A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
يتم تقديم جهاز بسيط وغير مكلف وجديد لإجراء توليفات الببتيد ذات الطور الصلب في مفاعل ميكروويف تجاري.
يتم تقديم جهاز محلي الصنع لإجراء تخليق الببتيد في الطور الصلب (SPPS) ، بمساعدة تشعيع الميكروويف والتدفئة. على عكس أوعية تفاعل SPPS التقليدية ، التي تستنزف المذيبات والمنتجات الثانوية عبر فريت موجود في قاع الوعاء ، يستخدم الجهاز المقدم أنبوب تشتت الغاز تحت الفراغ لإزالة المذيبات والمنتجات الثانوية والكواشف الزائدة. يوفر أنبوب تشتت الغاز نفسه تحريض غاز النيتروجين لخرز SPPS أثناء خطوات تفاعل الاقتران وإزالة الحماية. يعد تسخين الميكروويف مفيدا لوصلات SPPS من المخلفات المعوقة بشكل استيري ، مثل حمض ألفا أمينويزوبوتيريك (Aib) ، وهو بقايا أحماض أمينية ألفا ، ثنائي ألفا. تم استخدام هذا الجهاز المصنوع منزليا لإعداد الببتيدات السباعية والأوستامرية التي تهيمن عليها بقايا Aib ، والتي من المعروف أنها يصعب إقرانها في ظل ظروف درجة حرارة الغرفة القياسية والكواشف. علاوة على ذلك ، فإن مفاعلات SPPS التجارية النموذجية مخصصة حصريا لتخليق SPPS مما يجعلها غير متاحة لغير مستخدمي SPPS. في المقابل ، يحافظ الجهاز المقدم على تعدد استخدامات مفاعل الميكروويف لتسريع الميكروويف التقليدي للتفاعلات الكيميائية ، حيث تتم إزالة الجهاز بشكل تافه من مفاعل الميكروويف التجاري.
أحدث إدخال ميريفيلد لتخليق الببتيد في الطور الصلب SPPS في الستينيات ثورة في الببتيد والتوليفات الكيميائية وتمت مكافأته بحق بجائزة نوبل في الكيمياء1،2. في العقود اللاحقة ، قام العديد من الباحثين بتحسين تقنيات ميريفيلد الأصلية ، مما أدى إلى بديلين يهيمنان على ممارسات SPPS: الفلورينيل ميثوكسي كربونيل (FMOC ) القائم على الفلورينيل ميثوكسي كربونيل (FMOC) مقابل ثلاثي بوتيل أوكسي كربونيل (BOC)3. يتطلب الانقسام النهائي للببتيد من الراتنج الصلب في FMOC كوكتيلا يحتوي على حمض ثلاثي فلور أسيتيك ، مقارنة بالحمض عالي الكثافة لتقنيات BOC ، مما يجعل الطرق القائمة على FMOC الخيار المفضل للعديد من المختبرات.
يتم أحيانا تحدي طرق SPPS الحديثة من خلال التسلسلات المرغوبة. في السنوات الأخيرة ، كان هناك تقدم في التغلب على بعض المخاوف الخاصة بالتجميع4 ، وتكوين diketopiperazine5 ، وبقايا الأحماض الأمينية N-methylated6. في محاولة لتحسين إنتاجية الاقتران ، تم استكشاف الآلاف من كواشف التوصيل والموادالمضافة 7. على وجه التحديد ، تم تطوير تنشيط حمض الكربوكسيل عبر COMU8،9 أو الفلورايد الحمضي10،11،12 ، جنبا إلى جنب مع المواد المضافة مثل Oxyma13 و hydroxybenzotriazole (HOBt) ، للوصلات الصعبة بشكل خاص مثل تلك التي تنطوي على بقايا ثنائية α ، α.
تم استخدام طرق أخرى غير قائمة على الكاشف لزيادة الغلة للوصلات الصعبة ، بما في ذلك أوقات التفاعل الممتدة ، و "الاقتران المزدوج" ، والتدفئة ، وخاصة تسخين الميكروويف14،15،16. في الواقع ، تعد أجهزة توليف الببتيد الآلية المتوفرة تجاريا والتي تستخدم تسخين الميكروويف من بين أكثر الوحدات نجاحا تجاريا في السوق لأنها تسرع معدلات التفاعل ، ويبدو أنها تحسن النقاء النهائي للببتيدات ، وتقلل من نفايات المذيبات. لسوء الحظ ، يمكن أن تكون هذه الوحدات باهظة الثمن ، حيث تكلف أكثر من 100,000 دولار في بعض الحالات.
يهتم مختبرنا بإعداد أشكال مختلفة من الببتيدات التي تحتوي على بقايا الهليكوجينيك القوية لحمض ألفا أمينوإيزوبوترييك (Aib) 17،18،19. نظرا للعائق الفراغي الناجم عن انفراد ألفا كربون ، من المعروف أن Aib يصعب الاقتران. تم استخدام الطرق المذكورة أعلاه (الفلورايد الحمضي ، تسخين الميكروويف20) ، بالإضافة إلى كيمياء SPPS الذكية "ثنائي الببتيد"21 ، لتكييف SPPS مع تحديات اقتران AIB. يتطلب تحضير ثنائيات Aib خارج الراتنج ، مع تحسين العائد الكلي ، كيمياء رطبة إضافية ودرجات حرارة مرتفعة (50 درجة مئوية)21. علاوة على ذلك ، فقد تجنبنا استخدام الفلورايدات الحمضية ل Aib بسبب الطبيعة السامة لعوامل الفلورة. لسوء الحظ ، يفتقر مختبرنا إلى مركب SPPS آلي مخصص قائم على الميكروويف ، مع أوعية تفاعل مخصصة للتصريف الضروري للمنتجات الثانوية SPPS. ومع ذلك ، فإن تقريرا حديثا من مجموعة Clayden أظهر نجاحا مذهلا في إعداد أوليغومرات قائمة على Aib باستخدام SPPS وإشعاع الميكروويف22 حفزنا على تكييف وحدة الميكروويف CEM Discover SP في مختبرنا لتوليفات SPPS.
قمنا أولا بالتحقيق في ملحق CEM المتاح تجاريا لتحويل مفاعل الميكروويف إلى وحدة SPPS / ميكروويف يدوية23. بصرف النظر عن التكلفة ، سيتطلب هذا الملحق التزام وحدة الميكروويف الخاصة بنا بنظام SPPS اليدوي فقط . لن يتمكن مستخدمو المختبرات الآخرون من الوصول إلى القدرات الممتازة لوحدة الموجات الصغرية. لذلك ، اعتبر تنفيذ الملحق التجاري غير مقبول في حالتنا.
بدلا من ذلك ، قمنا بتجميع جهاز ، من خلال مكونات غير مكلفة نسبيا ، لأداء SPPS بمساعدة الميكروويف على مقياس المليمول. يصف البروتوكول أدناه استخدام مكونات بسيطة وغير مكلفة نسبيا لتنفيذ SPPS يدويا بمساعدة الميكروويف.
1. تجميع الجهاز (الشكل 1)
ملاحظة: تم العثور على جميع مكونات تجميع الجهاز في جدول المواد.
2. تحضير الكواشف
3. تحضير راتنج الببتيد
4. إزالة FMOC
ملاحظة: تتوفر الراتنجات محملة مسبقا بمجموعة متنوعة من الأحماض الأمينية المحمية ب FMOC المحملة مسبقا كمخلفات C-terminal. لذلك ، عادة ما تكون إزالة FMOC هي الخطوة الأولى بعد تورم الراتنج.
5. اقتران الأحماض الأمينية FMOC
6. كرر دورات الببتيد SPPS
7. انقسام الببتيد
تظهر أمثلة على تسلسلات الببتيد المعدة بأجهزتنا في الشكل 2 والشكل 3. يلخص الجدول 1 الحلول ومعلمات الميكروويف والغسالات التي استخدمناها. يظهر تأكيد قياس الطيف الكتلي MALDI-TOF في الأشكال. كان الانتعاش الشامل لهذه الببتيدات أعلى من 80٪. ب...
يستدعي الجهاز المقدم هنا طريقة بسيطة وجديدة وغير مكلفة لإزالة المذيبات والكواشف الزائدة ومنتجات النفايات ، بالإضافة إلى إضافة تحريض غاز النيتروجين ، أثناء SPPS بمساعدة الميكروويف. على عكس أوعية SPPS التقليدية ، التي تستدعي فريت في قاع الوعاء ، يستدعي الجهاز المقدم أنبوب ت?...
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
يعرب المؤلفون عن امتنانهم لدعم منح INSPIRE من جامعة فيرفيلد ، ودعم قسم الكيمياء والكيمياء الحيوية في جامعة فيرفيلد ، ومساعدة الدكتورة دوروثي زوبسنسكي لخبرتها في إدارة المختبر. بالإضافة إلى ذلك ، يعرب المؤلفون عن امتنانهم للأساتذة جيليان سميث كاربنتر وآرون فان دايك للمناقشات المتعلقة بالببتيد والتخليق العضوي. يقدر المؤلفون دعم صندوق النشر التابع لكلية الآداب والعلوم بجامعة فيرفيلد.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CEM Discover SP Microwave Reactor | CEM | Discontinued. Recently replaced in the product line by the Discover 2.0 | |
Diisopropylcarbodiimide (DCC) | TCI America | ||
Dimethylformamide (DMF) | Thermo Scientific Chemicals | ||
Gas dispersion tube, micro, | Chemglass | CG-207-02 | medium porosity |
micro septum | ChemGlass | CG-3022-20 | "NMR tube" type septum |
Morpholine | Thermo Scientific Chemicals | ||
N-Fmoc-protected Amino acids | |||
Oyxma Pure | TCI America | ||
Side-arm Ehrlenmeyer flask | Assorted vendors | Waste collection | |
"Tee" | Idex | P-713 | ETFE |
teflon tubing 1/8", | Restek | 25306 | OD x 0.063" ID, 3 m |
Test tube (holder for reaction vessel external to microwave) | Assorted vendors | (30 x 175) | |
Test tube (reaction vessel) | Corning Glass | 9820-25X | Pyrex 25 x 200 mm, rimless |
Valve | Idex | P-721 | ETFE (2x) |
Wang SPPS Resin, 1% crosslinked divinylbenzene, 100-200 mesh | Advanced ChemTech |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved