseur de cellules sanguines entièrement automatique pour évaluer les paramètres pertinents.

6. Prélèvement du tissu pancréatique et préparation d’une section de paraffine

1. Placez les souris en position couchée et fixez-les sur une plaque de mousse.
2. Rasez et désinfectez la zone, puis faites une incision abdominale médiane et retournez le tube de l’intestin grêle vers la droite pour exposer complètement le pancréas.
3. Déconnectez le duodénum et le canal pylorique et localisez l’intestin grêle sous le pancréas. Libérez complètement le tissu pancréatique le long du canal intestinal.
4. Utilisez une pince édentée pour serrer la rate et tirez doucement vers le haut.
   REMARQUE : Ne touchez pas directement le tissu pancréatique et évitez d’utiliser une force excessive pendant tout le processus de dissociation.
5. Disséquez brusquement le tissu ligamentaire pancréatique postérieur jusqu’à la tête du pancréas et déconnectez les canaux biliaires et les vaisseaux sanguins.
6. Retirez le tissu pancréatique, séchez l’humidité de surface avec du papier absorbant, pesez et enregistrez.
7. Fixez la moitié du tissu pancréatique avec 4% de paraformaldéhyde et conservez l’autre moitié au réfrigérateur à -80 °C.
8. Préparez les sections de paraffine pancréatique en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Nettoyez le tissu pancréatique fixé avec de l’alcool à 75 % et coupez-le à une taille d’environ 0,5 cm × 0,5 cm.
   2. Immergez le tissu dans de l’éthanol à 70 % pendant 20 min, de l’éthanol à 80 % pendant 20 minutes et de l’éthanol à 90 % pendant 15 min.
   3. Traitez le tissu deux fois avec de l’éthanol à 95 % pendant 15 minutes à chaque fois, puis deux fois avec de l’éthanol à 100 % pendant 5 minutes à chaque fois.
   4. Soumettez le tissu à deux séries de traitements de 12 minutes et 5 minutes avec une solution de xylène pour plus de transparence.
   5. Faites tremper le tissu transparent dans une cuve de cire à 65 °C pendant 1 h.
   6. Incorporez le tissu dans de la paraffine fondue et laissez-le refroidir. Obtenez des coupes de paraffine pancréatique à l’aide d’une trancheuse (épaisseur : 5 μm).
   7. Aplatissez les tranches de paraffine obtenues dans de l’eau à 45 °C, montez-les et séchez-les (conditions de cuisson : 40 °C pendant 14-16 h).

7. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E)

1. Placez les sections de paraffine pancréatique dans du xylène I et II pendant 30 min, puis dans de l’alcool anhydre, à 95 %, 85 % et à 75 % pendant 5 min chacun, et de l’eau ultrapure pendant 5 min.
2. Teindre le noyau cellulaire avec de l’hématoxyline pendant 160 s, puis rincer lentement à l’eau courante.
3. Appliquez une solution de différenciation d’alcool à l’acide chlorhydrique pendant 5 à 10 s, puis rincez rapidement à l’eau courante.
4. Traitez les sections avec de l’alcool anhydre pendant 5 min.
5. Incuber le cytoplasme avec de l’éosine pendant 30 s, puis rincer à l’eau courante.
6. Immergez les sections dans de l’éthanol à 75 %, 85 %, 95 % et 100 % pendant 10 s chacune, puis traitez avec du xylène pendant 5 minutes pour les déshydrater.
7. Enfin, scellez les sections avec de la résine neutre et observez au microscope.
8. Effectuer la notation pathologique et les normes¹³.
   REMARQUE : Déterminez la gravité de la pancréatite en fonction d’indicateurs tels que l’œdème, la nécrose acineuse, les saignements, l’hémorragie et la nécrose graisseuse, ainsi que l’inflammation inflammatoire et périvasculaire. Utilisez les directives de mise en œuvre publiées précédemment pour obtenir une note^{de 13}.

8. Coloration immunohistochimique

1. Déparaffiné les sections de tissu pancréatique incluses dans de la paraffine dans du xylène, puis réhydratez-les dans un gradient de solutions d’éthanol.
2. Effectuer un blocage enzymatique endogène à l’aide de 3%_{de H2}O₂ pendant 20 min après une rupture membranaire de 30 min.
3. Bloquez l’anticorps avec 5 % de sérum bovin à température ambiante pendant 30 min, puis incubez pendant une nuit à 4 °C avec une dilution de 1:1500 d’anti-HMGB1 de lapin.
4. Rincez les sections avec du PBS, puis incubez-les dans les anticorps secondaires correspondants pendant 30 min à 37 °C. Après cela, effectuez le développement de la couleur DAB, la contre-coloration à l’hématoxyline et scellez avec de la gomme neutre.

9. Méthode TUNEL pour la détection de l’apoptose dans les coupes pancréatiques

1. Décaffinez les sections de paraffine pancréatique dans du xylène pendant 5 min, répétez deux fois et lavez avec de l’éthanol dégradé (100 % pendant 5 min, 90 % pendant 2 min, 70 % pendant 2 min et de l’eau distillée pendant 2 min).
2. Lavez l’excès de liquide entourant les sections de paraffine à l’aide de PBS. Traitez chaque échantillon avec 100 μL de protéinase K, en assurant une couverture complète du tissu. Incuber les échantillons à 37 °C pendant 20 min. Par la suite, faites tremper les échantillons dans du PBS 3 fois, à chaque fois pendant 5 min.
   REMARQUE : La solution de protéinase K a été préparée en diluant la solution originale de protéinase K (200 μg/mL) avec du PBS dans un rapport de 1:9 (volume), ce qui a donné une concentration finale de 20 μg/mL, à l’exclusion de la DNase. Un lavage minutieux de la protéinase K est essentiel pour éviter d’interférer avec les réactions d’étiquetage ultérieures.
3. Ajouter une quantité appropriée de 3% de_H2O₂ (diluée par PBS) sur le tissu pour l’infiltrer complètement et incuber pendant 20 min. Rincez le mouchoir avec du PBS 3 fois pendant 5 minutes chacune.
   REMARQUE : Les sections de paraffine doivent être maintenues humides. Pour inactiver les peroxydases endogènes dans le tissu, le temps d’incubation ne doit pas être trop long afin d’éviter les faux positifs dus à la rupture de l’ADN causée par 3%_H2O₂.
4. Couvrez toute la surface de l’échantillon à tester avec 50 μL de tampon d’équilibrage et incubez pendant 10 min.
5. Retirez autant de tampon d’équilibrage que possible. Ensuite, ajoutez 56 μL de tampon d’incubation TdT à chaque échantillon de tissu et incubez pendant 1 h (à température ambiante).
   REMARQUE : La diapositive ne doit pas sécher et l’exposition à la lumière doit être évitée. Le tampon d’incubation TdT a été préparé conformément aux instructions du fabricant (Enzyme TdT recombinante : Mélange d’étiquetage Biotine-dUTP : Tampon d’équilibrage = 1 μL : 5 μL : 50 μL).
6. Lavez immédiatement les échantillons de tissus avec du PBS. Rincez-les 4 fois pendant 5 min chacune. Retirez délicatement tout excès de solution PBS autour des échantillons avec du papier filtre.
7. Ajouter 100 μL de solution réactionnelle Streptavidine-HRP préalablement diluée (Streptavidine-HRP : TBST = 1:300) à chaque échantillon de tissu pour la réaction Streptavidine-HRP. Incuber pendant 30 min. Ensuite, lavez les échantillons avec du PBS et rincez-les 3 fois pendant 5 minutes chacune.
8. Effectuez la coloration DAB en ajoutant 50 μL de DAB à chaque section de paraffine. Observez la coloration au microscope en temps réel. Une fois qu’une coloration positive apparaît, placez immédiatement les lames dans une boîte humide. Arrêtez la réaction en le lavant à l’eau pure.
9. Immergez les lames dans une solution de coloration à l’hématoxyline pendant 3 à 5 minutes, puis rincez à l’eau pure.
10. Différencier dans une solution de différenciation d’hématoxyline pendant environ 2 s, suivi d’un rinçage immédiat à l’eau pure.
11. Obtenez une coloration bleue à l’aide d’une solution de rebluing à l’hématoxyline pendant quelques secondes et rincez les lames à l’eau pure.
    REMARQUE : Effectuer un examen microscopique après la coloration nucléaire. Si la coloration est trop foncée, remettez les lames dans la solution de différenciation. Si la coloration est trop légère, redémarrez le processus de coloration à partir de l’étape de coloration nucléaire.
12. Déshydratez les échantillons avec 4 doses d’éthanol anhydre frais pendant 5 minutes chacune. Ensuite, faites-les tremper dans du butanol pendant 5 min et dans du xylène pendant 5 min. Enfin, utilisez du xylène frais pendant encore 5 min.
13. Montez les lames à l’aide de gomme neutre. Laissez-les sécher à l’air libre ou dans un four à 60 °C.
14. Effectuer un examen histologique à l’aide d’un microscope à lumière blanche. Les noyaux apoptotiques apparaîtront bruns.
15. Calculez l’indice apoptotique (AI) correspondant.
    REMARQUE : Observez les diapositives en double aveugle. Dans les lames positives à TUNEL, sélectionnez au hasard 5 zones positives sous un fort grossissement (400x) et comptez au moins 100 cellules acineuses dans chaque zone pour déterminer le pourcentage de cellules positives. IA = (nombre total de cellules apoptotiques/nombre total de cellules) × 100%.

10. Cytométrie en flux

1. Procurez-vous des tissus pancréatiques frais et lavez-les soigneusement après avoir perfusé avec du PBS.
2. Préparez une solution de digestion IV de collagénase à 0,5 % et utilisez des ciseaux à tissus stériles pour digérer correctement les tissus pancréatiques.
3. Ajouter une solution de terminaison de digestion BSA à 5 % en fonction de l’état des fragments pancréatiques et de la turbidité du liquide, et centrifuger le mélange à basse température pendant 5 min (~300 x g, 4 °C).
4. Jetez le surnageant pour terminer la digestion.
5. Préparez un milieu de culture cellulaire contenant du fluorure de phénylméthane sulfonyle (PMSF) et une suspension de cellules sériques fœtales bovines à 2,5 % pour remettre en suspension les cellules pancréatiques.
6. Filtrez les suspensions de cellules acineuses pancréatiques à travers un maillage en nylon de 200 mailles pour obtenir des suspensions cellulaires par filtrage cellulaire.
7. Centrifugez la suspension de cellules acineuses pancréatiques à basse température (suivez les conditions mentionnées à l’étape 10.3).
8. Jetez le surnageant.
9. Lavez les cellules avec du PBS pré-réfrigéré.
10. Remettez doucement les cellules en suspension dans un tampon de liaison 1x pré-refroidi par resuspension centrifuge.
11. Étiquetez les cellules acineuses pancréatiques avec l’Annexine V-FITC/PI selon les instructions du fabricant après avoir ajusté la concentration cellulaire.
12. Utilisez la cytométrie en flux dans les 1 h pour détecter l’apoptose dans les cellules acineuses pancréatiques.

11. Détection par transfert Western de la caspase-3 et de la HMGB-1

1. Extrayez la protéine pancréatique.
   1. Extrayez 50 mg de tissu pancréatique et coupez-le en petits fragments.
   2. Ajouter 1 mL de tampon de lyse RIPA (contenant du PMSF et un inhibiteur de protéase phosphorylé).
   3. Homogénéiser le tissu pancréatique sur de la glace pendant 5 min à l’aide d’un broyeur électrique.
   4. Incuber le tissu homogénéisé sur de la glace en secouant doucement pendant 2 h.
   5. Centrifuger l’homogénat à 4 °C pendant 10 min à 4 500 x g.
   6. Prélever la solution surnageante et la conserver à -80 °C.
2. Effectuer la quantification des protéines.
   1. Diluer un certain volume d’échantillon étalon BSA (25 mg/mL) à une concentration de 0,5 mg/mL.
   2. Préparez une quantité spécifique de solution de travail BCA en mélangeant 50 volumes de solution BCA A avec 1 volume de solution BCA B, en assurant un mélange complet et uniforme.
   3. Placez l’échantillon étalon BSA dans les trous d’échantillonnage standard d’une plaque à 96 puits dans l’ordre de 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16 et 20 μL. Équilibrez le volume de chaque trou avec de l’eau distillée, ce qui donne un volume total de 20 μL.
   4. Ajouter 2 μL d’échantillons dans les trous d’échantillonnage, puis ajouter séquentiellement 18 μL d’eau distillée pour la dilution (1:9).
   5. Remplissez chaque puits avec 200 μL de solution de travail BCA et laissez-le reposer à 37 °C pendant environ 20 à 30 min.
   6. Mesurez l’absorbance à une longueur d’onde de 562 nm. Calculer la concentration en protéines des échantillons sur la base de la courbe standard.
   7. Ajouter un volume spécifique de solution de craquage RIPA et de tampon de dilution pour diluer les échantillons jusqu’à ce que la concentration atteigne 5-10 μg/μL, ce qui est considéré comme approprié.
   8. Stocker les échantillons à -20 °C après la dénaturation des protéines (100 °C ; 10 min).
3. Effectuez le Western blot.
   1. Préparez-vous pour SDS-PAGE.
      1. Installez les moules de fabrication de colle et inspectez leurs performances d’étanchéité.
      2. Ajoutez TEMED à l’adhésif de séparation à 10 % et mélangez uniformément.
      3. Injecter le mélange dans le moule, représentant environ les deux tiers du volume, tout en évitant les bulles.
      4. Ajoutez l’isopropanol dans le moule et appuyez sur l’adhésif pendant environ 40 min.
      5. Utilisez le même programme pour configurer l’adhésif concentré à 5 %.
      6. Versez l’isopropanol et ajoutez l’adhésif immédiatement.
      7. Placez le peigne verticalement jusqu’à ce que la colle polymérise complètement.
   2. Effectuez l’opération d’électrophorèse.
      1. Ajoutez l’échantillon à tester dans l’ordre de contrôle expérimental attendu, dans l’ordre inverse, dans les trous d’échantillonnage de l’adhésif SDS-PAGE.
      2. Ajoutez simultanément le repère protéique pour déterminer l’emplacement de la protéine cible et de la protéine de référence interne.
      3. Placez l’échantillon dans le réservoir d’électrophorèse une fois l’ajout d’échantillon terminé.
      4. Au départ, exécutez à 80 V pendant 30 min, puis faites fonctionner le gel pour séparer la protéine à 100 V pendant 60 min.
         REMARQUE : Une attention particulière doit être portée à la position du bleu de bromophénol pour éviter une électrophorèse excessive.
   3. Effectuez le transfert de protéines.
      1. Coupez le film PVDF dans le coin supérieur droit pour servir de marque.
      2. Placez le film PVDF dans une solution de méthanol pendant 5 à 10 s pour l’activer.
      3. Faites tremper le film PVDF dans un tampon d’électrophorèse pendant environ 15 min.
      4. Retirez soigneusement le gel après l’électrophorèse et coupez l’excès de gel, en vous assurant que le gel reste humide tout au long du processus.
      5. Assemblez l’attelle dans l’ordre suivant : plaque négative → éponge → trois couches de papier filtre → de gel → film PVDF → trois couches de papier filtre → éponge → plaque positive.
         REMARQUE : Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles entre le gel et le film PVDF.
      6. Placez la pince assemblée dans la rainure rotative humide (noire à noire) avec des glaçons positionnés autour d’elle.
      7. Mettez l’appareil sous tension et lancez le transfert de film à 400 mA pendant 100 min.
   4. Effectuer l’étanchéité du film PVDF et l’incubation des anticorps primaires et secondaires.
      1. Retirez délicatement le film PVDF après le transfert et rincez au TBST pendant 10 min, en répétant le processus 3 à 5 fois.
      2. Sceller le film PVDF dans du lait écrémé à 5 % pendant 2 h.
      3. Retirez le film PVDF et rincez au TBST pendant 10 min, en répétant le processus 4 fois.
      4. Placez le film PVDF et l’anticorps primaire dilué ensemble dans un réfrigérateur à 4 °C en agitant doucement et incubez pendant la nuit.
      5. Retirez le film PVDF le lendemain et rincez au TBST pendant 10 min, en répétant le processus 4 fois.
      6. Incuber le film PVDF dans un diluant d’anticorps secondaire marqué HRP pendant environ 2 h.
      7. Rincez le film PVDF avec du TBST pendant 10 min, en répétant le processus 4 fois.
   5. Exposez le film et analysez-le.
      1. Appliquez uniformément la solution ECL préparée sur le film.
      2. Exposez le film dans une pièce sombre avec un posemètre pendant environ 2-3 minutes, puis stockez-le.
      3. Effectuez l’analyse à l’aide du logiciel image J.

Résultats

Le processus de modélisation expérimentale de la souris est illustré à la figure 1. Après 12 h de fin d’injection, un enregistreur vidéo en champ ouvert a été utilisé pour surveiller la distance de mouvement et la durée d’immobilité de différents groupes expérimentaux de souris pendant 5 cycles (Figure 2A). Au cours des 5 cycles, les souris du groupe PI V ont maintenu un faible niveau de distance de mouvement en 3 minutes, tandi...

Discussion

À l’heure actuelle, il n’existe pas de moyens efficaces d’améliorer le taux de mortalité élevé chez les patients atteints de pancréatite aiguë sévère. Il est crucial d’étudier l’efficacité des médicaments dans l’amélioration des mécanismes de stabilité immunitaire. Il existe un besoin urgent d’un modèle animal idéal pour la pancréatite aiguë sévère. Les souris avec un patrimoine génétique C57BL/6J sont largement utilisées dans la recherche biomédicale, y compris les études sur la p...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
20× Citric Acid Antigen Repair Solution (pH 6.0)	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G1202-250 ml
Amylase	Mindray,China
Annexin V-FITC/PI	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G1511	diluted at 1:20
Anti-HMGB1 Rabbit pAB	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	GB11103	diluted at 1:1800
BCA protein quantitative detection kit	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G2026-200T
BD FACSCanto II Flow Cytometer	BD Life Sciences, San Jose, CA, 95131, USA	BD FACSCanto II
BSA	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	GC305010-100g
C57BL/6J	Cavion Experimental Animal Co., Changzhou, China		license number SCXY (Su) 2011–0003
Ceruletide	MCE, New Jersey, USA	17650-98-5	50 µg/kg
Chemiluminescence imager	Cytiva CO.,LTD.;USA
Citric acid antigen repair Solution (Dry powder pH 6.0)	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G1201-5 L
Collagenase IV	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	GC305014	0.5 mg/mL
DAB (SA-HRP) Tunel Cell Apoptosis Detection Kit	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G1507-100 T
Dimension EXL with LM Integrated Chemistry System	Siemens Healthcare Diagnostics Inc.Brookfield,USA	YZB/USA 8311-2014
ECL developer	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China
Eosin dye (alcohol soluble)	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G1001-100 ml
EthoVision XT	Noldus, Netherlands
FITC-labeled goat anti-rabbit IgG	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	GB22303	diluted at 1:50
Fully automatic blood cell analyzer	Zybio Inc. China	Zybio-Z3 CRP
GapDH	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	GB11103	diluted at 1:1500
Hematoxylin blue return solution	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G1040-500 ml
Hematoxylin differentiation solution	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G1039-500 ml
Hematoxylin dye	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G1004-100 ml
HMGB-1 ELISA kits	njjcbio Co., Ltd, China
HOMOGENIZER	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	KZ-III-F;IC111150 100222
HRP-labeled goat anti-rabbit IgG	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	GB23303	diluted at 1:1500
IL-6 ELISA kits	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	GEM0001
Lipase	Mindray,China
Lipopolysaccharide	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	GC205009	15 mg/kg
Low temperature high speed centrifuge	Changsha Pingfan Apparatus&Instrument Co.,Ltd.,China	TGL-20M
Membrane breaking liquid	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G1204
microtome	Jinhua Craftek Instrument Co., Ltd.;China	CR-601ST
Nylon mesh	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China		200-mesh
One-step TUNEL cell apoptosis detection kit (DAB staining method)	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G1507-100T
Paraffin tissue embedding machine	PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO.,LTD;Changzhou,China	PBM-A
Pathological tissue drying apparatus	PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO.,LTD;Changzhou,China	PHY-III
Phosphate-buffered saline	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G4202-100ML
PMSF	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G2008-1 ml
Positive fluorescence microscope	Olympus Corporation,Tokyo, Japan	BX53
Pro Calcitonin	Mindray,China
PVDF membrane	Millipore, USA		0.22 µm
RIPA	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G2002-100 ml
SDS-PAGE	Beyotime Biotechnology,China	P0012A
TNF-αELISA kits	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	GEM0004
Ultrasonic water bath	DONGGUAN KQAO ULTRASONIC EQUIPMENT CO.,LTD.;China	KQ-200KDE
Western Blot	Bio-Rad Laboratories, Inc.,USA
Western blot imaging System	Global Life Sciences IP Holdco LLC, JAPAN	Amersham ImageQuant 800
Whirlpool mixer	SCILOGEX;USA