Подготовка мышей к модели тяжелого острого панкреатита с помощью комбинации церулеина и липополисахарида внутрибрюшинной инъекции

Резюме

Внутрибрюшинное введение препарата является безопасным и эффективным неинвазивным подходом для индуцирования повреждения поджелудочной железы. В этом исследовании сравнивались пять различных протоколов внутрибрюшинных инъекций на мышах для индуцирования различной степени повреждения поджелудочной железы и была создана модель тяжелого повреждения поджелудочной железы для изучения патологических изменений и стратегий лечения тяжелого острого панкреатита (САП).

Аннотация

Лечение тяжелого острого панкреатита (САП) с высокими показателями смертности представляет собой значительную клиническую проблему. Изучение патологических изменений, связанных с САП, с использованием животных моделей может помочь в определении потенциальных терапевтических мишеней и изучении новых подходов к лечению. Предыдущие исследования в первую очередь индуцировали повреждение поджелудочной железы путем инъекции тавиаурохолата натрия в ретроградный желчный проток, но влияние хирургического повреждения на качество животной модели остается неясным. В этом исследовании мы использовали различную частоту внутрибрюшинных инъекций церулеина в сочетании с различными дозами ЛПС для индуцирования повреждения поджелудочной железы у мышей C57BL/6J и сравнили степень повреждения по пяти протоколам внутрибрюшинных инъекций. Что касается индуцирования острого панкреатита у мышей, предлагается протокол внутрибрюшинной инъекции, который приводит к смертности до 80% в течение 5 дней. В частности, мыши получали десять ежедневных внутрибрюшинных инъекций церулеина (50 мкг/кг), за которыми следовала инъекция ЛПС (15 мг/кг) через час после последнего введения церулина. Регулируя частоту и дозировку вводимых лекарств, можно эффективно манипулировать тяжестью повреждения поджелудочной железы. Эта модель демонстрирует высокую управляемость и имеет короткий цикл репликации, что делает ее возможной для выполнения одним исследователем без необходимости использования дорогостоящего оборудования. Он удобно и точно моделирует ключевые характеристики заболевания, наблюдаемые в SAP человека, демонстрируя при этом высокую степень воспроизводимости.

Введение

Тяжелый острый панкреатит характеризуется быстрым началом, быстрым прогрессированием и высокими показателями смертности в области заболевания пищеварительной системы¹. Высокий уровень смертности всегда был в центре внимания клинических исследований. Из-за непредсказуемых изменений клинических условий, гетерогенности проявлений болезни и ограниченной доступности образцов для человека, создание животных моделей становится все более важным для исследований болезней.

Ретроградная инъекция таурохолата натрия в общий желчный проток обычно используется для создания модели SAP² на крысе. Моделируя обструкцию поджелудочной железы и индуцируя рефлюкс желчи и жидкости поджелудочной железы, этот метод моделирования демонстрирует высокий процент успеха при воспроизведении животных моделей SAP. Тем не менее, следует отметить, что инвазивная хирургия оказывает влияние на саму животную модель. Кроме того, этот метод ограничен более крупными животными, такими как крысы и собаки, которые в основном используются в качестве подопытных. В целях моделирования часто используются альтернативные методы, включая дуоденальную интубацию³, прямую пункцию двенадцатиперстной кишки⁴ и прямую пункцию желчного протока-протока поджелудочной железы⁵.

Внутрибрюшинные инъекции и методы диетического моделирования дают неинвазивные преимущества, которые могут быть применены к животным любого размера. Мышиная модель САП, индуцированная кормлением холин-дефицитным этионином (CDE)⁶, имеет определенные осложнения, такие как плохо контролируемая гипергликемия и гипокальциемия, что делает ее непригодной для оценки новых диагностических и терапевтических подходов. С другой стороны, внутрибрюшинное введение церулеина в сочетании с L-аргинином⁷ представляет собой наиболее часто используемый метод индуцирования острого панкреатита у мышей. В частности, повторное внутрибрюшинное введение Caerulein — аналога холецистокинина — обеспечивает весьма подходящий подход к исследованию различных аспектов, связанных с этим деструктивным заболеванием, включая патогенез, воспаление и процессы регенерации. Благодаря своему структурному сходству с холецистокинином (ЦКК), церулин эффективно стимулирует сокращение желчного пузыря и секрецию ферментов поджелудочной железы, что приводит к дисбалансу секреции ферментов с последующим саморазрушением⁸. Липополисахарид (ЛПС), будучи повсеместно распространенным и широко изученным как молекула молекулы, ассоциированной с патогенами, может быть объединен с церулеином путем внутрибрюшинной инъекции для создания эффективной модели САП у мышей. Эта комбинация быстро запускает и высвобождает значительное количество воспалительных цитокинов, что приводит к чрезмерному местному и системному воспалению. В нескольких исследованиях сообщалось об индукции моделей SAP у мышей путем внутрибрюшинного введения церулеина в сочетании с ЛПС. Это может быть связано с тем, что внутрибрюшинное введение церулеина может вызвать отек поджелудочной железы и кровоизлияние у мышей, в то время как добавление ЛПС может немедленно вызвать панкреонекроз и усугубить системную воспалительную реакцию, сепсис и даже органную недостаточность. В настоящее время существуют различия в дозировке и частоте внутрибрюшинных инъекций церулеина, а также непоследовательность в дополнительной дозировке ЛПС. Достижение согласованности в моделях SAP мыши является сложной задачей 9,10,11,12; Поэтому необходимо установить стандартизированный протокол для получения идеальной модели. В данной статье мы опишем протокол внутрибрюшинного введения мышам и исследуем оптимальную частоту инъекций и дополнительную дозировку ЛПС.

протокол

Этот протокол был рассмотрен и одобрен Комитетом по этике Первой аффилированной больницы Аньхойского университета науки и технологии (Хуайнань, Китай) (Этический кодекс: 2023-KY-905-001). Исследование проводилось в соответствии с рекомендациями Национального института здравоохранения по уходу и использованию исследовательских грызунов во всех процедурах на животных. В настоящем исследовании использовались взрослые мыши C57BL/6J с массой тела 20-30 г. Мышей содержали в лаборатории на животных в течение одной недели в контролируемых условиях (около 21 °C с 12-часовым чередованием цикла дня и ночи). Мыши имели свободный доступ к пище и воде на протяжении всего времени. Подробная информация о реактивах и оборудовании, использованных в исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка животных

1. Распределите 84 здоровых мышей C57BL/6J на шесть групп, включая контрольную группу с травмой поджелудочной железы (PI) I, PI II, PI III, PI IV и PI V.
2. Прежде чем начать процедуру моделирования, пометьте каждую группу мышей ушными насечками и дайте им поститься в течение 12 часов.

2. Приготовление индуцированного разбавителя лекарственного средства

1. Растворите церулен (1 мг) в 1 мл PBS и поставьте в холодильник при температуре -20 °C.
2. Измерьте и запишите массу подопытных мышей за 1 ч до внутрибрюшинного введения препарата.
3. Извлеките требуемую общую массу церулеина в соотношении 50 мкг/кг, исходя из общего веса всех мышей.
4. Полученный препарат Церулеина снова разведите с PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем разведения PBS должен быть эквивалентен 5-кратному общему весу всех мышей. Тот же метод разбавления использовали для получения разбавителя ЛПС.

3. Внутрибрюшинное введение

Примечание: Внутрибрюшинные инъекции вводились каждой группе мышей в соответствии с протоколом, описанным в Дополнительной таблице 1 , для индукции модели. Еще 10 мышей были сгруппированы и обработаны в соответствии с 7-дневной выживаемостью.

1. Возьмите и удерживайте мышей таким образом, чтобы брюхо мышей было обращено вверх, а голова располагалась ниже хвоста, чтобы предотвратить повреждение органов при введении шприца.
2. Продезинфицируйте брюшную полость мышей с помощью ватных шариков с 75% спиртом.
3. Держите шприц в правой руке (с помощью иглы размером ≤0,5/≥0,3) и введите иглу в подкожную кожу с левой стороны от белой линии живота.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перейдите на правую сторону для следующей инъекции.
4. Как только игла достигнет подкожного слоя, переместите ее вперед примерно на 3-5 мм, а затем введите иглу шприца в брюшную полость под углом 45°. В этот момент следует почувствовать некоторое сопротивление.
5. Держите иглу неподвижно и вводите вещество медленно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте в 5 раз значение веса мышей в качестве объема одной внутрибрюшинной инъекции.
6. После инъекции вытащите иглу и аккуратно помассируйте и прижмите место инъекции стерильным ватным тампоном, чтобы полностью диффундировать препарат в брюшную полость мышей.
7. С помощью нового шприца повторите то же самое со следующими экспериментальными мышами.

4. Тестирование поведенческих способностей на открытом воздухе

Примечание: Через 12 часов после последней внутрибрюшинной инъекции было проведено тестирование поведенческих способностей в открытом поле для оценки общей дистанции активности и времени неподвижности мышей.

1. Поместите четыре одинаковые белые коробки прямо под камеру.
2. Подключите камеру к компьютеру с помощью видеокабеля.
3. Перед началом эксперимента убедитесь, что экспериментальная коробка чистая и не имеет каких-либо запахов.
4. Расположите животное в центре сетки, лицом от экспериментатора, и дайте ему адаптироваться к окружающей среде в течение 10 минут.
5. Запустите программу для отслеживания видео и нажмите на меню «Файл », чтобы создать новый эксперимент.
6. Настройте мониторинг для четырех одновременных полей зрения.
7. Отметьте длину и ширину экспериментального объекта, который может перемещаться в пределах коробки на экране мониторинга в режиме реального времени (30 см × 30 см).
8. Как только настройка будет завершена, приступайте к видеонаблюдению и записи.
9. Запишите активность мышей в течение 15 минут.
10. После тестирования снимите животное с сетки и верните его в клетку. Тщательно очистите сетку с помощью стерилизатора, содержащего диоксид хлора.

5. Сбор и исследование периферической крови мышей

1. Усыпьте мышей (в соответствии с протоколом, утвержденным учреждением).
   1. Провести эвтаназию подопытным мышам через 36 ч после внутрибрюшинной инъекции. Измерьте и запишите массу тела мышей до эвтаназии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вводите 0,18 мл 10% хлоралгидрата внутрибрюшинно, не допуская реакции на стимуляцию пальца ноги или хвоста.
   2. Левой рукой закрепите мышей, а правой рукой держите ножницы, чтобы подстричь усы с одной стороны мышей.
   3. Аккуратно надавите на кожу вокруг глаза, чтобы вызвать заложенность и выпячивание глазного яблока.
   4. С помощью изогнутых щипцов захватите глазное яблоко и быстро удалите его, собрав периферическую кровь в микроцентрифужную пробирку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использовались два различных типа микроцентрифужных пробирок, один из которых содержал антикоагулянт, а другой без.
   5. Одновременно слегка надавите на область сердца мыши средним пальцем левой руки, чтобы увеличить скорость перекачивания сердца.
2. Оставьте периферическую кровь без антикоагулянта при комнатной температуре на 30 минут.
3. Измерьте концентрации амилазы сыворотки крови (Amy) и липазы (Lip) с помощью автоматизированного биохимического анализатора методом ферментной скорости и методом циркуляции ферментов (следуя инструкциям производителя).
4. Определить уровни воспалительных индикаторов, таких как прокальцитонин (ПКТ) в плазме с помощью хемилюминесцентного метода с использованием коммерческого хемилюминесцентного тепловизора (следуя инструкциям производителя).
5. Используйте наборы для ИФА для измерения уровней HMGB-1, IL-6 и TNF-α в сыворотке крови мышей (следуя инструкциям производителя).
6. Проанализируйте периферическую кровь, обработанную антикоагулянтом, с помощью полностью автоматического анализатора клеток крови для оценки соответствующих параметров.

6. Забор ткани поджелудочной железы и подготовка парафинового среза

1. Поместите мышей в лежачее положение и закрепите их на пластине из пенопласта.
2. Выбрейте и продезинфицируйте эту область, затем сделайте срединный разрез брюшной полости и переверните тонкую кишечную трубку вправо, чтобы полностью обнажить поджелудочную железу.
3. Отсоедините двенадцатиперстную кишку и пилорический проток и найдите тонкую кишку под поджелудочной железой. Полностью освободить ткань поджелудочной железы по ходу кишечного протока.
4. С помощью беззубых щипцов зажмите селезенку и аккуратно потяните вверх.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь непосредственно к ткани поджелудочной железы и избегайте применения чрезмерной силы в течение всего процесса диссоциации.
5. Резко рассекают заднюю ткань связок поджелудочной железы вплоть до головки поджелудочной железы и разъединяют желчный проток и кровеносные сосуды.
6. Удалите ткани поджелудочной железы, промокните поверхность влагой впитывающей бумагой, взвесьте и запишите.
7. Зафиксируйте половину ткани поджелудочной железы с помощью 4% параформальдегида и храните другую половину в холодильнике при температуре -80 °C.
8. Приготовьте срезы парафина для поджелудочной железы, следуя приведенным ниже инструкциям.
   1. Очистите неподвижную ткань поджелудочной железы 75% спиртом и обрежьте ее до размера примерно 0,5 см × 0,5 см.
   2. Погрузите салфетку в 70% этанол на 20 минут, 80% этанол еще на 20 минут и 90% этанол на 15 минут.
   3. Дважды обработайте ткань 95% этанолом в течение 15 минут каждый раз, а затем дважды 100% этанолом в течение 5 минут каждый раз.
   4. Подвергните ткань двум раундам по 12 минут и 5 минут обработки раствором ксилола для обеспечения прозрачности.
   5. Замочите прозрачную ткань в восковом баке при температуре 65 °C на 1 час.
   6. Погрузите ткань в расплавленный парафин и дайте ей остыть. Получите срезы парафина поджелудочной железы с помощью слайсера (толщина: 5 мкм).
   7. Полученные ломтики парафина расплющить в воде при температуре 45 °C, смонтировать и высушить (условия выпекания: 40 °C в течение 14-16 часов).

7. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E)

1. Срезы парафина поджелудочной железы поместить в ксилол I и II на 30 мин, затем в безводный, 95%, 85% и 75% спирт на 5 мин и сверхчистую воду на 5 мин.
2. Окрашивать ядро клетки гематоксилином в течение 160 с, затем медленно промыть проточной водой.
3. Нанести раствор для дифференцировки спирта соляной кислоты на 5-10 с, затем быстро смыть проточной водой.
4. Срезы обработать безводным спиртом в течение 5 минут.
5. Инкубируйте цитоплазму с эозином в течение 30 с, затем промойте проточной водой.
6. Погрузите срезы в 75%, 85%, 95% и 100% этанол на 10 с каждая, затем обработайте ксилолом в течение 5 минут для обезвоживания.
7. Наконец, запечатайте срезы нейтральной смолой и понаблюдайте под микроскопом.
8. Выполнение патологической оценки и нормативов¹³.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Определяйте тяжесть панкреатита на основании таких показателей, как отек, ацинарный некроз, кровотечение, кровотечение и жировой некроз, а также воспалительное и периваскулярное воспаление. Используйте ранее опубликованные рекомендации по внедрению для начисления баллов¹³.

8. Иммуногистохимическое окрашивание

1. Депарафинизируйте залитые парафином участки ткани поджелудочной железы в ксилоле и затем регидратируйте их в градиенте растворов этанола.
2. Проведите эндогенную ферментную блокаду с использованием 3%_H2O2 в течение 20 мин после 30-минутного разрыва мембраны.
3. Блокируйте антитела 5% бычьей сывороткой при комнатной температуре в течение 30 минут, затем инкубируйте в течение ночи при 4 °C с разведением кролика анти-HMGB1 в соотношении 1:1500.
4. Промойте срезы PBS, затем инкубируйте их в соответствующих вторичных антителах в течение 30 мин при 37 °C. После этого проведите проявку цвета DAB, противоокрашивание гематоксилином, запечатайте нейтральной резинкой.

9. Метод TUNEL для выявления апоптоза в срезах поджелудочной железы

1. Очистите парафин от парафина поджелудочной железы в ксилоле в течение 5 минут, повторите дважды и промойте градиентным этанолом (100% в течение 5 минут, 90% в течение 2 минут, 70% в течение 2 минут и дистиллированной водой в течение 2 минут).
2. Смойте лишнюю жидкость вокруг парафиновых срезов с помощью PBS. Обработайте каждый образец 100 мкл протеиназы К, обеспечивая полное покрытие ткани. Инкубируйте образцы при 37 °C в течение 20 минут. Впоследствии замочите образцы в PBS 3 раза, каждый раз на 5 минут.
   Примечание: Раствор протеиназы К получали путем разбавления исходного раствора протеиназы К (200 мкг/мл) PBS в соотношении 1:9 (объем), в результате чего конечная концентрация составила 20 мкг/мл, исключая ДНКазу. Тщательная промывка протеиназы К необходима для того, чтобы избежать вмешательства в последующие реакции мечения.
3. Добавьте подходящее количество 3% H₂O₂ (разбавленного PBS) в ткань, чтобы полностью проникнуть в нее, и инкубируйте в течение 20 минут. Промойте салфетку PBS 3 раза по 5 мин каждый.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Парафиновые срезы следует поддерживать во влажном состоянии. Для инактивации эндогенных пероксидаз в тканях время инкубации не должно быть слишком большим, чтобы предотвратить ложноположительные результаты из-за разрыва ДНК, вызванного 3% H₂O₂.
4. Покройте всю площадь тестируемого образца 50 μл уравновешивающего буфера и инкубируйте в течение 10 минут.
5. Удалите как можно больше буфера Equilibration. Затем добавьте 56 мкл инкубационного буфера TdT в каждый образец ткани и инкубируйте в течение 1 ч (при комнатной температуре).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нельзя давать предметному стеклу высыхать, а также следует избегать воздействия света. Инкубационный буфер TdT готовили в соответствии с инструкцией производителя (Фермент TdT рекомбинантный: Biotin-dUTP Labeling Mix: Equilibration Buffer = 1 μL: 5 μL: 50 μL).
6. Немедленно промойте образцы тканей с помощью PBS. Промойте их 4 раза по 5 минут. Аккуратно удалите излишки раствора PBS вокруг образцов с помощью фильтровальной бумаги.
7. Добавьте 100 мкл предварительно разведенного реакционного раствора стрептавидин-HRP (Streptavidin-HRP: TBST = 1:300) в каждый образец ткани для реакции стрептавидин-HRP. Выдерживать в течение 30 минут. Затем промойте образцы PBS и промойте их 3 раза по 5 минут каждый.
8. Выполните окрашивание DAB, добавив 50 μL DAB в каждую парафиновую срезку. Наблюдайте за окрашиванием под микроскопом в режиме реального времени. После появления положительного окрашивания сразу же поместите предметные стекла во влажный бокс. Остановите реакцию, промыв его чистой водой.
9. Погрузите предметные стекла в раствор для окрашивания гематоксилина на 3-5 минут, затем промойте чистой водой.
10. Дифференцировать в растворе дифференцировки гематоксилина в течение примерно 2 с с последующим немедленным промыванием чистой водой.
11. Добейтесь синего цвета с помощью раствора для повторного воронения гематоксилина в течение нескольких секунд и промойте предметные стекла чистой водой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите микроскопическое исследование после ядерного окрашивания. Если окрашивание получилось слишком темным, верните предметные стекла в раствор для дифференцировки. Если окрашивание слишком светлое, возобновите процесс окрашивания с этапа ядерного окрашивания.
12. Обезвожьте образцы 4 порциями свежего безводного этанола в течение 5 минут каждая. Затем замочите их в бутаноле на 5 минут и в ксилоле на 5 минут. Наконец, используйте свежий ксилол еще 5 минут.
13. Закрепите предметные стекла с помощью нейтральной резинки. Дайте им высохнуть на воздухе естественным образом или высушите в духовке при температуре 60 °C.
14. Провести гистологическое исследование с помощью микроскопа белого света. Ядра апоптоза будут иметь коричневый цвет.
15. Рассчитайте соответствующий индекс апоптоза (AI).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдайте за предметными стеклами двойным слепым способом. На предметных стеклах TUNEL случайным образом выберите 5 положительных областей при большом увеличении (400x) и подсчитайте не менее 100 ацинарных клеток в каждой области, чтобы определить процент положительных клеток. AI = (общее количество апоптотических клеток/общее количество клеток) × 100%.

10. Проточная цитометрия

1. Получить свежие ткани поджелудочной железы и тщательно промыть их после перфузии PBS.
2. Приготовьте 0,5% раствор коллагеназы для внутривенного пищеварения и используйте ножницы для стерильных тканей для адекватного переваривания тканей поджелудочной железы.
3. Добавьте 5% раствор для прекращения сбраживания БСА в зависимости от состояния фрагментов поджелудочной железы и помутнения жидкости и центрифугируйте смесь при низкой температуре в течение 5 мин (~300 x g, 4 °C).
4. Выбросьте надосадочную жидкость, чтобы прекратить пищеварение.
5. Готовят питательную среду для клеточных культур, содержащую фенилметансульфонилфторид (PMSF) и 2,5% суспензию фетальных бычьих клеток сыворотки для ресуспендирования клеток поджелудочной железы.
6. Фильтруйте суспензии ацинарных клеток поджелудочной железы через нейлоновую сетку толщиной 200 меш, чтобы получить клеточные суспензии путем клеточной фильтрации.
7. Центрифугируйте суспензию ацинарных клеток поджелудочной железы при низкой температуре (соблюдайте условия, указанные в шаге 10.3).
8. Выбросьте надосадочную жидкость.
9. Промойте клетки с помощью предварительно охлажденного PBS.
10. Аккуратно ресуспендируйте клетки в предварительно охлажденном связывающем буфере 1x с помощью центробежной ресуспензии.
11. Пометьте ацинарные клетки поджелудочной железы Аннексином V-FITC/PI в соответствии с инструкциями производителя после корректировки концентрации клеток.
12. Используйте проточную цитометрию в течение 1 ч для обнаружения апоптоза в ацинарных клетках поджелудочной железы.

11. Вестерн-блоттинг каспазы-3 и HMGB-1

1. Извлеките белок поджелудочной железы.
   1. Извлеките 50 мг ткани поджелудочной железы и разрежьте ее на мелкие фрагменты.
   2. Добавьте 1 мл буфера для лизиса RIPA (содержащего PMSF и ингибитор фосфорилированной протеазы).
   3. Гомогенизируйте ткань поджелудочной железы на льду в течение 5 минут с помощью электрической кофемолки.
   4. Гомогенизированную ткань инкубировать на льду с легким встряхиванием в течение 2 ч.
   5. Центрифугируйте гомогенат при 4 °C в течение 10 мин при концентрации 4 500 x g.
   6. Соберите надосадочный раствор и храните его при температуре -80 °С.
2. Выполните количественное определение белка.
   1. Разбавьте определенный объем стандартного образца БСА (25 мг/мл) до концентрации 0,5 мг/мл.
   2. Приготовьте определенное количество рабочего раствора ВСА, смешав 50 объемов раствора ВСА А с 1 объемом раствора ВСА В, обеспечивая тщательное и равномерное перемешивание.
   3. Поместите стандартный образец BSA в стандартные отверстия для образцов на 96-луночном планшете в порядке 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16 и 20 μл. Сбалансируйте объем каждого отверстия дистиллированной водой, в результате чего общий объем составит 20 μл.
   4. Добавьте 2 мкл проб в отверстия для проб, затем последовательно добавьте 18 мкл дистиллированной воды для разбавления (1:9).
   5. Заполните каждую лунку 200 μL рабочего раствора BCA и дайте ему постоять при температуре 37 °C в течение примерно 20-30 минут.
   6. Измерьте поглощение на длине волны 562 нм. Рассчитайте концентрацию белка в образцах на основе стандартной кривой.
   7. Добавьте определенный объем раствора крекинга RIPA и разбавляющий буфер для разбавления образцов до тех пор, пока концентрация не достигнет 5-10 мкг/мкл, что считается целесообразным.
   8. Хранить образцы при температуре -20 °C после денатурации белка (100 °C; 10 мин).
3. Выполните вестерн-промокание.
   1. Подготовьтесь к SDS-PAGE.
      1. Установите формы для производства клея и проверьте их герметичность.
      2. Добавьте TEMED в 10% разделительный клей и равномерно перемешайте.
      3. Впрыскивайте смесь в форму, составляя примерно две трети объема, при этом не допуская образования пузырей.
      4. Добавьте изопропанол в форму и прижмите клей около 40 минут.
      5. Используйте эту же программу для настройки 5% концентрированного клея.
      6. Вылейте изопропанол и сразу же добавьте клей.
      7. Расческу расположить вертикально до тех пор, пока клей полностью не полимеризуется.
   2. Выполните операцию электрофореза.
      1. Добавьте образец, подлежащий испытанию, в ожидаемом порядке экспериментального контроля, в обратном порядке, в отверстия для отбора проб клея SDS-PAGE.
      2. Одновременно добавьте белковую метку, чтобы определить местоположение целевого белка и внутреннего эталонного белка.
      3. Поместите образец в резервуар для электрофореза после завершения добавления образца.
      4. Первоначально запустите при напряжении 80 В в течение 30 минут, а затем запустите гель для отделения белка при 100 В в течение 60 минут.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Следует обратить внимание на положение бромфенольного синего во избежание чрезмерного электрофореза.
   3. Выполните перенос белка.
      1. Разрежьте пленку PVDF в правом верхнем углу, чтобы она служила отметкой.
      2. Поместите пленку PVDF в раствор метанола на 5-10 секунд для активации.
      3. Замочите пленку PVDF в буфере для электрофореза примерно на 15 минут.
      4. Осторожно удалите гель после электрофореза и обрежьте излишки геля, следя за тем, чтобы гель оставался влажным на протяжении всего процесса.
      5. Соберите шину в следующем порядке: отрицательная пластина → губка → три слоя фильтровальной бумаги → геля → пленки ПВДФ → три слоя фильтровальной бумаги → губка → положительная пластина.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что между гелем и пленкой PVDF нет пузырей.
      6. Поместите собранный зажим во влажную вращающуюся канавку (от черного до черного) с кубиками льда, расположенными вокруг него.
      7. Включите питание и начните перенос пленки при 400 мА в течение 100 минут.
   4. Выполняйте герметизацию пленки PVDF и инкубацию первичных и вторичных антител.
      1. Аккуратно снимите пленку PVDF после переноса и промойте TBST в течение 10 минут, повторяя процесс 3-5 раз.
      2. Запечатайте пленку ПВДФ в 5% обезжиренном молоке на 2 часа.
      3. Снимите пленку PVDF и промойте TBST в течение 10 минут, повторив процесс 4 раза.
      4. Поместите пленку PVDF и разведенное первичное антитело вместе в холодильник при температуре 4 °C с легким встряхиванием и инкубируйте в течение ночи.
      5. На следующий день снимите пленку ПВДФ и смойте TBST в течение 10 минут, повторив процесс 4 раза.
      6. Инкубируйте пленку PVDF в меченном HRP разбавителе вторичных антител в течение приблизительно 2 ч.
      7. Промойте пленку ПВДФ с TBST в течение 10 минут, повторив процесс 4 раза.
   5. Экспонируйте пленку и анализируйте ее.
      1. Нанесите приготовленный раствор ECL на пленку равномерно.
      2. Экспонируйте пленку в темной комнате с экспонометром примерно на 2-3 минуты, а затем храните ее.
      3. Проведите анализ с помощью программного обеспечения image J.

Результаты

Процесс экспериментального моделирования мышей проиллюстрирован на рисунке 1. Через 12 ч после завершения инъекции с помощью видеорегистратора открытого поля контролировали расстояние движения и продолжительность неподвижности различных экспериментальных ...

Обсуждение

В настоящее время не хватает эффективных средств для снижения высокой смертности у пациентов с тяжелым острым панкреатитом. Крайне важно исследовать эффективность лекарственных препаратов в усилении механизмов иммунной стабильности. Существует острая потребность в идеальной живот?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
20× Citric Acid Antigen Repair Solution (pH 6.0)	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G1202-250 ml
Amylase	Mindray,China
Annexin V-FITC/PI	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G1511	diluted at 1:20
Anti-HMGB1 Rabbit pAB	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	GB11103	diluted at 1:1800
BCA protein quantitative detection kit	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G2026-200T
BD FACSCanto II Flow Cytometer	BD Life Sciences, San Jose, CA, 95131, USA	BD FACSCanto II
BSA	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	GC305010-100g
C57BL/6J	Cavion Experimental Animal Co., Changzhou, China		license number SCXY (Su) 2011–0003
Ceruletide	MCE, New Jersey, USA	17650-98-5	50 µg/kg
Chemiluminescence imager	Cytiva CO.,LTD.;USA
Citric acid antigen repair Solution (Dry powder pH 6.0)	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G1201-5 L
Collagenase IV	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	GC305014	0.5 mg/mL
DAB (SA-HRP) Tunel Cell Apoptosis Detection Kit	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G1507-100 T
Dimension EXL with LM Integrated Chemistry System	Siemens Healthcare Diagnostics Inc.Brookfield,USA	YZB/USA 8311-2014
ECL developer	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China
Eosin dye (alcohol soluble)	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G1001-100 ml
EthoVision XT	Noldus, Netherlands
FITC-labeled goat anti-rabbit IgG	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	GB22303	diluted at 1:50
Fully automatic blood cell analyzer	Zybio Inc. China	Zybio-Z3 CRP
GapDH	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	GB11103	diluted at 1:1500
Hematoxylin blue return solution	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G1040-500 ml
Hematoxylin differentiation solution	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G1039-500 ml
Hematoxylin dye	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G1004-100 ml
HMGB-1 ELISA kits	njjcbio Co., Ltd, China
HOMOGENIZER	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	KZ-III-F;IC111150 100222
HRP-labeled goat anti-rabbit IgG	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	GB23303	diluted at 1:1500
IL-6 ELISA kits	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	GEM0001
Lipase	Mindray,China
Lipopolysaccharide	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	GC205009	15 mg/kg
Low temperature high speed centrifuge	Changsha Pingfan Apparatus&Instrument Co.,Ltd.,China	TGL-20M
Membrane breaking liquid	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G1204
microtome	Jinhua Craftek Instrument Co., Ltd.;China	CR-601ST
Nylon mesh	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China		200-mesh
One-step TUNEL cell apoptosis detection kit (DAB staining method)	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G1507-100T
Paraffin tissue embedding machine	PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO.,LTD;Changzhou,China	PBM-A
Pathological tissue drying apparatus	PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO.,LTD;Changzhou,China	PHY-III
Phosphate-buffered saline	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G4202-100ML
PMSF	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G2008-1 ml
Positive fluorescence microscope	Olympus Corporation,Tokyo, Japan	BX53
Pro Calcitonin	Mindray,China
PVDF membrane	Millipore, USA		0.22 µm
RIPA	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	G2002-100 ml
SDS-PAGE	Beyotime Biotechnology,China	P0012A
TNF-αELISA kits	Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China	GEM0004
Ultrasonic water bath	DONGGUAN KQAO ULTRASONIC EQUIPMENT CO.,LTD.;China	KQ-200KDE
Western Blot	Bio-Rad Laboratories, Inc.,USA
Western blot imaging System	Global Life Sciences IP Holdco LLC, JAPAN	Amersham ImageQuant 800
Whirlpool mixer	SCILOGEX;USA