طريقة مبسطة لعزل وزراعة الخلايا الظهارية الصبغية للشبكية من الفئران البالغة

Summary

تعمل ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) كحاجز حاسم بين المشيمية والشبكية ، مما يعزز صحة ووظيفة أنواع خلايا الشبكية ، مثل المستقبلات الضوئية. هنا ، نصف بروتوكولا بسيطا وفعالا لعزل وزراعة الفئران البالغة RPE.

Abstract

الخلايا الظهارية الصبغية في شبكية العين (RPE) ضرورية للوظيفة المناسبة للشبكية. يشارك خلل RPE في التسبب في أمراض الشبكية المهمة ، مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر ، والتهاب الشبكية الصباغي ، واعتلال الشبكية السكري. نقدم نهجا مبسطا لعزل RPE عن عيون البالغين الفئران. على عكس الأساليب المبلغ عنها سابقا ، يتيح هذا النهج عزل وزراعة RPE عالي النقاء من الفئران البالغة. لا تتطلب هذه الطريقة البسيطة والسريعة مهارة تقنية واسعة ويمكن تحقيقها باستخدام الأدوات والكواشف العلمية الأساسية. يتم عزل RPE الأولي من الفئران الخلفية C57BL / 6 الذين تتراوح أعمارهم بين 3 إلى 14 أسبوعا عن طريق استئصال العين متبوعا بإزالة الجزء الأمامي. يتم استخدام التربسين الأنزيمي والطرد المركزي لفصل وعزل RPE عن فنجان العين. في الختام ، يقدم هذا النهج بروتوكولا سريعا وفعالا لاستخدام RPE في دراسة وظيفة الشبكية ومرضها.

Introduction

ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) هي طبقة أحادية الخلية متخصصة تبطن غشاء بروخ وتقع بين المستقبلات الضوئية والمشيمية¹. تلعب خلايا RPE دورا مهما في الوظيفة المناسبة للشبكية. تنقل خلايا RPE الجلوكوز وفيتامين أ إلى المستقبلات الضوئية ، وتعزز الرؤية عن طريق إعادة إيزوميرة الشبكية العابرة بالكامل إلى شبكية 11 رابطة الدول المستقلة وتحافظ على الأجزاء الخارجية من المستقبلات الضوئية من خلال البلعمة للأجزاء الخارجية المتساقطة ، وإزالة الماء من الفضاء تحت الشبكية ، وتشكيل الحاجز الدموي الشبكي الخارجي من خلال وجود تقاطعات ضيقة وإفراز عوامل النمو العصبية (مثل عامل الصباغ المشتق من الظهارة ، وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسي) التي تدعم المستقبلات الضوئية². يشارك خلل خلايا RPE في التسبب في اعتلالات الشبكية المختلفة ، بما في ذلك الضمور البقعي المرتبط بالعمر ، والتهاب الشبكية الصباغي ، واعتلال الشبكية السكري^3،4،5. تعد الدراسات المختبرية التي تستخدم خلايا RPE ضرورية لتحسين فهمنا للتسبب في هذه الأمراض. تفضل خلايا RPE الأولية كثيرا لهذه الدراسات نظرا لأن خطوط خلايا RPE ، رغم توفرها بسهولة ، تفتقر إلى الخصائص الرئيسية لخلايا RPE الأولية.

في حين تم استخدام أنواع مختلفة كمصادر لخلايا RPE الأولية ، تتمتع الفئران بميزة استخدام التعديلات الجينية للمساعدة في فهم التسبب في اعتلال الشبكية. تتطلب البروتوكولات الموصوفة سابقا لعزل خلايا RPE عن القوارض إما استخدام الوليدية ، أو طويلة ، أو تتطلب مهارة فنية ، أو غير مناسبة للاستزراع^{6،7،8،9،10،11،12}. وصفنا طريقة بسيطة وسريعة لعزل خلايا RPE عن الفئران البالغة التي تنتج ثقافات عالية النقاء لهذه الخلايا.

Protocol

تمت الموافقة على استخدام الموضوعات الحيوانية في هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) بجامعة كيس ويسترن ريزيرف.

1. إعداد الكواشف

1. قم بإعداد وسط عازل للغسيل عن طريق استكمال محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) ، بدون كالسيوم ، بدون مغنيسيوم ، بدون فينول أحمر بمحلول عازل HEPES 10 mM. احفظ المحلول على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
2. قم بإعداد وسط RPE عن طريق استكمال وسط النسر المعدل من Dulbecco ب 4.5 جم / لتر من الجلوكوز ، و 1.25x مكمل GlutaMAX (تركيز المخزون 100x أو 200 mM ؛ التركيز النهائي 2.5 mM L-glutamine) ، مع مصل بقري جنيني 10٪ ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، و 1x محلول أحماض أمينية غير أساسية MEM (100x). قبل الاستخدام ، قم بتسخين الوسائط مسبقا إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.

2. استخراج عين الماوس

1. القتل الرحيم للفأر ، ويفضل أن يتراوح عمره من 3 إلى 14 أسبوعا ، باستخدام طريقة القتل الرحيم المعتمدة من IACUC (خلع عنق الرحم تحت التخدير باستخدام كوكتيل الكيتامين / الزيلازين عند 0.1 مل لكل 20 جم من الفئران [87.5 مجم / كجم من الكيتامين و 12.5 مجم / كجم من الزيلازين] كانت الطريقة المستخدمة في هذه الدراسة).
   ملاحظة: ستسهل العيون التي تم جمعها من الفئران الأصغر سنا زيادة إنتاج الخلايا الظهارية الصبغية في شبكية العين بمرور الوقت وتوسيع القدرة على الممرات المتتالية.
2. ضع الماوس بشكل مسطح على جانبه مع توجيه العين لأعلى.
3. ضع السبابة والإبهام فوق وتحت العين ، على التوالي. اضغط برفق على بنية العظام المحيطة بالعين للحث على بروز مقلة العين.
4. أدخل طرف المقص المفتوح قليلا أسفل العين وقم بتدوير المعصم برفق بعيدا عن العين 90 درجة حتى تنفصل العين عن التجويف.
   ملاحظة: لا تغلق المقص لقطع العين أو العصب البصري ، لأنه سيجعل تشريح فنجان العين أكثر صعوبة.
5. ضع العين وتدحرجها على الفور في 70٪ إيثانول لمدة لا تزيد عن 5 ثوان قبل نقلها إلى وسط عازل للغسيل يحفظ على الثلج.
6. تحت مجهر تشريح ، انقل عين واحدة في كل مرة إلى طبق بتري مملوء بمحلول غسيل وشرائط من الشاش المنقوع.
7. تثبيت العين عن طريق عقد العصب البصري مع ملاقط. قم بعمل شق برفق على مستوى ora serrata باستخدام سكين جراحي 3.00 مم 45 درجة أو شفرة حلاقة 0.009 بوصة.
8. باستخدام مقص Vannas ، أدخل المقص برفق في الشق واقطع حول محيط ora serrata حتى يمكن إزالة الجزء الأمامي والجسم الزجاجي والتخلص منه.
9. انزع شبكية العين برفق من فنجان العين باستخدام ملقط مربوط ، مع الحرص على عدم إزعاج طبقة RPE.
   ملاحظة: لتسهيل إزالة الشبكية ، املأ ماصة النقل بوسط عازل للغسيل وضعه بعناية على حواف فنجان العين لرفع الشبكية برفق.
10. أخيرا ، قم بإزالة العصب البصري والأنسجة الضامة الزائدة من فنجان العين باستخدام المقص. احرص على عدم ثقب فنجان العين.

3. عزل RPE الأساسي

1. انقل فنجان العين إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على 1 مل من 0.25٪ تربسين + 0.02٪ EDTA.
   ملاحظة: يمكن إضافة فنجان للعين إلى حصة واحدة من Trypsin-EDTA لزيادة إنتاجية RPE القابلة للزراعة.
2. نقل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة إلى حمام مائي على حرارة 37 درجة مئوية واحتضانها لمدة 10 دقائق. كل 2 دقيقة ، قم بإزالة الأنابيب من حمام مائي واضغط بقوة على الجزء السفلي من الأنبوب 40 مرة على سطح العمل.
3. بعد 10 دقائق ، قم بتعطيل فنجان العين برفق ميكانيكيا باستخدام ماصة مصلية P1000 أو 2 مل عن طريق السحب لأعلى ولأسفل لا يزيد عن 3 مرات.
   ملاحظة: يعد تجزئة أوراق RPE أمرا ضروريا لأن الأوراق الكبيرة لن تلتصق بشكل صحيح.
4. قم بتحييد التربسين على الفور عن طريق وضع صفائح RPE المنفصلة ، ولكن ليس فنجان العين ، على 0.5 مل من مصل الجنين البقري (FBS) في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
5. علاوة على ذلك ، قم بتخفيف التربسين عن طريق وضع 3 مل من وسائط RPE بالتنقيط على طبقات أوراق FBS و RPE.
6. أجهزة الطرد المركزي RPE في 340 × ز لمدة 3 دقائق.
7. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في كمية مناسبة من وسائط RPE إما للوحة 24 بئرا (1.9 سم² / بئر) أو لوحة 48 بئر (0.75 سم² / بئر).
   ملاحظة: يمكن طلاء RPE على ألواح جيدة مغلفة ببروتينات مصفوفة خارج الخلية ، وتحديدا اللامينين أو الكولاجين الوريدي أو الفبرونيكتين ، لزيادة الالتصاق¹¹. يمكن أيضا إعادة تعليق RPE في 1 مل من وسائط RPE ووضعها في طبقات على تدرج فصل كثافة بنسبة 40٪ لزيادة عزل خلايا RPE النقية. بالإضافة إلى ذلك ، قد يؤدي تدوير اللوحة عند 340 × جم لمدة 3-5 دقائق إلى زيادة التصاق الخلية¹³.
8. احتضان عند 37 درجة مئوية عند 5٪ CO₂.

4. زراعة RPE

1. لا تعطل RPE المعزول لمدة 3 أيام على الأقل. بعد 72 ساعة ، قم بإزالة الوسط القديم برفق واستبدله بوسائط جديدة تم تسخينها مسبقا.
2. قم بتغيير الوسيط كل 48 ساعة بعد أول 3 أيام.
3. بمجرد وصول الخلايا إلى نقطة التقاء ، قم بتمرير الخلايا باستخدام 0.25٪ تربسين + 0.02٪ EDTA وقم بتقليل FBS في وسائط RPE إلى 2٪.
   ملاحظة: تم الإبلاغ سابقا عن RPE الأساسي لبدء إزالة التمايز بعد 5-7 مقاطع وسيبدأ في فقدان شكله السداسي وتصبغه¹⁴.

النتائج

تم استخدام البروتوكول الموصوف على الفئران الخلفية C57BL / 6. لا يبدو أن الجنس يغير القدرة على ثقافة RPE. تنتج الفئران التي تقل أعمارها عن 6 أسابيع صفائح RPE محدودة مقارنة بالفئران الأكبر سنا ، وقد تكون هناك حاجة إلى مزيد من العيون للوصول إلى الالتقاء الأمثل. بعد العزلة ، تستغرق خلايا RPE حوالي 3 أيام...

Discussion

في هذه المقالة ، حددنا بروتوكولا مبسطا لعزل وثقافة ظهارة الصباغ الشبكي الفئران. عبرت خلايا RPE المعزولة من عيون الفئران البالغة عن علامة خاصة ب RPE ، RPE65 ، وعلامة تقاطع بين الخلايا ، ZO-1. بالإضافة إلى ذلك ، تطورت الخلايا المستزرعة إلى صفائح سداسية مصطبغة في الثقافة.

تم نشر عدة طر?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.009 RD Single-Edge Blades	Personna	941202
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	10-013-CV	with 4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate
Fetal bovine serum	Corning	35010CV
GlutaMAX, 100x	Gibco	35050061
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14175095	no Calcium, no magnesium, no phenol red
HEPES Buffer Solution (1M)	Gibco	15630106
MEM Non-Essential Amino Acids, 100x	Gibco	11140050
Micro-Unitome Knife	BVI Beaver	377546
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x	Corning	30-002-CI
Polystyrene Microplates	Falcon	08-772-1	24-well or 48-well
Regular Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	with phenol red
Vannas scissors	Fine Science Tools	10091-12