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  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Se presenta un aparato sencillo, barato y novedoso para realizar síntesis de péptidos en fase sólida en un reactor de microondas comercial.

Resumen

Se presenta un aparato casero para realizar la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS), asistida por irradiación y calentamiento por microondas. A diferencia de los recipientes de reacción SPPS convencionales, que drenan el solvente y los subproductos a través de una frita ubicada en la parte inferior del recipiente, el aparato presentado emplea un tubo de dispersión de gas al vacío para eliminar el solvente, los subproductos y el exceso de reactivos. El mismo tubo de dispersión de gas suministra la agitación de gas nitrógeno de las perlas SPPS durante las etapas de reacción de acoplamiento y desprotección. El calentamiento por microondas es beneficioso para los acoplamientos SPPS de residuos estéricamente obstaculizados, como el ácido alfa-aminoisobutírico (Aib), un residuo de aminoácidos alfa,alfa-dialquilados. Este aparato de fabricación casera se ha utilizado para preparar, mediante métodos manuales Fmoc SPPS, péptidos heptaméricos y octaméricos dominados por el residuo Aib, que es notoriamente difícil de acoplar en condiciones y reactivos estándar a temperatura ambiente. Además, los reactores SPPS comerciales típicos de microondas se dedican exclusivamente a la síntesis de SPPS, lo que los hace inaccesibles para los usuarios que no son de SPPS. Por el contrario, el aparato presentado conserva la versatilidad del reactor de microondas para la aceleración convencional de las reacciones químicas por microondas, ya que el aparato se retira trivialmente del reactor de microondas comercial.

Introducción

La introducción de Merrifield de la síntesis de péptidos en fase sólida SPPS en la década de 1960 revolucionó las síntesis de péptidos y químicos y fue justamente recompensada con un Premio Nobel de Química 1,2. En las décadas siguientes, muchos investigadores han refinado las técnicas originales de Merrifield, lo que ha llevado a dos alternativas que dominan las prácticas de SPPS: a base de fluorenilmetoxicarbonilo (FMOC) frente a terc-butil oxicarbonilo (BOC)3. La escisión final del péptido de la resina sólida en FMOC requiere un cóctel que contenga ácido trifluoracético, en comparación con HF para las técnicas de BOC, lo que hace que los métodos basados en FMOC sean la opción preferida de muchos laboratorios.

Los métodos SPPS de última generación se ven ocasionalmente desafiados por las secuencias deseadas. En los últimos años, ha habido avances que superan algunas preocupaciones idiosincrásicas de la agregación4, la formación de dicetopiperazina5 y los residuos de aminoácidos N-metilados6. En un esfuerzo por optimizar el rendimiento del acoplamiento, se han explorado miles de reactivos y aditivos de acoplamiento7. En concreto, se ha desarrollado la activación del ácido carboxílico a través de COMU 8,9 o fluoruros ácidos 10,11,12, junto con aditivos como Oxyma13 e hidroxibenzotriazol (HOBt), para acoplamientos especialmente difíciles, como los que implican residuos α,α-dialquilados.

Se han empleado otros métodos no basados en reactivos para aumentar los rendimientos de acoplamientos difíciles, incluidos los tiempos de reacción extendidos, el "doble acoplamiento" y el calentamiento, especialmente el calentamiento por microondas 14,15,16. De hecho, los sintetizadores de péptidos automatizados disponibles en el mercado que emplean calentamiento por microondas se encuentran entre las unidades de mayor éxito comercial en el mercado, ya que aceleran las velocidades de reacción, parecen mejorar la pureza final de los péptidos y minimizan el desperdicio de solventes. Desafortunadamente, estas unidades pueden ser costosas, costando más de $ 100,000 en algunos casos.

Nuestro laboratorio tiene interés en la preparación de variaciones de péptidos que contienen el residuo fuertemente helicogénico del ácido alfa-aminoisobutírico (Aib)17,18,19. Debido al obstáculo estérico que surge de la dialquilación de su alfa-carbono, el Aib es notoriamente difícil de acoplar. Los métodos mencionados anteriormente (fluoruros ácidos, calentamiento por microondas20), así como la inteligente química SPPS21 de "dipéptidos", se han utilizado para adaptar SPPS a los desafíos de acoplamiento de Aib. La preparación de dímeros Aib sin resina, al tiempo que mejora el rendimiento general, requiere química húmeda adicional y temperaturas elevadas (50 °C)21. Además, hemos evitado el empleo de fluoruros ácidos de Aib debido a la naturaleza tóxica de los agentes fluorantes. Desafortunadamente, nuestro laboratorio carece de un sintetizador SPPS automatizado basado en microondas, con recipientes de reacción dedicados para el drenaje necesario de los subproductos de SPPS. Sin embargo, un informe reciente del grupo de Clayden que muestra un éxito espectacular en la preparación de oligómeros basados en Aib utilizando SPPS e irradiación de microondas22 nos estimuló a adaptar la unidad de microondas CEM Discover SP de nuestro laboratorio para síntesis de SPPS.

Primero investigamos el accesorio disponible comercialmente de CEM para convertir el reactor de microondas en una unidad manual SPPS/microondas23. Aparte del costo, este accesorio requeriría el compromiso de nuestra unidad de microondas solo con SPPS manual. Otros usuarios del laboratorio ya no tendrían acceso a las excelentes capacidades de la unidad de microondas. Por lo tanto, la implementación del accesorio comercial se consideró inaceptable en nuestro caso.

En su lugar, ensamblamos, a través de componentes comparativamente baratos, un aparato para realizar SPPS asistido por microondas en la escala milimolar. El protocolo a continuación describe el uso de componentes simples y comparativamente económicos para efectuar SPPS manuales asistidos por microondas.

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Protocolo

1. Ensamble el aparato (Figura 1)

NOTA: Todos los componentes para el montaje del aparato se encuentran en la Tabla de Materiales.

  1. Ensamble la salida de vacío.
    1. Conecte 2" de tubo de teflón de 1/8" al lado derecho de la "Te" (Figura 1, Pieza etiquetada como "1") hecha de etileno tetrafluoroetileno (ETFE).
    2. Conecte el tubo de teflón de 1/8" a una válvula (Figura 1, Pieza etiquetada como "2") hecha de ETFE.
    3. Conecte 100 cm de tubo de teflón al otro lado de la válvula (Figura 1, Pieza etiquetada como "2").
    4. Inserte este tubo a través de la abertura de 1/8" de un corcho de goma y use este corcho para tapar un matraz Erlenmeyer de brazo lateral (Figura 1A, Pieza etiquetada como "8") conectado a la aspiradora (bomba doméstica o modesta).
  2. Ensamble la entrada de gas nitrógeno.
    1. Conecte 2" de tubo de teflón de 1/8" al lado izquierdo de la "Te" de ETFE (Figura 1, Pieza etiquetada como "1").
    2. Conecte el tubo de teflón de 1/8" a una válvula de ETFE (Figura 1, Pieza etiquetada como "3").
    3. Conecte 100 cm de tubo de teflón de 1/8" al otro lado de la válvula EFTE (Figura 1, pieza etiquetada como "3").
    4. Pase el extremo más alejado del tubo de teflón de 1/8" a través de un corcho de goma y use este corcho para conectarlo a un tubo tygon conectado a un cilindro de nitrógeno equipado con un regulador (Figura 1A, Pieza etiquetada como "7").
    5. Con la válvula de aguja del regulador cerrada, use la válvula de diafragma del regulador (Figura 1A, Parte etiquetada como "7"). para lograr una presión de 5-10 psi.
  3. Ensamble el aspirador/burbujeador.
    1. Conecte el vástago de la "Tee" (Figura 1, Pieza etiquetada como "1") a un tubo de teflón de 1/8" de diámetro exterior de 100 cm de longitud.
    2. Inserte este tubo a través de un microtabique (Figura 1, Parte etiquetada como "6") previamente perforado con una aguja.
    3. Inserte el tubo completamente en un tubo de dispersión de gas. Utilice el microtabique para formar un sello entre el tubo de dispersión de gas (Figura 1, Pieza etiquetada como "4") y el tubo de teflón.
    4. Inserte el tubo de dispersión de gas en el recipiente de reacción del tubo de ensayo (Figura 1, Parte etiquetada como "5") y coloque el tubo de ensayo en su soporte ( Figura 1B), que es externo al reactor de microondas.
      NOTA: Durante las reacciones químicas, el tubo de ensayo se insertará en el reactor de microondas. Durante la adición de soluciones de reacción y lavados con solventes, el tubo de ensayo se mantiene externo al reactor de microondas.
  4. Conecte el atenuador de recipiente abierto al reactor de microondas. El aparato debería estar listo para su uso.

2. Preparar los reactivos

  1. Prepare soluciones de aminoácidos FMOC. Para una escala de 0,100 mmol, prepare 0,2 M FMOC-AA-OH en DMF. Cada ciclo de acoplamiento utilizará 2,5 mL de las soluciones de aminoácidos.
  2. Prepare el reactivo de acoplamiento de diisopropilcarbodiimida (DIC). Prepare 1.0 M DIC en DMF. Cada acoplamiento utilizará 1,0 mL de solución DIC.
  3. Prepare la solución de aditivo Oxyma Pure. Preparar 0,5 M oxyma en DMF. Cada acoplamiento utilizará 1,0 mL de solución de oxyma.
  4. Prepare la solución de desprotección. Prepare una solución de morfolina/DMF al 20% v/v. Cada ciclo de desprotección requiere 7 mL de solución. Realice dos ejecuciones de desprotección por cada desprotección de fmoc.

3. Preparación de la resina peptídica

  1. Mida la masa adecuada de resina SPPS Wang, malla 100-200, poliestireno reticulado con 1% de divinilbenceno, y coloque la resina seca en el recipiente de reacción del tubo de ensayo. Por ejemplo, para una síntesis a escala de 0,100 mmol, una resina con una carga de 0,500 mmol g-1 requeriría 200 mg de resina.
  2. Añade 3 mL de disolvente DMF a la resina e hincha la resina a temperatura ambiente durante 15 min. Para este paso, asegúrese de que el suministro de gas nitrógeno esté "encendido/abierto" para la agitación, y que la válvula de vacío (Figura 1, etiquetada como "2") esté "apagada/cerrada". Utilice la válvula de aguja del suministro de nitrógeno (Figura 1A, etiquetada como 7) para lograr un suave burbujeo dentro de la solución.
    NOTA: Este ajuste debe ser apropiado para todas las agitaciones posteriores por el gas nitrógeno.
  3. Después de 15 minutos de hinchar la resina, aspire el solvente DMF al vacío: cierre la válvula N2 (Figura 1, etiquetada como "3"). Abra la válvula de vacío (Figura 1, etiquetada como "2") y aspire el solvente DMF. Cuando el solvente esté casi eliminado, abra la válvula N2 (Figura 1, etiquetada como "3").
  4. Repite los pasos 3.2 y 3.3 2 veces para hinchar completamente la resina.

4. Eliminación de FMOC

NOTA: Las resinas están disponibles precargadas con una variedad de aminoácidos protegidos por FMOC precargados como residuos C-terminales. Por lo tanto, la eliminación de FMOC suele ser el primer paso después de hinchar la resina.

  1. Con el recipiente de reacción del tubo de ensayo externo al reactor de microondas y la válvula de vacío (Figura 1, etiquetada como "2") cerrada, agregue 7 mL de piperidina al 20 % / DMF o 20 % de morfolina/DMF directamente en el tubo de ensayo.
  2. Abra la válvula de nitrógeno (Figura 1, etiquetada como "3") para agitar las perlas.
    NOTA: Las resinas SPPS están disponibles precargadas con el residuo C-terminal, protegidas por FMOC.
  3. Inserte el tubo de ensayo que contiene las perlas en el reactor de microondas a través del atenuador de "recipiente abierto" (Figura 1B, puerto metálico del reactor).
  4. Calentar a 90 °C durante 2 min utilizando el microondas en modo dinámico: ajuste el objetivo de temperatura a 90 °C, potencia de 50 W, tiempo de espera = 2,0 min (consulte el Archivo complementario 1 para obtener un informe sobre la desprotección dentro del microondas). Controle la temperatura a través del sensor infrarrojo del microondas; El microondas reducirá la potencia para mantener la temperatura de reacción.
  5. Retire el tubo de ensayo que contiene las perlas del reactor de microondas.
  6. Aspire la solución de DMF y los subproductos de reacción al vacío: cierre la válvula N2 (Figura 1, etiquetada como "3"). Abra la válvula para vacío (Figura 1, etiquetada como "2"). Cuando la solución esté casi retirada, abra la válvula N2 (Figura 1, etiquetada como "3").
  7. Cierre la válvula de vacío (Figura 1, etiquetada como "2"). Agregue 3 mL de DMF para enjuagar el tubo de ensayo y el tubo de dispersión de gas.
  8. Aspire el lavado con solvente DMF al vacío: cierre la válvula N2 (Figura 1, etiquetada como "3"). Abra la válvula para vacío (Figura 1, etiquetada como "2"). Cuando la solución esté casi retirada, abra la válvula N2 (Figura 1, etiquetada como "3").
  9. Repita los pasos 4.7 y 4.8 dos veces, para un total de tres lavados con disolvente DMF.
  10. Repita los pasos de eliminación de FMOC 4.1-4.9 para un total de dos pasos de desprotección sucesivos.

5. Acoplamiento de aminoácidos FMOC

  1. Coloque el recipiente de reacción del tubo de ensayo en su soporte externo al reactor de microondas.
  2. Agregue manualmente 2,5 mL de aminoácido FMOC 0,2 M (5 veces el exceso molar), 1,0 mL de solución de agente de acoplamiento DIC 1,0 M (10 veces el exceso molar) y 1,0 mL de solución de aditivo oxyma 0,5 M (5 veces el exceso molar) a la resina en el tubo de ensayo.
  3. Abra la válvula de nitrógeno (Figura 1, etiquetada como "3") para lograr la agitación de las perlas.
  4. Inserte el tubo de ensayo que contiene las perlas en el reactor de microondas a través del atenuador de recipiente abierto (Figura 1B, puerto metálico del reactor). Calentar la solución a 100 °C durante 10 min. Usando el microondas en modo dinámico, establezca el objetivo de temperatura en 100 °C, 60 W de potencia, tiempo de retención = 10.0 min (consulte el Archivo Suplementario 1 para obtener un informe sobre el acoplamiento dentro del microondas). Controle la temperatura a través del sensor infrarrojo del microondas; El microondas reducirá la potencia para mantener la temperatura de reacción.
  5. Retire el tubo de ensayo que contiene las perlas del reactor de microondas.
  6. Aspire el solvente DMF y los subproductos de reacción al vacío: cierre la válvula N2 (Figura 1, etiquetada como "3"). Abra la válvula para vacío (Figura 1, etiquetada como "2"). Cuando la solución esté casi retirada, abra la válvula N2 (Figura 1, etiquetada como "3").
  7. Cierre la válvula de vacío (Figura 1, etiquetada como "2"). Agregue 3 mL de DMF para enjuagar el tubo de ensayo y el tubo de dispersión de gas.
  8. Aspire el lavado con solvente DMF al vacío: cierre la válvula N2 (Figura 1, etiquetada como "3"). Abra la válvula para vacío (Figura 1, etiquetada como "2"). Cuando la solución esté casi retirada, abra la válvula N2 (Figura 1, etiquetada como "3").
  9. Repita los pasos 5.7 y 5.8 2 veces para un total de tres lavados con disolvente DMF.

6. Repetir los ciclos de péptidos SPPS

  1. Repita todos los pasos de las secciones 4 (Eliminación de FMOC) y 5 (Acoplamiento de aminoácidos FMOC) hasta obtener un péptido de la secuencia deseada.
    NOTA: Asegúrese de agregar soluciones reactivas fuera del reactor de microondas, a temperatura ambiente, directamente al recipiente de reacción del tubo de ensayo. También asegúrese de que se inicie la agitación de nitrógeno antes de colocar el tubo de ensayo en el reactor de microondas.

7. Escisión de péptidos

  1. Transfiere la resina a una jeringa de plástico fritada.
  2. Prepare un cóctel de escisión de 95% de ácido trifluoroacético (TFA), 2,5% de agua y 2,5% de triisopropilsilano (TIPS) a un volumen de 1 mL/100 mg de resina.
  3. Escindir el péptido durante 2 h a temperatura ambiente con agitación continua u ocasional.
  4. Precipitar el producto peptídico en 10 mL de éter dietílico helado.
  5. Vuelva a suspender el pellet en una cantidad mínima de MeCN/0,1% de TFA acuoso y liofilizar durante la noche.

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Resultados

En la Figura 2 y en la Figura 3 se muestran ejemplos de secuencias peptídicas preparadas con nuestro aparato. La Tabla 1 resume las soluciones, los parámetros de microondas y los lavados que empleamos. La confirmación de la espectrometría de masas MALDI-TOF se muestra en las figuras. La recuperación masiva de estos péptidos ha sido superior al 80%. Significativamente, todas estas secuencias tienen múltipl...

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Discusión

El aparato presentado aquí invoca un método simple, novedoso y económico para eliminar solventes, reactivos excesivos y productos de desecho, así como agregar agitación de gas nitrógeno, durante SPPS asistido por microondas. A diferencia de los recipientes SPPS convencionales, que invocan una frita en el fondo del recipiente, el aparato presentado invoca un tubo de dispersión de gas al vacío para aspirar el recipiente. Por lo tanto, el recipiente de reacción es un tubo de ensayo...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Los autores están agradecidos por el apoyo de las subvenciones INSPIRE de la Universidad de Fairfield, el apoyo del Departamento de Química y Bioquímica de la Universidad de Fairfield y la asistencia de la Dra. Dorothy Szobcynski por su experiencia en la gestión del laboratorio. Además, los autores agradecen a los profesores Jillian Smith-Carpenter y Aaron Van Dyke por las discusiones sobre la síntesis orgánica y de péptidos. Los autores agradecen el apoyo del Fondo de Publicaciones de la Facultad de Artes y Ciencias de la Universidad de Fairfield.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
CEM Discover SP Microwave ReactorCEMDiscontinued.  Recently replaced in the product line by the Discover 2.0
Diisopropylcarbodiimide (DCC)TCI America
Dimethylformamide (DMF)Thermo Scientific Chemicals
Gas dispersion tube, micro, ChemglassCG-207-02medium porosity
micro septumChemGlassCG-3022-20"NMR tube" type septum
MorpholineThermo Scientific Chemicals
N-Fmoc-protected Amino acids
Oyxma PureTCI America
Side-arm Ehrlenmeyer flaskAssorted vendorsWaste collection
"Tee"IdexP-713ETFE
teflon tubing 1/8", Restek25306OD x 0.063" ID, 3 m
Test tube (holder for reaction vessel external to microwave) Assorted vendors(30 x 175)
Test tube (reaction vessel)Corning Glass9820-25XPyrex 25 x 200 mm, rimless 
ValveIdexP-721ETFE (2x)
Wang SPPS Resin, 1% crosslinked divinylbenzene, 100-200 meshAdvanced ChemTech

Referencias

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