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요약

상업용 마이크로파 반응기에서 고체상 펩타이드 합성을 수행하기 위한 간단하고 저렴하며 새로운 장치가 제시됩니다.

초록

마이크로파 조사 및 가열의 도움을 받아 고체상 펩타이드 합성(SPPS)을 수행하기 위해 집에서 제작한 장치가 제시됩니다. 용기 바닥에 위치한 프릿을 통해 용매와 부산물을 배출하는 기존의 SPPS 반응 용기와 달리, 제시된 장치는 용매, 부산물 및 과도한 시약을 제거하기 위해 진공 상태에서 가스 분산 튜브를 사용합니다. 동일한 가스 분산 튜브는 커플 링 및 탈보호의 반응 단계에서 SPPS 비드의 질소 가스 교반을 공급합니다. 마이크로파 가열은 알파, 알파 다이얼킬화 아미노산 잔류물인 알파-아미노이소부티르산(Aib)과 같은 입체 장애 잔류물의 SPPS 커플링에 유용합니다. 이 자체 제작 장치는 수동 Fmoc SPPS 방법을 통해 표준 실온 조건과 시약에서 결합하기 어려운 것으로 악명 높은 Aib 잔기에 의해 지배적인 헵타메릭 및 옥타메릭 펩타이드를 준비하는 데 사용되었습니다. 또한, 일반적인 상업용 마이크로파 SPPS 반응기는 SPPS 합성에만 전념하기 때문에 SPPS가 아닌 사용자가 접근할 수 없습니다. 대조적으로, 제시된 장치는 장치가 상업용 마이크로파 반응기에서 사소하게 제거되기 때문에 화학 반응의 기존 마이크로파 가속을 위한 마이크로파 반응기의 다양성을 보존합니다.

서문

1960년대에 Merrifield가 도입한 고체상 펩타이드 합성 SPPS는 펩타이드 및 화학 합성에 혁명을 일으켰으며 노벨 화학상 1,2호상을 수상했습니다. 그 후 수십 년 동안 많은 연구자들이 Merrifield의 독창적인 기술을 개선하여 SPPS 관행을 지배하는 두 가지 대안, 즉 플루오레닐메톡시카르보닐(FMOC) 기반 대 tert-부틸 옥시카르보닐(BOC) 기반3. FMOC에서 고체 수지의 펩타이드를 최종적으로 절단하려면 BOC 기술의 HF와 비교하여 트리플루오라세트산을 함유한 칵테일이 필요하므로 FMOC 기반 방법은 많은 실험실에서 선호되는 선택입니다.

최첨단 SPPS 방법은 때때로 원하는 염기서열에 의해 도전을 받습니다. 최근 몇 년 동안 응집체(aggregation)4, 디케토피페라진 형성(diketopiperazine formation)5, N-메틸화 아미노산 잔기(N-methylated amino acid residue)6에 대한 몇 가지 특이한 우려를 극복하는 발전이 있었습니다. 커플링 수율을 최적화하기 위한 노력의 일환으로 수천 개의 커플링 시약과 첨가제가 조사되었습니다7. 특히, COMU 8,9 또는 산성 플루오라이드10,11,12를 통한 카르복실산 활성화는 Oxyma13 및 하이드록시벤조트리아졸(HOBt)과 같은 첨가제와 함께 α,α-dialkylated residue와 같은 특히 까다로운 커플링을 위해 개발되었습니다.

다른 비시약 기반 방법은 확장된 반응 시간, "이중 커플링" 및 가열, 특히 마이크로파 가열을 포함하여 어려운 커플링에 대한 수율을 증가시키기 위해 사용되었습니다 14,15,16. 실제로, 마이크로파 가열을 사용하는 상업적으로 이용 가능한 자동 펩타이드 합성기는 반응 속도를 가속화하고 펩타이드의 최종 순도를 개선하며 용매 폐기물을 최소화하는 것으로 나타나기 때문에 시장에서 가장 상업적으로 성공적인 장치 중 하나입니다. 불행히도 이러한 장치는 비쌀 수 있으며 경우에 따라 $100,000 이상의 비용이 듭니다.

우리 실험실은 알파 - 아미노 이소 부트리산 (Aib) 17 , 18 , 19의 강한 helicogenic 잔류 물을 포함하는 펩티드의 변형을 준비하는 데 관심이 있습니다. 알파 카본의 다이얼킬화로 인해 발생하는 입체 장애로 인해 Aib는 결합이 어려운 것으로 악명이 높습니다. 위에서 언급한 방법(산성 불화물, 마이크로파 가열20)과 영리한 "디펩타이드" SPPS 화학21은 SPPS를 AIB의 커플링 문제에 적용하는 데 사용되었습니다. Aib 이량체의 수지 외 준비는 전체 수율을 개선하는 동시에 추가적인 습식 화학과 고온(50°C)21을 필요로 합니다. 더욱, 우리는 불소화 대리인의 유독한 성격 때문에 Aib의 산성 불화물을 사용하는 것을 피했습니다. 불행히도 우리 실험실에는 SPPS 부산물의 필수 배출을 위한 전용 반응 용기가 있는 전용 마이크로파 기반 자동 SPPS 합성기가 없습니다. 그럼에도 불구하고, SPPS와 마이크로파 조사22를 사용하여 AIB 기반 올리고머를 제조하는 데 놀라운 성공을 거둔 Clayden 그룹의 최근 보고서는 SPPS 합성을 위해 우리 실험실의 CEM Discover SP 마이크로파 장치를 조정하도록 자극했습니다.

우리는 먼저 마이크로파 반응기를 수동 SPPS/마이크로파 장치23으로 변환하기 위해 CEM의 상업적으로 이용 가능한 액세서리를 조사했습니다. 비용 외에도 이 액세서리는 수동 SPPS 에만 마이크로파 장치를 사용해야 합니다. 다른 실험실 사용자는 더 이상 마이크로파 장치의 뛰어난 기능에 액세스할 수 없습니다. 따라서 상업용 액세서리의 구현은 우리의 경우 허용되지 않는 것으로 간주되었습니다.

대신, 우리는 비교적 저렴한 구성 요소를 통해 밀리몰 규모에서 마이크로파 보조 SPPS를 수행하는 장치를 조립했습니다. 아래 프로토콜은 간단하고 비교적 저렴한 구성 요소를 사용하여 수동 마이크로파 지원 SPPS를 적용하는 방법을 설명합니다.

프로토콜

1. 장치 조립(그림 1)

알림: 장치 조립을 위한 모든 구성 요소는 재료 표에 나와 있습니다.

  1. 진공 배출구를 조립합니다.
    1. 2인치의 1/8" 테프론 튜브를 에틸렌 테트라플루오로에틸렌(ETFE)으로 만든 "티"(그림 1, "1"로 표시된 부품")의 오른쪽에 연결합니다.
    2. 1/8" 테프론 튜브를 ETFE로 만든 밸브(그림 1, "2"로 표시된 부품)에 연결합니다.
    3. 100cm의 테프론 튜브를 밸브의 반대쪽에 부착합니다(그림 1, "2"로 표시된 부품).
    4. 고무 코르크의 1/8" 구멍을 통해 이 튜브를 삽입하고 이 코르크를 사용하여 진공(하우스 또는 겸손한 펌프)에 연결된 측면 무장 삼각 플라스크(그림 1A, 부품 레이블이 "8")를 닫습니다.
  2. 질소 가스 주입구를 조립합니다.
    1. 2인치의 1/8" 테프론 튜브를 ETFE "Tee"의 왼쪽에 연결합니다(그림 1, "1"로 표시된 부품).
    2. 1/8" 테프론 튜브를 ETFE 밸브에 연결합니다(그림 1, "3"으로 표시된 부품).
    3. 100cm의 1/8" 테프론 튜브를 EFTE 밸브의 반대쪽에 부착합니다(그림 1, "3"으로 표시된 부품).
    4. 1/8" 테프론 튜브의 맨 끝을 고무 코르크에 끼우고 이 코르크를 사용하여 레귤레이터가 장착된 질소 실린더에 부착된 타이곤 튜브에 연결합니다(그림 1A, "7"로 표시된 부품).
    5. 레귤레이터의 니들 밸브를 닫은 상태에서 레귤레이터의 다이어프램 밸브를 사용하십시오(그림 1A, "7"로 표시된 부품). 5-10psi 압력을 달성합니다.
  3. 흡인기/버블러를 조립합니다.
    1. "티"(그림 1, "1"로 표시된 부품")의 줄기를 100cm 길이의 1/8" OD 테프론 튜브에 연결합니다.
    2. 이전에 바늘로 뚫린 마이크로 셉텀(그림 1, "6"으로 표시된 부품)을 통해 이 튜브를 삽입합니다.
    3. 튜브를 가스 분산 튜브에 완전히 삽입합니다. 마이크로 셉텀을 사용하여 가스 분산 튜브(그림 1, "4"로 표시된 부품)와 테프론 튜브 사이에 밀봉을 형성합니다.
    4. 가스 분산관을 시험관 반응 용기(그림 1, "5"로 표시된 부품)에 삽입하고 시험관을 마이크로파 반응기 외부에 있는 홀더( 그림 1B 참조)에 넣습니다.
      알림: 화학 반응 중에 시험관이 마이크로파 반응기에 삽입됩니다. 반응 용액 및 용매 세척을 추가하는 동안 시험관은 마이크로파 반응기 외부에 유지됩니다.
  4. 개방형 용기 감쇠기를 마이크로파 반응기에 부착합니다. 이제 장치를 사용할 준비가 되었습니다.

2. 시약 준비

  1. FMOC-아미노산 용액을 준비합니다. 0.100mmol 스케일의 경우 DMF에서 0.2M FMOC-AA-OH를 준비합니다. 각 커플링 사이클은 2.5mL의 아미노산 용액을 사용합니다.
  2. 디이소프로필카르보디이미드(DIC) 커플링 시약을 준비합니다. DMF에서 1.0M DIC를 준비합니다. 각 커플 링은 1.0mL의 DIC 용액을 사용합니다.
  3. Oxyma Pure 첨가제 용액을 준비합니다. DMF에서 0.5M 옥시마를 준비합니다. 각 커플링은 1.0mL의 옥시마 용액을 사용합니다.
  4. 탈보호 솔루션을 준비합니다. 20% v/v 모르폴린/DMF 용액을 준비합니다. 각 보호 해제 실행에는 7mL의 용액이 필요합니다. fmoc의 각 보호 해제에 대해 두 번의 보호 해제 실행을 수행합니다.

3. 펩타이드 수지의 제조

  1. SPPS Wang 수지, 100-200 메쉬, 1% 디비닐벤젠과 가교결합된 폴리스티렌의 적절한 질량을 측정하고 건조 수지를 시험관 반응 용기에 넣습니다. 예를 들어, 0.100mmol 규모의 합성의 경우 0.500mmol g-1 의 하중을 가진 수지에는 200mg의 수지가 필요합니다.
  2. 수지에 DMF 용매 3mL를 넣고 실온에서 15분 동안 수지를 팽창시킵니다. 이 단계에서는 교반을 위해 질소 가스 공급 장치가 "켜짐/개방"되어 있고 진공 밸브(그림 1, "2"로 표시됨)가 "꺼짐/닫힘"으로 되어 있는지 확인합니다. 질소 공급 장치의 니들 밸브(그림 1A, 7로 표시됨)를 사용하여 용액 내에서 부드러운 버블링을 달성합니다.
    알림: 이 설정은 질소 가스에 의한 모든 추가 교반에 적합해야 합니다.
  3. 수지를 15분 동안 팽창시킨 후 진공 상태에서 DMF 용매를 흡인합니다: N2 밸브를 닫습니다(그림 1, "3"으로 표시됨). 진공 밸브를 열고(그림 1, "2"로 표시됨) DMF 용매를 흡입합니다. 솔벤트가 거의 제거되면 N2 밸브를 엽니다(그림 1, "3"으로 표시됨).
  4. 3.2단계와 3.3단계를 2회 반복하여 수지를 완전히 팽창시킵니다.

4. FMOC 제거

참고: 수지에는 C 말단 잔기로 사전 로드된 다양한 FMOC 보호 아미노산이 사전 로드된 상태로 사용할 수 있습니다. 따라서 FMOC 제거는 일반적으로 수지를 팽창시킨 후 첫 번째 단계입니다.

  1. 마이크로파 반응기 외부의 시험관 반응 용기와 진공 밸브(그림 1, "2"로 표시)를 닫은 상태에서 7mL의 20% 피페리딘/DMF 또는 20% 모르폴린/DMF를 시험관에 직접 추가합니다.
  2. 질소 밸브(그림 1, "3"으로 표시됨)를 켜서 비드를 교반합니다.
    참고: SPPS 수지에는 FMOC로 보호되는 C 단자 잔류물이 미리 로드되어 있습니다.
  3. 비드가 들어있는 시험관을 "열린 용기" 감쇠기를 통해 마이크로파 반응기에 삽입합니다(그림 1B, 반응기의 금속 포트).
  4. 동적 모드에서 마이크로파를 사용하여 90°C까지 2분 동안 가열: 목표 온도를 90°C, 50W 전력, 유지 시간 = 2.0분으로 설정합니다(전자레인지 내 보호 해제에 대한 보고서는 보충 파일 1 참조). 마이크로파의 적외선 센서를 통해 온도를 모니터링하십시오. 마이크로파는 반응 온도를 유지하기 위해 전력을 줄입니다.
  5. 마이크로파 반응기에서 비드가 들어 있는 시험관을 제거합니다.
  6. 진공 상태에서 DMF 용액 및 반응 부산물 흡입: N2 밸브를 닫습니다(그림 1, "3"으로 표시됨). 진공을 위해 밸브를 엽니다(그림 1, "2"로 표시됨). 용액이 거의 제거되면 N2 밸브를 엽니다(그림 1, "3"으로 표시됨).
  7. 진공 밸브를 닫습니다(그림 1, "2"로 표시됨). DMF 3mL를 첨가하여 시험관과 기체 분산 튜브를 헹굽니다.
  8. 진공 상태에서 흡입 DMF 용매 세척: N2 밸브를 닫습니다(그림 1, "3"으로 표시됨). 진공을 위해 밸브를 엽니다(그림 1, "2"로 표시됨). 용액이 거의 제거되면 N2 밸브를 엽니다(그림 1, "3"으로 표시됨).
  9. 4.7단계와 4.8단계를 두 번 반복하여 DMF 용매로 총 세 번 세척합니다.
  10. FMOC 제거 단계 4.1-4.9를 반복하여 총 두 개의 연속 보호 해제 단계를 수행합니다.

5. FMOC 아미노산의 커플링

  1. 시험관 반응 용기를 마이크로파 반응기 외부의 홀더에 놓습니다.
  2. 시험관의 수지에 0.2M FMOC 아미노산 2.5mL(5x 몰 초과량), 1.0mL의 1.0M DIC 커플링제 용액(10배 몰 초과량) 및 0.5M 옥시마 첨가제 용액 1.0mL(5x 몰 초과량)를 수동으로 추가합니다.
  3. 질소 밸브(그림 1, "3"으로 표시됨)를 열어 비드를 교반합니다.
  4. 열린 용기 감쇠기를 통해 비드가 포함된 테스트 튜브를 마이크로파 반응기에 삽입합니다(그림 1B, 반응기의 금속 포트). 용액을 100°C로 10분 동안 가열합니다. 동적 모드에서 마이크로파를 사용하여 온도 목표를 100°C, 60W 전력, 유지 시간 = 10.0분으로 설정합니다(마이크로파 내 커플링에 대한 보고서는 보충 파일 1 참조). 마이크로파의 적외선 센서를 통해 온도를 모니터링하십시오. 마이크로파는 반응 온도를 유지하기 위해 전력을 줄입니다.
  5. 마이크로파 반응기에서 비드가 들어 있는 시험관을 제거합니다.
  6. 진공 상태에서 DMF 용매 및 반응 부산물을 흡입합니다: N2 밸브를 닫습니다(그림 1, "3"으로 표시됨). 진공을 위해 밸브를 엽니다(그림 1, "2"로 표시됨). 용액이 거의 제거되면 N2 밸브를 엽니다(그림 1, "3"으로 표시됨).
  7. 진공 밸브를 닫습니다(그림 1, "2"로 표시됨). DMF 3mL를 첨가하여 시험관과 기체 분산 튜브를 헹굽니다.
  8. 진공 상태에서 흡입 DMF 용매 세척: N2 밸브를 닫습니다(그림 1, "3"으로 표시됨). 진공을 위해 밸브를 엽니다(그림 1, "2"로 표시됨). 용액이 거의 제거되면 N2 밸브를 엽니다(그림 1, "3"으로 표시됨).
  9. 5.7단계와 5.8단계를 2회 반복하여 DMF 용매로 총 3회 세척합니다.

6. SPPS 펩타이드 사이클을 반복합니다.

  1. 원하는 염기서열의 펩타이드가 생성될 때까지 섹션 4(FMOC 제거) 및 5(FMOC 아미노산 결합)의 모든 단계를 반복합니다.
    참고: 마이크로파 반응기 외부의 시약 용액을 실온에서 시험관 반응 용기에 직접 첨가해야 합니다. 또한 시험관을 마이크로파 반응기에 넣기 전에 질소 교반이 시작되었는지 확인하십시오.

7. 펩타이드 분열

  1. 수지를 프릿 플라스틱 주사기에 옮깁니다.
  2. 95% 트리플루오로아세트산(TFA), 2.5% 물 및 2.5% 트리이소프로필 실란(TIPS)을 1mL/100mg 수지 부피로 분열 칵테일을 준비합니다.
  3. 펩타이드를 실온에서 2시간 동안 계속 또는 가끔 흔들어 쪼개십시오.
  4. 펩타이드 생성물을 얼음처럼 차가운 디에틸 에테르 10mL에 침전시킵니다.
  5. 펠릿을 최소량의 MeCN/0.1% 수성 TFA로 재현탁시키고 하룻밤 동안 동결건조합니다.

결과

당사 장치로 제조된 펩타이드 서열의 예는 그림 2 및 그림 3에 나와 있습니다. 표 1 은 솔루션, 마이크로파 매개변수 및 우리가 사용한 세척을 요약합니다. MALDI-TOF 질량 분석기 확인이 그림에 나와 있습니다. 이 펩티드의 대량 회수율은 80% 이상입니다. 의미심장하게도, 이러한 모든 염기서열은 인접한 알파, 알파-다?...

토론

여기에 제시된 장치는 마이크로파 보조 SPPS 동안 용매, 과잉 시약 및 폐기물을 제거하고 질소 가스 교반을 추가하는 간단하고 참신하며 저렴한 방법을 호출합니다. 용기 바닥에서 프릿(frit)을 발생시키는 기존의 SPPS 용기와 달리, 제시된 장치는 진공 상태에서 가스 분산 튜브를 호출하여 용기를 흡인합니다. 따라서 반응 용기는 일반 시험관이며, 마이크로파 반응기 제조업...

공개

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

저자들은 Fairfield University의 INSPIRE 보조금 지원, Fairfield University의 화학 및 생화학과의 지원, 실험실 관리에 대한 전문 지식을 갖춘 Dorothy Szobcynski 박사의 도움에 감사드립니다. 또한 저자는 펩타이드 및 유기 합성에 관한 논의를 해준 Jillian Smith-Carpenter 교수와 Aaron Van Dyke 교수에게 감사를 표합니다. 저자는 Fairfield University의 College of Arts & Sciences의 출판 기금의 지원에 감사드립니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
CEM Discover SP Microwave ReactorCEMDiscontinued.  Recently replaced in the product line by the Discover 2.0
Diisopropylcarbodiimide (DCC)TCI America
Dimethylformamide (DMF)Thermo Scientific Chemicals
Gas dispersion tube, micro, ChemglassCG-207-02medium porosity
micro septumChemGlassCG-3022-20"NMR tube" type septum
MorpholineThermo Scientific Chemicals
N-Fmoc-protected Amino acids
Oyxma PureTCI America
Side-arm Ehrlenmeyer flaskAssorted vendorsWaste collection
"Tee"IdexP-713ETFE
teflon tubing 1/8", Restek25306OD x 0.063" ID, 3 m
Test tube (holder for reaction vessel external to microwave) Assorted vendors(30 x 175)
Test tube (reaction vessel)Corning Glass9820-25XPyrex 25 x 200 mm, rimless 
ValveIdexP-721ETFE (2x)
Wang SPPS Resin, 1% crosslinked divinylbenzene, 100-200 meshAdvanced ChemTech

참고문헌

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