Méthode simplifiée d’isolement et de culture de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes de souris adultes

Résumé

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) agit comme une barrière cruciale entre la choroïde et la rétine, favorisant la santé et la fonction des types de cellules rétiniennes, telles que les photorécepteurs. Nous décrivons ici un protocole simple et efficace pour isoler et cultiver l’EPR murin adulte.

Résumé

Les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes (EPR) sont essentielles au bon fonctionnement de la rétine. Le dysfonctionnement de l’EPR est impliqué dans la pathogenèse d’importantes maladies rétiniennes, telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge, la rétinite pigmentaire et la rétinopathie diabétique. Nous présentons une approche simplifiée pour l’isolement de l’EPR à partir d’yeux adultes murins. Contrairement aux méthodes précédemment rapportées, cette approche permet d’isoler et de cultiver des EPR très purs à partir de souris adultes. Cette méthode simple et rapide ne nécessite pas de compétences techniques approfondies et est réalisable avec des outils scientifiques et des réactifs de base. Les EPR primaires sont isolées chez des souris de fond C57BL/6 âgées de 3 à 14 semaines par énucléation de l’œil suivie de l’ablation du segment antérieur. La trypsinisation enzymatique et la centrifugation sont utilisées pour dissocier et isoler l’EPR de l’œilleton. En conclusion, cette approche offre un protocole rapide et efficace pour l’utilisation de l’EPR dans l’étude de la fonction rétinienne et de la maladie.

Introduction

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est une monocouche cellulaire spécialisée qui tapisse la membrane de Bruch située entre les photorécepteurs et la choroïde¹. Les cellules EPR jouent un rôle essentiel dans le bon fonctionnement de la rétine. Les cellules EPR transportent le glucose et la vitamine A vers les photorécepteurs, favorisent la vision par réisomérisation de la rétine tout-trans en rétinienne 11-cis et maintiennent les segments externes du photorécepteur par phagocytose des segments externes excrétés, éliminent l’eau de l’espace sous-rétinien, forment la barrière hémato-rétinienne externe par la présence de jonctions serrées et sécrètent des facteurs de croissance neurotropes (tels que le facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire, et facteur de croissance des fibroblastes de base) qui soutiennent les photorécepteurs². Le dysfonctionnement des cellules EPR est impliqué dans la pathogenèse de diverses rétinopathies, notamment la dégénérescence maculaire liée à l’âge, la rétinite pigmentaire et la rétinopathie diabétique ^3,4,5. Les études in vitro utilisant des cellules RPE sont essentielles pour améliorer notre compréhension de la pathogenèse de ces maladies. Les cellules primaires de l’EPR sont de loin préférées pour ces études, car les lignées cellulaires de l’EPR, bien qu’elles soient facilement disponibles, ne présentent pas les caractéristiques clés des cellules primaires de l’EPR.

Alors que diverses espèces ont été utilisées comme sources de cellules primaires de l’EPR, les souris ont l’avantage d’utiliser des modifications génétiques pour aider à comprendre la pathogenèse des rétinopathies. Les protocoles décrits précédemment pour isoler les cellules EPR des rongeurs nécessitent l’utilisation d’animaux nouveau-nés, sont longs, nécessitent des compétences techniques ou ne conviennent pas à la culture 6,7,8,9,10,11,12. Nous décrivons une méthode simple et rapide pour isoler les cellules EPR de souris adultes qui produisent des cultures très pures de ces cellules.

Protocole

L’utilisation de sujets animaux dans cette étude a été approuvée par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université Case Western Reserve.

1. Préparation des réactifs

1. Préparez le milieu tampon de lavage en complétant la solution saline équilibrée de Hank (HBSS), sans calcium, sans magnésium, sans rouge de phénol avec 10 mM de solution tampon HEPES. Maintenir la solution à 4 °C jusqu’à utilisation.
2. Préparez le milieu EPR en complétant le milieu Eagle’s modifié de Dulbecco avec 4,5 g/L de glucose, 1,25 fois le supplément GlutaMAX (concentration de base 100x ou 200 mM ; concentration finale de 2,5 mM de L-glutamine), avec 10% de sérum de veau fœtal, 1% de pénicilline/streptomycine et 1x solution d’acides aminés non essentiels MEM (100x). Avant utilisation, préchauffez le média à 37 °C au bain-marie.

2. Extraction de l’œil de la souris

1. Euthanasier la souris, de préférence âgée de 3 à 14 semaines, à l’aide d’une méthode d’euthanasie approuvée par l’IACUC (la luxation cervicale sous anesthésie à l’aide d’un cocktail de kétamine et de xylazine à raison de 0,1 mL par 20 g de souris [87,5 mg/kg de kétamine et 12,5 mg/kg de xylazine] a été utilisée dans cette étude).
   REMARQUE : Les yeux prélevés sur des souris plus jeunes faciliteront l’augmentation du rendement des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes au fil du temps et étendront la capacité de passages successifs.
2. Posez la souris à plat sur le côté, l’œil orienté vers le haut.
3. Placez l’index et le pouce au-dessus et en dessous de l’œil, respectivement. Appliquez doucement une pression sur la structure osseuse entourant l’œil pour induire la saillie du globe oculaire.
4. Insérez la pointe des ciseaux légèrement ouverts sous l’œil et tournez doucement le poignet en l’éloignant de l’œil de 90° jusqu’à ce que l’œil se détache de l’orbite.
   REMARQUE : Ne fermez pas les ciseaux pour couper l’œil ou le nerf optique, car cela rendrait la dissection de l’œilleton plus difficile.
5. Placez immédiatement l’œil et roulez-le dans de l’éthanol à 70 % pendant 5 secondes au maximum avant de le transférer dans un milieu tampon de lavage maintenu sur de la glace.
6. À l’aide d’un microscope à dissection, transférez un œil à la fois dans une boîte de Pétri remplie de tampon de lavage et de bandes de gaze trempée.
7. Stabilisez l’œil en tenant le nerf optique à l’aide d’une pince à épiler. Faites doucement une incision au niveau de l’ora serrata à l’aide d’un couteau chirurgical de 3,00 mm à 45° ou d’une lame de rasoir de 0,009".
8. À l’aide de ciseaux Vannas, insérez doucement les ciseaux dans l’incision et coupez autour de la circonférence de l’ora serrata jusqu’à ce que le segment antérieur et le vitré puissent être retirés et jetés.
9. Décollez doucement la rétine de l’œilleton à l’aide d’une pince attachée, en prenant soin de ne pas perturber la couche d’EPR.
   REMARQUE : Pour faciliter l’élimination de la rétine, remplissez une pipette de transfert avec un produit tampon de lavage et appliquez-la soigneusement sur les bords de l’œilleton pour soulever doucement la rétine.
10. Enfin, retirez le nerf optique et l’excès de tissu conjonctif de l’œilleton à l’aide de ciseaux. Attention à ne pas percer l’œilleton.

3. Isolement de l’EPR primaire

1. Transférez l’œilleton dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant 1 mL de trypsine à 0,25 % + 0,02 % d’EDTA.
   REMARQUE : Deux œilletons peuvent être ajoutés à une aliquote de trypsine-EDTA pour augmenter le rendement en EPR cultivable.
2. Transférez les tubes de microcentrifugation dans un bain-marie réglé à 37 °C et incubez pendant 10 min. Toutes les 2 minutes, retirez les tubes du bain-marie et tapotez fermement le bas du tube 40 fois sur le plan de travail.
3. Après 10 min, perturbez doucement l’œilleton mécaniquement à l’aide d’une pipette sérologique P1000 ou de 2 mL en pipetant de haut en bas pas plus de 3 fois.
   REMARQUE : La fragmentation des feuilles RPE est essentielle car les grandes feuilles n’adhéreront pas correctement.
4. Neutralisez immédiatement la trypsine en superposant les feuillets d’EPR détachés, mais pas l’œilleton, sur 0,5 mL de sérum fœtal bovin (FBS) dans un tube conique de 15 mL.
5. De plus, diluez la trypsine en superposant 3 mL de média EPR goutte à goutte sur les couches de feuilles de FBS et d’EPR.
6. Centrifuger l’EPR à 340 x g pendant 3 min.
7. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans une quantité appropriée de milieu EPR pour une plaque de 24 puits (1,9 cm²/puits) ou une plaque de 48 puits (0,75 cm²/puits).
   REMARQUE : L’EPR peut être plaqué sur des plaques bien recouvertes de protéines de matrice extracellulaire, en particulier de laminine, de collagène IV ou de fibronectine, pour augmenter l’adhérence¹¹. L’EPR peut également être remis en suspension dans 1 mL de milieu EPR et superposé sur un gradient de séparation de densité de 40 % pour isoler davantage les cellules EPR pures. De plus, faire tourner la plaque à 340 x g pendant 3 à 5 minutes peut augmenter l’adhésion cellulaire¹³.
8. Incuber à 37 °C à 5% de CO₂.

4. Culture de l’EPR

1. Ne perturbez pas l’EPR isolé pendant au moins 3 jours. Après 72 h, retirez délicatement l’ancien média et remplacez-le par un média frais et préchauffé.
2. Changez de milieu toutes les 48 h après les 3 premiers jours.
3. Une fois que les cellules atteignent la confluence, faites passer les cellules en utilisant 0,25 % de trypsine + 0,02 % d’EDTA et réduisez le FBS dans le milieu RPE à 2 %.
   REMARQUE : Les EPR primaires ont déjà commencé à se dédifférencier après 5 à 7 passages et commenceront à perdre leur forme hexagonale et leur pigmentation¹⁴.

Résultats

Le protocole décrit a été utilisé sur des souris de fond C57BL/6. Le sexe ne semble pas changer la capacité à cultiver l’EPR. Les souris de moins de 6 semaines produisent des feuilles d’EPR limitées par rapport aux souris plus âgées, et plus d’yeux peuvent être nécessaires pour atteindre une confluence optimale. Après l’isolement, les cellules EPR mettent environ 3 jours à se stabiliser et à se fixer à la plaque de culture cellulaire. Environ 24 h après l’isolement, des cellules rondes et pigmen...

Discussion

Dans cet article, nous avons décrit un protocole simplifié pour l’isolement et la culture de l’épithélium pigmentaire rétinien murin. Les cellules EPR isolées dans les yeux de souris adultes ont exprimé un marqueur spécifique de l’EPR, RPE65, et un marqueur de jonction intercellulaire, ZO-1. De plus, les cellules cultivées se sont développées en feuilles hexagonales pigmentées en culture.

Plusieurs méthodes d’isolement de l’EPR chez les rongeurs ont été publiées préc...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.009 RD Single-Edge Blades	Personna	941202
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	10-013-CV	with 4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate
Fetal bovine serum	Corning	35010CV
GlutaMAX, 100x	Gibco	35050061
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14175095	no Calcium, no magnesium, no phenol red
HEPES Buffer Solution (1M)	Gibco	15630106
MEM Non-Essential Amino Acids, 100x	Gibco	11140050
Micro-Unitome Knife	BVI Beaver	377546
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x	Corning	30-002-CI
Polystyrene Microplates	Falcon	08-772-1	24-well or 48-well
Regular Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	with phenol red
Vannas scissors	Fine Science Tools	10091-12