Un metodo semplificato per l'isolamento e la coltura di cellule epiteliali pigmentate retiniche da topi adulti

Riepilogo

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) agisce come una barriera cruciale tra la coroide e la retina, promuovendo la salute e la funzione dei tipi di cellule retiniche, come i fotorecettori. In questo articolo, descriviamo un protocollo semplice ed efficace per isolare e coltivare l'EPR murino adulto.

Abstract

Le cellule epiteliali pigmentate retiniche (RPE) sono fondamentali per il corretto funzionamento della retina. La disfunzione dell'RPE è coinvolta nella patogenesi di importanti malattie della retina, come la degenerazione maculare legata all'età, la retinite pigmentosa e la retinopatia diabetica. Presentiamo un approccio semplificato per l'isolamento dell'RPE dagli occhi adulti murina. A differenza dei metodi precedentemente riportati, questo approccio consente l'isolamento e la coltura di RPE altamente puro da topi adulti. Questo metodo semplice e veloce non richiede grandi competenze tecniche ed è realizzabile con strumenti scientifici e reagenti di base. Gli RPE primari sono isolati da topi di fondo C57BL/6 di età compresa tra 3 e 14 settimane mediante enucleazione dell'occhio seguita dalla rimozione del segmento anteriore. La tripsinizzazione enzimatica e la centrifugazione vengono utilizzate per dissociare e isolare l'RPE dall'oculare. In conclusione, questo approccio offre un protocollo rapido ed efficace per l'utilizzo dell'RPE nello studio della funzione e della malattia retinica.

Introduzione

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è un monostrato cellulare specializzato che riveste la membrana di Bruch, situata tra i fotorecettori e la coroide¹. Le cellule RPE svolgono un ruolo fondamentale nel corretto funzionamento della retina. Le cellule RPE trasportano il glucosio e la vitamina A ai fotorecettori, promuovono la visione mediante la reisomerizzazione di all-trans retinal in 11-cis retinal e mantengono i segmenti esterni del fotorecettore attraverso la fagocitosi dei segmenti esterni eliminati, rimuovono l'acqua dallo spazio sottoretinico, formano la barriera emato-retinica esterna attraverso la presenza di giunzioni strette e secernono fattori di crescita neurotropici (come il fattore derivato dall'epitelio pigmentato, e fattore di crescita dei fibroblasti di base) che supportano i fotorecettori². La disfunzione delle cellule RPE è coinvolta nella patogenesi di varie retinopatie, tra cui la degenerazione maculare legata all'età, la retinite pigmentosa e la retinopatia diabetica ^3,4,5. Gli studi in vitro con cellule RPE sono fondamentali per migliorare la nostra comprensione della patogenesi di queste malattie. Le cellule RPE primarie sono di gran lunga preferite per questi studi poiché le linee cellulari RPE, sebbene prontamente disponibili, mancano delle caratteristiche chiave delle cellule RPE primarie.

Mentre varie specie sono state utilizzate come fonti di cellule primarie di RPE, i topi hanno il vantaggio di utilizzare le modificazioni genetiche per aiutare a comprendere la patogenesi delle retinopatie. I protocolli precedentemente descritti per isolare le cellule RPE dai roditori richiedono l'uso di animali neonatali, sono lunghi, richiedono abilità tecniche o non sono adatti per la coltura 6,7,8,9,10,11,12. Descriviamo un metodo semplice e veloce per isolare le cellule RPE da topi adulti che producono colture altamente pure di queste cellule.

Protocollo

L'uso di soggetti animali in questo studio è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Case Western Reserve University.

1. Preparazione dei reagenti

1. Preparare il mezzo tampone di lavaggio integrando la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS), senza calcio, senza magnesio, senza rosso fenolo con 10 mM di soluzione tampone HEPES. Conservare la soluzione a 4 °C fino al momento dell'uso.
2. Preparare il terreno RPE integrando il Medium Eagle's Modified di Dulbecco con 4,5 g/L di glucosio, 1,25x GlutaMAX Supplement (concentrazione madre 100x o 200 mM; concentrazione finale di 2,5 mM di L-glutammina), con il 10% di siero fetale bovino, l'1% di penicillina/streptomicina e 1x MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali (100x). Prima dell'uso, preriscaldare il fluido a 37 °C a bagnomaria.

2. Estrazione dell'occhio del topo

1. Eutanasia del topo, preferibilmente di età compresa tra 3 e 14 settimane, utilizzando un metodo di eutanasia approvato dall'IACUC (la lussazione cervicale in anestesia utilizzando un cocktail di ketamina/xilazina a 0,1 ml per 20 g di topo [87,5 mg/kg di ketamina e 12,5 mg/kg di xilazina] è stato il metodo utilizzato in questo studio).
   NOTA: Gli occhi raccolti da topi più giovani faciliteranno l'aumento della resa delle cellule epiteliali pigmentate retiniche nel tempo e estenderanno la capacità di passaggi successivi.
2. Appoggia il mouse su un lato con l'occhio orientato verso l'alto.
3. Posiziona rispettivamente l'indice e il pollice sopra e sotto l'occhio. Applicare delicatamente una pressione sulla struttura ossea che circonda l'occhio per indurre la sporgenza del bulbo oculare.
4. Inserire la punta delle forbici leggermente aperte sotto l'occhio e ruotare delicatamente il polso lontano dall'occhio di 90° fino a quando l'occhio non si stacca dall'orbita.
   NOTA: Non chiudere le forbici per tagliare l'occhio o il nervo ottico, poiché renderebbe più difficile la dissezione dell'oculare.
5. Posizionare e ruotare immediatamente l'occhiello in etanolo al 70% per non più di 5 secondi prima di trasferirlo in un mezzo tampone di lavaggio tenuto in ghiaccio.
6. Al microscopio da dissezione, trasferire un occhio alla volta in una capsula di Petri riempita con tampone di lavaggio e strisce di garza imbevuta.
7. Stabilizzare l'occhio tenendo il nervo ottico con una pinzetta. Praticare delicatamente un'incisione a livello dell'ora serrata utilizzando un coltello chirurgico da 3,00 mm a 45° o una lama di rasoio da 0,009".
8. Usando le forbici Vannas, inserisci delicatamente la forbice nell'incisione e taglia attorno alla circonferenza dell'ora serrata fino a quando il segmento anteriore e il vitreo possono essere rimossi e scartati.
9. Staccare delicatamente la retina dall'oculare utilizzando una pinza legata, facendo attenzione a non disturbare lo strato di RPE.
   NOTA: Per facilitare la rimozione della retina, riempire una pipetta di trasferimento con un mezzo tampone di lavaggio e applicarlo con cura sui bordi dell'oculare per sollevare delicatamente la retina.
10. Infine, rimuovere il nervo ottico e il tessuto connettivo in eccesso dall'oculare usando le forbici. Fare attenzione a non forare l'oculare.

3. Isolamento dell'RPE primario

1. Trasferire l'oculare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL contenente 1 mL di tripsina allo 0,25% + EDTA allo 0,02%.
   NOTA: È possibile aggiungere due conchiglie oculari a un'aliquota di tripsina-EDTA per aumentare la resa di RPE coltivabile.
2. Trasferire le provette per microcentrifuga in un bagno d'acqua a 37 °C e incubare per 10 minuti. Ogni 2 minuti, rimuovere i tubi dal bagnomaria e picchiettare con decisione il fondo del tubo 40 volte sul piano di lavoro.
3. Dopo 10 minuti, interrompere delicatamente l'oculare meccanicamente utilizzando una pipetta sierologica P1000 o da 2 mL pipettando su e giù non più di 3 volte.
   NOTA: La frammentazione dei fogli RPE è essenziale poiché i fogli di grandi dimensioni non aderiranno correttamente.
4. Neutralizzare immediatamente la tripsina sovrapponendo i fogli di RPE staccati, ma non l'oculare, su 0,5 mL di siero fetale bovino (FBS) in una provetta conica da 15 mL.
5. Inoltre, diluire la tripsina sovrapponendo 3 mL di terreno RPE goccia a goccia sugli strati di FBS e fogli RPE.
6. Centrifugare l'RPE a 340 x g per 3 min.
7. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in una quantità adeguata di terreno RPE per una piastra a 24 pozzetti (1,9 cm²/pozzetto) o una piastra a 48 pozzetti (0,75 cm²/pozzetto).
   NOTA: L'RPE può essere placcato su piastre a pozzetti rivestite con proteine della matrice extracellulare, in particolare laminina, collagene IV o fibronectina, per aumentare l'aderenza¹¹. L'RPE può anche essere risospeso in 1 mL di terreno RPE e stratificato su un gradiente di separazione di densità del 40% per isolare ulteriormente le cellule RPE pure. Inoltre, la rotazione della piastra a 340 x g per 3-5 minuti può aumentare l'adesione cellulare¹³.
8. Incubare a 37 °C al 5% di CO₂.

4. Coltura di RPE

1. Non interrompere l'RPE isolato per almeno 3 giorni. Dopo 72 ore, rimuovere delicatamente il vecchio mezzo e sostituirlo con un supporto fresco e preriscaldato.
2. Cambiare il supporto ogni 48 ore dopo i primi 3 giorni.
3. Una volta che le cellule raggiungono la confluenza, far passare le cellule utilizzando lo 0,25% di tripsina + 0,02% di EDTA e ridurre l'FBS nel terreno RPE al 2%.
   NOTA: In precedenza era stato riportato che l'RPE primaria iniziava la de-differenziazione dopo 5-7 passaggi e iniziava a perdere la sua forma esagonale e la pigmentazione¹⁴.

Risultati

Il protocollo descritto è stato utilizzato su topi di fondo C57BL/6. Il genere non sembra cambiare la capacità di coltivare l'EPR. I topi con meno di 6 settimane producono fogli di RPE limitati rispetto ai topi più anziani e potrebbero essere necessari più occhi per raggiungere la confluenza ottimale. Dopo l'isolamento, le cellule RPE impiegano circa 3 giorni per stabilizzarsi e attaccarsi alla piastra di coltura cellulare. Circa 24 ore dopo l'isolamento, le cellule rotonde e pigmentate che sembrano anucleate hanno i...

Discussione

In questo articolo, abbiamo delineato un protocollo semplificato per l'isolamento e la coltura dell'epitelio pigmentato retinico murino. Le cellule RPE isolate dagli occhi di topi adulti esprimevano un marcatore specifico per RPE, RPE65, e un marcatore di giunzione intercellulare, ZO-1. Inoltre, le cellule coltivate si sono sviluppate in fogli esagonali pigmentati in coltura.

Diversi metodi per l'isolamento dell'RPE nei roditori sono stati pubblicati in precedenza^<...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.009 RD Single-Edge Blades	Personna	941202
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	10-013-CV	with 4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate
Fetal bovine serum	Corning	35010CV
GlutaMAX, 100x	Gibco	35050061
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14175095	no Calcium, no magnesium, no phenol red
HEPES Buffer Solution (1M)	Gibco	15630106
MEM Non-Essential Amino Acids, 100x	Gibco	11140050
Micro-Unitome Knife	BVI Beaver	377546
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x	Corning	30-002-CI
Polystyrene Microplates	Falcon	08-772-1	24-well or 48-well
Regular Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	with phenol red
Vannas scissors	Fine Science Tools	10091-12