שיטה פשוטה לבידוד ותרבית של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעכברים בוגרים

Summary

אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE) פועל כמחסום מכריע בין הכורואיד לרשתית, ומקדם את בריאותם ותפקודם של סוגי תאי רשתית, כגון פוטורצפטורים. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול פשוט ויעיל לבידוד וטיפוח RPE של מורין בוגר.

Abstract

תאי אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE) הם קריטיים לתפקוד תקין של הרשתית. תפקוד לקוי של RPE מעורב בפתוגנזה של מחלות רשתית חשובות, כגון ניוון מקולרי הקשור לגיל, רטיניטיס פיגמנטוזה ורטינופתיה סוכרתית. אנו מציגים גישה יעילה לבידוד RPE מעיניים בוגרות. בניגוד לשיטות שדווחו בעבר, גישה זו מאפשרת בידוד ותרבית של RPE טהור ביותר מעכברים בוגרים. שיטה פשוטה ומהירה זו אינה דורשת מיומנות טכנית נרחבת והיא ניתנת להשגה באמצעות כלים מדעיים בסיסיים וריאגנטים. RPE ראשוני מבודד מעכברי רקע C57BL/6 בגילאי 3 עד 14 שבועות על ידי שאיבה של העין ואחריה הסרת המקטע הקדמי. טריפסיניזציה אנזימטית וצנטריפוגה משמשים לניתוק ולבידוד RPE מכוס העין. לסיכום, גישה זו מציעה פרוטוקול מהיר ויעיל לניצול RPE בחקר תפקוד הרשתית ומחלות.

Introduction

אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) הוא חד-שכבתי תאי מיוחד המצפה את קרום ברוך הממוקם בין פוטורצפטורים לבין כורואיד¹. תאי RPE ממלאים תפקיד קריטי בתפקוד תקין של הרשתית. תאי RPE מובילים גלוקוז וויטמין A לקולטני אור, מקדמים ראייה על ידי איזומריזציה מחדש של רשתית all-trans לתוך רשתית 11-cis ושומרים על מקטעים חיצוניים של photoreceptor באמצעות phagocytosis של מקטעים חיצוניים שנשפכו, להסיר מים מהחלל subretinal, ליצור את מחסום הדם-רשתית החיצוני באמצעות נוכחות של צמתים הדוקים להפריש גורמי גדילה נוירוטרופיים (כגון פיגמנט אפיתל נגזר פקטור, ו-Basic Fibroblast Growth Factor) התומכים בפוטורצפטורים². תפקוד לקוי של תאי RPE מעורב בפתוגנזה של רטינופתיות שונות, כולל ניוון מקולרי הקשור לגיל, רטיניטיס פיגמנטוזה ורטינופתיה סוכרתית ^3,4,5. מחקרי מבחנה המשתמשים בתאי RPE הם קריטיים לשיפור הבנתנו את הפתוגנזה של מחלות אלה. תאי RPE ראשוניים מועדפים בהרבה עבור מחקרים אלה מכיוון שקווי תאי RPE, בעוד שהם זמינים, חסרים מאפיינים עיקריים של תאי RPE ראשוניים.

בעוד שמינים שונים שימשו כמקורות לתאי RPE ראשוניים, לעכברים יש את היתרון של שימוש בשינויים גנטיים כדי לעזור להבין את הפתוגנזה של רטינופתיות. פרוטוקולים שתוארו בעבר לבידוד תאי RPE ממכרסמים דורשים שימוש בבעלי חיים בילודים, הם ארוכים, דורשים מיומנות טכנית, או אינם מתאימים לתרבית 6,7,8,9,10,11,12. אנו מתארים שיטה פשוטה ומהירה לבידוד תאי RPE מעכברים בוגרים המניבים תרביות טהורות ביותר של תאים אלה.

Protocol

השימוש בבעלי חיים במחקר זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת קייס ווסטרן ריזרב.

1. הכנת ריאגנטים

1. הכינו את מדיום חיץ הכביסה על ידי השלמת תמיסת המלח המאוזנת של Hank (HBSS), ללא סידן, ללא מגנזיום, ללא פנול אדום עם תמיסת חיץ HEPES של 10 mM. יש לשמור את התמיסה בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
2. הכינו מדיום RPE על ידי השלמת מדיום הנשר המתוקן של Dulbecco עם 4.5 גרם / ליטר גלוקוז, תוסף גלוטמקס 1.25x (ריכוז מלאי 100x או 200 mM; ריכוז סופי של 2.5 mM L-גלוטמין), עם 10% נסיוב בקר עוברי, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, ותמיסת חומצות אמינו לא חיוניות 1x MEM (100x). לפני השימוש, לחמם מראש את המדיה ל 37 ° C באמבט מים.

2. חילוץ עין עכבר

1. המתת חסד של העכבר, רצוי בטווח של 3 עד 14 שבועות, באמצעות שיטה מאושרת IACUC של המתת חסד (נקע צוואר הרחם בהרדמה באמצעות קוקטייל קטמין/קסילזין ב 0.1 מ"ל לכל 20 גרם עכבר [87.5 מ"ג / ק"ג קטמין ו 12.5 מ"ג / ק"ג קסילזין] הייתה השיטה ששימשה במחקר זה).
   הערה: עיניים שנאספו מעכברים צעירים יותר יאפשרו תפוקה מוגברת של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית לאורך זמן ויאריכו את היכולת למעברים עוקבים.
2. השכיבו את העכבר שטוח על צדו כשהעין מכוונת כלפי מעלה.
3. הניחו את האצבע המורה והאגודל מעל ומתחת לעין, בהתאמה. הפעילו בעדינות לחץ על מבנה העצם המקיף את העין כדי לגרום לבליטה של גלגל העין.
4. הכנס את קצה המספריים הפתוחים מעט מתחת לעין וסובב בעדינות את פרק כף היד הרחק מהעין ב-90° עד שהעין תתנתק מהשקע.
   הערה: אין לסגור את המספריים כדי לחתוך את העין או את עצב הראייה, מכיוון שזה יקשה על דיסקציה של העין.
5. יש להניח מיד ולגלגל את העין באתנול 70% למשך לא יותר מ-5 שניות לפני העברתו למדיום חיץ לשטיפה השמור על קרח.
6. תחת מיקרוסקופ מנתח, מעבירים עין אחת בכל פעם לצלוחית פטרי מלאה בחיץ כביסה ורצועות גזה ספוגות.
7. לייצב את העין על ידי החזקת עצב הראייה עם פינצטה. יש לבצע בעדינות חתך בגובה האורה-סראטה באמצעות סכין כירורגית בקוטר 3.00 מ"מ 45° או סכין גילוח בגודל 0.009 אינץ'.
8. בעזרת מספריים של Vannas, מחדירים בעדינות את המספריים לתוך החתך וחותכים סביב היקף ה-ora serrata עד שניתן להסיר ולהשליך את המקטע הקדמי והזגוגית.
9. מקלפים בעדינות את הרשתית מהעין בעזרת מלקחיים קשורים, נזהרים שלא להפריע לשכבת ה-RPE.
   הערה: כדי להקל על הסרת הרשתית, מלאו פיפטת העברה במדיום חיץ לשטיפה ומרחו אותה בזהירות על קצוות העין כדי להרים בעדינות את הרשתית.
10. לבסוף, הסר את עצב הראייה ואת רקמת החיבור העודפת מהעין באמצעות מספריים. היזהר לא לנקב את העין.

3. בידוד RPE ראשוני

1. מעבירים את העין לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל המכיל 1 מ"ל של 0.25% טריפסין + 0.02% EDTA.
   הערה: ניתן להוסיף שתי כוסות עיניים לאליציטוט אחד של טריפסין-EDTA כדי להגדיל את התשואה של RPE הניתן לגידול.
2. מעבירים צינורות מיקרוצנטריפוגות לאמבט מים בטמפרטורה של 37°C ודגרים למשך 10 דקות. כל 2 דקות, הסר את הצינורות מאמבט המים והקש בחוזקה על תחתית הצינור 40 פעמים על השיש.
3. לאחר 10 דקות, יש לשבש בעדינות את העין באופן מכני באמצעות P1000 או צינור סרולוגי בנפח 2 מ"ל על ידי פיטום למעלה ולמטה לא יותר מ-3 פעמים.
   הערה: פיצול של יריעות RPE הוא חיוני מכיוון שגיליונות גדולים לא יידבקו כראוי.
4. נטרלו את הטריפסין באופן מיידי על ידי שכבות של יריעות RPE מנותקות, אך לא את העין, על 0.5 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS) בצינור חרוטי של 15 מ"ל.
5. יתר על כן, לדלל את טריפסין על ידי שכבות 3 מ"ל של מדיה RPE dropwise על שכבות של יריעות FBS ו- RPE.
6. צנטריפוגה את RPE ב 340 x גרם במשך 3 דקות.
7. השליכו את תאי הסופרנאטנט והשהו מחדש בכמות מתאימה של מדיית RPE עבור צלחת 24 בארות (1.9 ס"מ²/באר) או צלחת 48 בארות (0.75 ס"מ²/באר).
   הערה: ניתן לצפות RPE על לוחות היטב המצופים בחלבוני מטריצה חוץ-תאיים, במיוחד למינין, קולגן IV או פיברונקטין כדי להגביר את ההיצמדות¹¹. RPE יכול גם להיות מושעה מחדש ב 1 מ"ל של מדיה RPE ושכבות על שיפוע הפרדת צפיפות 40% כדי לבודד עוד יותר תאי RPE טהורים. בנוסף, סיבוב הצלחת במהירות של 340 x גרם למשך 3-5 דקות עשוי להגביר את היצמדות התאים¹³.
8. יש לדגור ב-37°C ב-5% CO₂.

4. טיפוח RPE

1. אין לשבש את RPE המבודד במשך 3 ימים לפחות. לאחר 72 שעות, הסירו בעדינות את המדיום הישן והחליפו אותו במדיה טרייה שחוממה מראש.
2. שנה את המדיום כל 48 שעות לאחר 3 הימים הראשונים.
3. ברגע שהתאים מגיעים למפגש, עוברים את התאים באמצעות 0.25% טריפסין + 0.02% EDTA ומפחיתים את ה-FBS במדיית RPE ל-2%.
   הערה: בעבר דווח כי RPE ראשוני יתחיל דה-דיפרנציאציה לאחר 5-7 מעברים ויתחיל לאבד את צורת המשושה והפיגמנטציה שלו¹⁴.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר שימש בעכברי רקע C57BL/6. נראה כי מגדר אינו משנה את היכולת לתרבות RPE. עכברים מתחת לגיל 6 שבועות מניבים יריעות RPE מוגבלות בהשוואה לעכברים מבוגרים, וייתכן שיהיה צורך ביותר עיניים כדי להגיע למפגש אופטימלי. לאחר הבידוד, לתאי RPE לוקח בערך 3 ימים להתייצב ולהתחבר לצלחת תרבית התא. כ-24 שעו?...

Discussion

במאמר זה, תיארנו פרוטוקול פשוט לבידוד ולתרבית של אפיתל פיגמנט רשתית מורין. תאי RPE שבודדו מעיניהם של עכברים בוגרים ביטאו סמן ספציפי ל-RPE, RPE65, וסמן צומת בין-תאי, ZO-1. בנוסף, התאים בתרבית התפתחו ליריעות פיגמנטיות משושות בתרבית.

מספר שיטות לבידוד RPE במכרסמים פורסמו בעבר

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.009 RD Single-Edge Blades	Personna	941202
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	10-013-CV	with 4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate
Fetal bovine serum	Corning	35010CV
GlutaMAX, 100x	Gibco	35050061
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14175095	no Calcium, no magnesium, no phenol red
HEPES Buffer Solution (1M)	Gibco	15630106
MEM Non-Essential Amino Acids, 100x	Gibco	11140050
Micro-Unitome Knife	BVI Beaver	377546
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x	Corning	30-002-CI
Polystyrene Microplates	Falcon	08-772-1	24-well or 48-well
Regular Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	with phenol red
Vannas scissors	Fine Science Tools	10091-12