التصوير ثلاثي الأبعاد للأنسجة الأبهرية في تصلب الشرايين

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولات محسنة لإزالة الأنسجة لتصوير الشريان الأورطي الفأري في ثلاثة أبعاد (3D). نحدد أحدث الإجراءات للتلوين المناعي والتطهير البصري والتصوير بقصد تحديد القرب التشريحي للجهاز العصبي المحيطي مع لويحات تصلب الشرايين والعرض التراكمي في تصلب الشرايين.

Abstract

عززت الأبحاث الحديثة فهم تصلب الشرايين باعتباره مرضا التهابيا مزمنا ينطوي على جميع الطبقات الثلاث لجدار الشرايين ، بما في ذلك لوحة البطانة ، والوسائط ، والهجوم ، الذي يشكل طبقة النسيج الضام الخارجي للشرايين. اقترحت دراساتنا الحديثة أن الجهاز العصبي المحيطي يستخدم adventitia كقناة للوصول إلى جميع خلايا الأنسجة. وجدنا أيضا أن الجهاز العصبي المحيطي ، أي الجهاز العصبي الحسي والودي ، يخضع لعمليات إعادة تشكيل رئيسية تنطوي على تكوين جديد للشبكات المحورية المجاورة لويحات تصلب الشرايين. في هذا السياق ، فإن فهم بنية الشبكة العصبية وتفاعلاتها مع مكونات الأوعية الدموية للشرايين المريضة يحمل وعودا كبيرة لفهم أفضل للتسبب في أمراض القلب والأوعية الدموية. لتحقيق هذه الأهداف ، هناك حاجة إلى طرق لتصور البنية الخلوية تحت الخلوية للشرايين السليمة والمريضة جنبا إلى جنب مع المقصورات المحيطة بالأوعية الدموية. يسمح تطهير الأنسجة بتصوير الأنسجة العميقة السليمة لأجزاء الأنسجة الكبيرة التي يتعذر الوصول إليها. يسمح بالتصوير الحجمي للشرايين السليمة من خلال دمج أدوات وضع العلامات والمسح والتصوير المجهري المتقدم ومعالجة الصور. هنا ، نصف طريقتين متميزتين ولكنهما تكميلين لإزالة الأنسجة السلبية ، وهما تطهير 2 ، 2-ثيوديثانول (TDE) القائم على الماء والتصوير ثلاثي الأبعاد القائم على الملصقات المناعية القائمة على المذيبات لإزالة الأعضاء المطهرة بالمذيبات (iDISCO) لتصوير أجزاء الأبهر المعزولة أو الشريان الأورطي الكامل في الموقع في الفأر بأكمله.

Introduction

توفر التقنيات النسيجية فهما أساسيا للعينات البيولوجية من خلال تقسيم الأنسجة / الأعضاء. ومع ذلك ، فإن تحديد تفاعلات الخلايا / الخلية التشريحية المعقدة والأنسجة / الأنسجة في ثلاثة أبعاد (3D) كان - حتى وقت قريب - من الصعب تحقيقه. كانت هذه الحاجة غير الملباة واضحة بشكل خاص في سياق نظام القلب والأوعية الدموية في الظروف الصحية والمريضة. كان تصوير الأنسجة السليمة أمرا صعبا في الماضي بسبب امتصاص الضوء وتشتت الضوء ، مما يجعلها معتمة في جوهرها. يجعل إزالة الأنسجة العينة البيولوجية السليمة شفافة عن طريق تقليل هذه القيود. تتيح التطورات الحديثة في تقنيات تطهير الأنسجة التصوير ثلاثي الأبعاد عالي الدقة للأنسجة الشفافة غير المقسمة لتوفير نظرة ثاقبة كبيرة على البنية الدقيقة الخلوية والهيكلية للأعضاء بأكملها بدقة ميكرومتر ، وبالتالي تمكين تعريف شبكات الاتصال التشريحية.

يتضمن تصلب الشرايين ثلاث طبقات من جدار الشرايين ، بما في ذلك طبقة البطى الداخلية ، وطبقة الوسائط الوسطى ، وطبقة النسيج الضام الخارجية ، والتي تسمى Adventitia. كانت لويحات تصلب الشرايين في الطبقة الداخلية للشرايين هدفا تقليديا للبحث لعقود^1،2. ومع ذلك ، تحتوي طبقة adventitia على أوعية دموية وأوعية ليمفاوية وألياف عصبية للجهاز العصبي المحيطي. علاوة على ذلك ، ترتبط الأدفنتيتشيا بالأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية ومكونات الأنسجة العصبية ، بما في ذلك الأعصاب الطرفية والعقد المحيطة بالأوعية^{الدموية 3،4}. من المعروف أن الأعصاب الطرفية تستخدم adventitia كقنوات للوصول إلى الأنسجة المستهدفة البعيدة ، وفي الواقع ، الخلايا⁵. عززت دراساتنا الحديثة التقدم في فهم التفاعلات متعددة الطبقات للأنظمة البيولوجية الرئيسية ، والتي تشمل الجهاز المناعي والجهاز العصبي والجهاز القلبي الوعائي. لقد أطلقنا على هذه التفاعلات الواجهات العصبية المناعية والقلب والأوعية الدموية^6،7. أثناء تصلب الشرايين ، تخضع مكونات جدار الشرايين لإعادة هيكلة وإعادة تشكيل قوية. على سبيل المثال ، بجوار تطور لويحات تصلب الشرايين في البطانة ، تتشكل مجاميع الخلايا المناعية ، ويحدث تكوين المحور العصبي العصبي في المجيء الأبهري^{الفأري 6،8،9}. مع تقدم تصلب الشرايين ، تتطور مجاميع الخلايا المناعية إلى أعضاء ليمفاوية شريانية ثلاثية جيدة التنظيم (ATLOs) مع خلايا تائية مميزة وخلايا بائية وخلايا بلازما¹⁰. ومع ذلك ، لتحديد هذه التغييرات في 3D ، كان التصوير عالي الدقة للأنسجة السليمة يمثل تحديا بسبب عدم كفاية نفاذية الغشاء وتشتت الضوء المتأصل¹¹. تغلبت مناهج تطهير الأنسجة على القيود الرئيسية لنهج الأنسجة^{التقليدية 11،12،13،14،15} مع تغلغل معزز للأجسام المضادة للوصول إلى عمق الأنسجة أو الأعضاء السليمة عن طريق ضبط معامل الانكسار (RI) بشكل موحد ، مما يؤدي إلى صور بدقة مقياس ميكرومتر مع عمق تصوير أعلى في فوكسل. يمكن مطابقة RIs للعينات إما مع الجلسرين (RI 1.46) أو زيت الغمر (RI 1.52) ، مما يقلل بشكل كبير من تشتت الضوء والانحرافات الكروية ، مما يتيح دقة عالية. سمحت التطورات الحديثة في تقنيات تطهير أنسجة الجسم بالكامل أو العضو بأكمله ، مثل 2،2-ثيوديثانول (TDE) المائي والتصوير ثلاثي الأبعاد للأعضاء المنظوفة بالمذيبات (iDISCO) ، على التوالي ، جنبا إلى جنب مع تقنيات التصوير الحجمي (بما في ذلك التصوير المجهري الكونفوكي والمتعدد الفوتون والصفائح الضوئية) بإعادة بناء التشريح المجهري لبنية الأوعية الدموية من خلال بناء أطلس الاتصال^11،16. يمكن أن يوفر تصور هذه الروابط الخلوية والهيكلية في 3D رؤى جديدة للإجابة على الأسئلة البيولوجية التي لم تتم الإجابة عليها حتى الآن.

Protocol

أجريت هذه الدراسة وفقا لإرشادات اللجنة المحلية والوطنية لاستخدام ورعايتها. تم استخدام الفئران الذكور فرط الشحوم على خلفية C57BL / 6J التي تم الحفاظ عليها على نظام غذائي قياسي للقوارض تتطور تلقائيا إلى تصلب الشرايين أثناء الشيخوخة في هذه الدراسة.

1. التصوير الكامل للشريان الأورطي المعزول وإزالة TDE

1. تحضير الأنسجة
   1. تحضير المخدر بجرعة 150 ملغم/كغ من الكيتامين و30 ملغم/كغ من الزيلازين (انظر جدول المواد) لكل فأر. تخدير الفئران بعمق عن طريق الحقن داخل الصفاق وتأكيد ذلك من خلال عدم وجود رد فعل على اختبار الألم العميق.
      ملاحظة: تركيز وحجم الحقن على النحو التالي: الكيتامين 100 مجم / مل. زيلازين 20 مجم / مل ؛ حجم الحقن 50:50 خليط من الكيتامين والزيلازين بمعدل 3 ميكرولتر / جم.
   2. ضع الماوس على صفيحة رغوية مغطاة بمناشف ورقية جراحية ، وقم بتثبيت الذراعين والساقين في وضع ضعيف باستخدام الأشرطة. تطهير الصدر بالإيثانول بنسبة 75٪ (انظر جدول المواد) وأخذ الدم عبر البطين الأيسر باستخدام حقنة 1 مل يمكن التخلص منها لإزالة الدم لتحسين التروية.
      ملاحظة: يمكن أيضا استخدام جمع الدم القلبي عن طريق بضع الصدر.
   3. قم بعمل شق خط الوسط على الصدر لكشف القلب وشق صغير في الأذين الأيمن للسماح بالتروية عبر القلب. قم بنشر الفأر عبر البطين الأيسر ب 10 مل من 5 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA ؛ انظر جدول المواد) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لمدة 5 دقائق ، متبوعا ب 20 مل من PBS لمدة 5-10 دقائق حتى يتم طرد الدم. أخيرا ، قم بتناول 10 مل من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 20 دقيقة.
      ملاحظة: يمكن تنفيذ جميع الإجراءات باستخدام مضخة التروية التمعجية بضغط 100-125 مم زئبق في درجة حرارة الغرفة (RT). يتم إدخال إبرة التروية في قلب الفأر من خلال نفس الثقب مثل استخراج الدم.
   4. إزالة الأعضاء الداخلية ، بما في ذلك الطحال والكبد والرئة والجهاز الهضمي والتناسلي باستخدام الأدوات الجراحية. حافظ على القلب والشريان الأورطي والكلى سليمة في الموقع.
      ملاحظة: الأدوات الجراحية المستخدمة في تشريح الأعضاء وإزالتها هي مقص التشريح ، ومقص القزحية الناعم ، والمقص الزنبركي ، والملقط الحاد ، والملقط المنحني ، والملقط الدقيق المنحني.
   5. كشف الشريان الأورطي بالكامل من الشريان الأورطي الصاعد إلى التشعب الحرقفي تحت المجهر المجهري التشريح (تكبير 30-40x). قم بإزالة الغدة الصعترية والأنسجة الدهنية بعناية دون إصابة الشريان الأورطي.
      ملاحظة: احرص على عدم قطع الشريان الأورطي. بالنسبة للفئران ^Apoe-/- ، احتفظ بالحد الأدنى من الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية في الشريان الأورطي للهيكل المتصل.
   6. احصد الشريان الأورطي بأكمله في طبق بتري مليء ب PBS. افصل الشريان الأورطي إلى أجزاء مختلفة وقسم الشريان الأورطي بالكامل طوليا باستخدام قزحية أو مقص زنبركي لفضح السطح الحميمي باتباع التسلسل والاتجاه الموضح في الشكل 1 أ لإزالة TDE.
   7. قم بتثبيت الشريان الأورطي على صفيحة الشمع الأسود المسطحة على شكل حرف Y ، كما هو موضح في الشكل 1 أ. قم بتثبيته في 4٪ PFA طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: قم بتثبيت الشريان الأورطي على لوح الشمع قبل التثبيت لتجنب الطي والتجعيد في الخطوات التالية.
   8. قم بفك تثبيت الشريان الأورطي ونقله إلى PBS. اغسل الشريان الأورطي جيدا لمدة 5 دقائق لمدة 5 مرات.
      ملاحظة: انقل الشريان الأورطي إلى أنابيب مختلفة مملوءة ب PBS في كل مرة للغسيل.
2. تلطيخ الأجسام المضادة للشريان الأورطي في الوجه
   ملاحظة: يتم تنفيذ جميع خطوات الحضانة في أنابيب قفل آمن سعة 2 مل مع دوران أو اهتزاز لطيف عند RT.
   1. انقل الشريان الأورطي الثابت إلى محلول مانع لمدة 2 ساعة للحجب والنفاذية.
      ملاحظة: يختلف محلول الحجب بناء على الأجسام المضادة الأولية والثانوية. على سبيل المثال ، محلول الحبس: 0.5 مجم / مل CD16 / 32 (1: 100) ، مصل حمار عادي 10٪ ، 2٪ Triton X-100 في PBS (انظر جدول المواد)
   2. احتضان الشريان الأورطي بالأجسام المضادة الأولية في محلول الحجب أعلاه (الخطوة 1.2.1) ، على سبيل المثال ، CD3e (تخفيف 1: 100) ، NF200 (تخفيف 1: 200) ، و B220 (تخفيف 1: 200) لمدة 24 ساعة (انظر جدول المواد). اغسل الشريان الأورطي في PBS لمدة 5 دقائق لمدة 5 مرات.
   3. احتضان الشريان الأورطي بالأجسام المضادة الثانوية في مصل الحمار العادي بنسبة 10٪ (تخفيف 1: 300) و 4'،6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ؛ 1 مجم / مل) للتلوين النووي بين عشية وضحاها (انظر جدول المواد). اغسل الشريان الأورطي في PBS لمدة 5 دقائق 5 مرات وقم بتخزين الشريان الأورطي في PBS عند 4 درجات مئوية حتى إجراء إزالة الأنسجة.
      ملاحظة: انقل الشريان الأورطي إلى أنابيب مختلفة مملوءة ب PBS في كل مرة للغسيل. قم بتغطية الأنابيب بورق الألمنيوم لإبقائها في الظلام للخطوة 1.2.3.
3. إزالة أنسجة TDE
   ملاحظة: يتم تنفيذ جميع خطوات الحضانة في أنابيب قفل آمن سعة 2 مل ، تدور برفق عند RT ، ومغطاة بورق الألمنيوم في الظلام. حلول العمل TDE (انظر جدول المواد) شديدة الاختراق ويجب التعامل معها بعناية في غطاء الدخان. جمع النفايات والتخلص منها وفقا للوائح المحلية.
   1. انقل الشريان الأورطي الملون إلى محاليل عمل TDE بنسبة 20٪ واحتضانه لمدة 1 ساعة.
   2. انقل الشريان الأورطي إلى حلول عمل TDE بنسبة 47٪ واحتضانها لمدة 12 ساعة. انقل الشريان الأورطي إلى 60٪ من حلول عمل TDE واحتضانها لمدة 24-36 ساعة حتى تصبح العينات شفافة في الضوء المرئي لتتناسب مع RI.
   3. قم بتخزين الشريان الأورطي في 60٪ TDE في RT في الظلام حتى التصوير.
      ملاحظة: قم بتحديث حلول العمل كل 30 دقيقة على المدى القصير من الحضانة (على سبيل المثال ، الخطوة 1.3.1) وكل 4 ساعات للحضانة على المدى الطويل (على سبيل المثال ، الخطوة 1.3.2). يمكن تعديل وقت الحضانة لكل خطوة اعتمادا على حجم الأنسجة للحصول على اختراق أفضل للأجسام المضادة أو شفافية الشفافية. بالنسبة للشريان الأورطي ^الفأر المحاط بأنسجة دهنية ، يجب تمديد وقت الحضانة بشكل مناسب.
4. تصوير الشريان الأورطي المزهر TDE باستخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر (CLSM)
   1. استخدم آبار فاصل التصوير المستطيلة اللاصقة على الوجهين المتوفرة تجاريا بسمك 0.2 مم (انظر جدول المواد). ألصق البئر بشريحة زجاجية نظيفة وانقل الشريان الأورطي الذي تم تطهيره. تأكد من أن adventitia الأبهري في الوجه يواجه الغطاء.
      ملاحظة: اضغط برفق على الشريان الأورطي المقطع مع الجانب العظمي من الشريان الأورطي في الأعلى باستخدام ملقط بزاوية. قم بتكديس آبار فاصل التصوير المتعددة لتتناسب مع حجم الأنسجة إذا لزم الأمر.
   2. قم بتركيب الشريان الأورطي بقطرات من محلول TDE بنسبة 60٪. قم بتوصيل غطاء بعناية بالبئر ، وتجنب فقاعات الهواء بين العينة والغطاء.
      ملاحظة: قم بإزالة الفقاعات بعناية بإبرة قبل الغطاء. لا تستخدم كمية زائدة من محلول التركيب ، حيث قد تطفو العينة.
   3. استخدم أداة CLSM مقلوبة (انظر جدول المواد) مزودة بأهداف غمر 20x (متعددة) (NA: 0.75).
      ملاحظة: يسمح CLSM بالتصوير الحجمي حتى عمق 70 ميكرومتر بدقة أعلى ، وهو أمر ضروري لتحليل قطر العصب وتفاعل الخلايا العصبية المناعية في الهجوم الأبهري.
   4. حدد هدف الغمر 20x/0.75 (الزيت). قم بضبط أجهزة الكشف عن الصمام الثنائي الهجين بناء على الأصباغ الملطخة. اضبط إعدادات العرض وحدد تنسيق XY 1024 × 1024 بكسل للتصوير.
      ملاحظة: تلتقط العدسة الموضوعية الغاطسة بالزيت إشارات أفضل من الماء.
   5. قم بإسقاط زيت الغمر (مع الجلسرين) بالتساوي على طول الشريان الأورطي على الغطاء. حرك الهدف 63x بشكل خشن نحو العينة حتى تلامس زيت الغمر / الغطاء.
   6. حرك هدف 63x بدقة تحت المجهر لتحديد منطقة الاهتمام. احصل على Z-stack من الجانب العرضي من الشريان الأورطي en الوجه عند حجم خطوة 2-4 ميكرومتر حتى عمق 60 ميكرومتر للتصوير ثلاثي الأبعاد.
   7. قم بتسمية الملف بتفاصيل العينة ومسح التفاصيل ضوئيا وحفظ البيانات.
5. تصوير الشريان الأورطي المزيل TDE باستخدام مجهر متعدد الفوتون
   1. اتبع الخطوات 1.4.1-1.4.2 لتركيب الشريان الأورطي على الشريحة.
   2. استخدم مجهرا متعدد الفوتون عموديا (انظر جدول المواد) مزودا بهدف 20x (الغمر في الماء ، NA: 1.00 ، مسافة العمل = 2 مم) ، مما يسمح بالتصوير الحجمي بعمق يصل إلى 1.5 مم.
   3. احصل على مداخن Z من الجانب العظمي بحجم خطوة 10-15 ميكرومتر حتى عمق 700 ميكرومتر. قم بتسمية الملف وحفظ البيانات كما في الخطوة 1.4.7.

2. تلطيخ مناعي لكامل الجسم وإزالة أنسجة iDISCO

1. تحضير الأنسجة
   1. اتبع الخطوات 1.1.1-1.1.3 أعلاه للتخدير وتثبيت الفأر والتروية.
   2. إزالة الجلد والأعضاء الداخلية ، بما في ذلك الطحال والكبد والرئة والجهاز الهضمي والتناسلي باستخدام الأدوات الجراحية. حافظ على القلب والشريان الأورطي والكلى سليمة في الموقع.
   3. قم بتشريح جزء الجسم فوق مستوى الحجاب الحاجز وقم بإصلاح الجزء السفلي من الجسم بنسبة 4٪ PFA لمدة 1-2 أيام (أيام) عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: قم بإجراء التثبيت والغسيل والحضانات في أنابيب سعة 50 مل على شاكر دوار برفق. قم بتحديث المحلول في أنابيب جديدة لمدة 2-3 مرات.
   4. اغسل العينة جيدا لمدة 10 دقائق 3 مرات في RT.
      ملاحظة: انقل الشريان الأورطي إلى أنابيب مختلفة مملوءة ب PBS في كل مرة.
   5. احتضان العينة في 20٪ من كوكتيلات تصوير الدماغ / الجسم الشفافة ودون عائق ومحلول التحليل الحسابي (CUBIC) لمدة 48 ساعة لإزالة اللون.
      ملاحظة: للحصول على محلول مكعب بنسبة 20٪ ، قم بإذابة 25 جم من اليوريا في 15 مل من Triton X-100 و 28 مل من Quadrol ، وأضف PBS إلى الحجم النهائي البالغ 100 مل. قم بإعداده في الغطاء لأن المكونات محفزة (انظر جدول المواد).
   6. اغسل العينة جيدا لمدة 1 ساعة خمس مرات في PBS في RT.
2. تلطيخ الأجسام المضادة
   ملاحظة: يتم تنفيذ جميع خطوات الحضانة في أنابيب قفل آمن سعة 50 مل مع دوران أو اهتزاز لطيف عند 4 درجات مئوية.
   1. احتضان العينة في محلول مصل PBS-gellatin-Triton X-100-serum (PGST) طوال الليل من أجل النفاذية والانسداد.
      ملاحظة: يختلف محلول الحجب بناء على الأجسام المضادة. على سبيل المثال ، محلول الحظر: PBS-gelatin-Triton X-100-serum (PGST ، انظر جدول المواد) محلول: 0.2٪ جيلاتين جلد الخنازير ، 0.5٪ تريتون X-100 ، و 5٪ مصل الماعز في PBS.
   2. احتضان العينة بالأجسام المضادة الأولية في محلول PGST ، على سبيل المثال ، NF200 (تخفيف 1: 200 ، انظر جدول المواد) عند 4 درجات مئوية ، ورجها برفق لمدة 10-12 يوما. ثم اغسل العينة جيدا في PGST لمدة 1 ساعة 5 مرات في RT.
   3. احتضان العينة بمحلول الأجسام المضادة الثانوية (1: 300 مخفف) و DAPI (1 مجم / مل) في PGST عند 4 درجات مئوية لمدة 7 أيام.
   4. اغسل العينة جيدا في PGST لمدة 1 ساعة 5 مرات في RT. انقل العينة إلى PBS وقم بتخزين الشريان الأورطي في PBS عند 4 درجات مئوية لمزيد من الخطوات.
      ملاحظة: قم بتغطية الأنابيب بورق الألمنيوم لإبقائها مظلمة للخطوات 2.2.3-2.2.4.
3. مقاصة أنسجة iDISCO المعدلة
   ملاحظة: أثناء المقاصة ، يجب تغطية الأنابيب بورق الألمنيوم لتجنب تبييض / تبريد الإشارة بسبب التعرض المباشر للضوء الطبيعي / الاصطناعي. جميع الكواشف العضوية المستخدمة في إزالة الديسكو ضارة ، ويجب أن تتم جميع خطوات التنظيف في غطاء الدخان. ارتد معطف مختبر وقفازات وقناع عند التعامل مع الكواشف لتجنب الاستنشاق والتلامس مع الجلد والعينين. اجمع نفايات الإزالة وتفريغها في حاويات النفايات المناسبة في غطاء المحرك.
   1. نقل العينات الملطخة من الخطوة 2.2.4 إلى سلسلة من التركيزات المتزايدة من محاليل عمل رباعي هيدروفوران (THF ، انظر جدول المواد) للجفاف ، أي 50٪ و 70٪ و 90٪ و 100٪ (مرتين في 100٪). احتضان لمدة 12 ساعة لكل تركيز.
      ملاحظة: قم بتخفيف كاشف THF (99٪ -100٪) في الماء المقطر لمحاليل العمل بتركيزات مختلفة في الغطاء. تحديث حلول العمل كل 6 ساعات.
   2. انقل العينة إلى محلول ثنائي كلورو ميثان المطلق (DCM ، انظر جدول المواد) لمدة 3 ساعات لإزالة الدهون.
   3. انقل العينة إلى محلول عمل مطابق ل RI البنزيل والكحول والبنزيل والبنزوات (BABB) (انظر جدول المواد). احتضن لمدة 3-6 ساعات حتى يصبح النسيج شفافا وشفافا في الغالب في الضوء المرئي.
      ملاحظة: لتحضير محلول عمل BABB ، اخلطي جزءا واحدا من كحول البنزيل وجزأين من بنزوات البنزيل (1: 2) في زجاجة زجاجية. رجها برفق لمدة 5 دقائق في الغطاء.
4. تصوير أنسجة تنظيف iDISCO باستخدام مجهر ضوئي
   ملاحظة: قم بتصوير العينة التي تم مسحها بمجرد تحقيق الشفافية المثلى. يستخدم مجهر الألواح الضوئية ، مثل المجهر الفائق الثاني (انظر جدول المواد) ، للتصوير. املأ خزان التصوير بمحلول المقاصة النهائي ، محلول BABB. احرص على عدم انسكاب BABB على الأداة لتجنب تلف الأداة.
   1. استخدم هدف هواء 1x للصور ذات التكبير المنخفض التي تغطي عرض العينة بأكملها بالكامل. انقل العينة برفق من محلول المقاصة على قطعة قماش ورقية وجففها قريبا.
      ملاحظة: استخدم ملقطا غير حاد لتجنب الضغط على العينة.
   2. حدد حامل عينة بالحجم المناسب بناء على حجم العينة/المنديل وقم بتوصيل الجانب الخلفي من العينة بحامل العينة باستخدام الغراء الفائق.
      ملاحظة: انتظر لمدة 1-2 دقيقة حتى يتم توصيل العينة بإحكام بحامل العينة.
   3. املأ خزان التصوير لمجهر الألواح الضوئية بمحلول BABB وضع العينة فيه برفق. اضبط حامل العينة للتأكد من أن العينة عمودية على ورقة الضوء ومضاءة بشكل صحيح.
   4. قم بخفض الهدف لتركيز العينة وضبط إعدادات العرض أثناء التركيز البؤري لعرض العينة بشكل صحيح. حدد ورقة (صفائح) الضوء المناسبة في برنامج المجهر واضبط عرضها لإضاءة مجال العرض بالكامل بالتساوي.
      ملاحظة: في نظام المجهر الفائق مع إضاءة الليزر على كلا الجانبين ، ابدأ بمحاذاة الليزر وتركيزه على جانب واحد. بمجرد ضبط كلا الجانبين ، قم بتنشيط كلا الليزرات الجانبيين لمراقبة صورة مسح ضوئي مدمجة من كلا الإضاءة.
   5. حدد قناة حمراء بعيدة (680 نانومتر) لتصوير الهياكل العصبية الملطخة ب NF200 وقناة مضان ذاتي (488 نانومتر) لتصوير الشريان الأورطي والأنسجة الضامة غير الملوثة. اضبط طاقة الليزر اعتمادا على شدة إشارة الفلورسنت للحصول على نسبة إشارة إلى ضوضاء مثالية ووقت التعرض وعرض لوح (صفائح) الضوء.
   6. حدد وضع المسح الضوئي xyz. اضبط مسح z-stack بخطوة z من 2-8 ميكرومتر وحدد تداخل 25٪ -60٪ على طول المحور الطولي لمسح البلاط (16 بت) يغطي الأسطح البطنية والظهرية للعينات لتصوير حجم العينة بالكامل (حتى 6-8 مم في العمق).
   7. قم بتسمية الفحص بمعلومات مفصلة ، بما في ذلك تاريخ الفحص واسم العينة والجسم المضاد المستخدم والهدف وعامل التكبير والخطوات z والليزر المستخدم. احفظ البيانات.
   8. قم بالتغيير إلى تكبير أعلى (2x أو 4x) عبر وظيفة التكبير لتصوير مناطق معينة من الجسم ذات الاهتمام.
   9. اتبع الخطوات 2.4.4-2.4.7 أعلاه للتصوير وحفظ البيانات.

3. معالجة الصور وتحليلها

ملاحظة: هناك حاجة إلى محطة عمل معالجة عالية الطاقة للمعالجة. تأكد من النسخ الاحتياطي للبيانات مباشرة بعد المعالجة بسبب الحجم الكبير للتصوير (5-100 جيجابايت لكل صورة).

1. معالجة الصور ل CLSM والصور متعددة الفوتون
   1. قم بتحميل الصور المبلطة Z-stack من CLSM والمجاهر متعددة الفوتون إلى محطة عمل معالجة الصور المجهزة ب Las X أو Imaris (برنامج تحليل الصور) أو برنامج فيجي للتصور ثلاثي الأبعاد وثنائي الأبعاد (2D) والتجزئة والقياس الكمي.
   2. لترميز عمق حجم الخلية أو البنية ، استخدم برنامج استعادة الصور (انظر جدول المواد) لفك التطور للصورة الأولية وإنشاء إسقاط أقصى كثافة للبيانات غير المعقدة باستخدام الترميز اللوني الزمني في Las X أو Fiji.
2. معالجة الصور للصور الورقية الخفيفة
   1. قم بتحميل سلسلة صور TIFF المبلطة Z-stack إلى برنامج فيجي. قم بدمج الصور باستخدام المكون الإضافي لخياطة فيجي واحفظ الصور المخيطة بتنسيق TIFF.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر، قم بضغط الصور المخيطة بتنسيق LZW للسماح بالمعالجة السريعة باستخدام برامج مختلفة.
   2. قم بتحميل الصور المخيطة في برنامج التصور ثلاثي الأبعاد (انظر جدول المواد) لتجزئة الصور. تتبع الهياكل العصبية والأوعية الدموية يدويا في المحور xyz. للتتبع اليدوي للألياف العصبية الصغيرة ، حدد إشارات NF200 ⁺ يدويا بكسل تلو الآخر في كل مستوى z على طول مسار الألياف العصبية بالكامل بين الشريان الأورطي والعقد.
   3. قم بتحميل الصور المعالجة مسبقا في برنامج تحليل الصور (انظر جدول المواد) لإنشاء الفيديو والتصور ثنائي الأبعاد وثلاثي الأبعاد للصور.
   4. استخدم التألق الذاتي لتقسيم الشريان الأورطي والأنسجة الضامة ، بما في ذلك الغدد الليمفاوية والعضلات ، في برنامج تحليل الصور. قم بتطبيق ألوان زائفة منفصلة في برنامج تحليل الصور لتصور الأجزاء الأبهرية المميزة مثل جدار الأبهر واللويحات.
   5. استخدم وظيفة معادلة الرسم البياني التكيفي (CLAHE) محدودة التباين في برنامج فيجي لتحسين التباين المحلي على خلفية الصور المعالجة.

النتائج

لإثبات التشريح المجهري للشريان الأورطي السليم والمريض والكشف عن الروابط الجسدية بين الجهاز المناعي والجهاز العصبي والجهاز القلبي الوعائي في نماذج الفئران لتصلب الشرايين ، استخدمنا طريقتين تكميليتين لإزالة الأنسجة: تطهير TDE للشريان الأورطي المعزول ، وإزالة iDISCO للفأر ?...

Discussion

يمكن اعتبار تصلب الشرايين مرضا التهابيا عابريا يصيب الشرايين التي تشمل جميع الطبقات الثلاث لجدار الشرايين. علاوة على ذلك ، فإن الشرايين محاطة بالأنسجة الدهنية والعصبية حول الأوعية الدموية. أثناء تطور تصلب الشرايين ، يخضع كل من هذه الأنسجة لتغييرات خلوية وهيكلية كبيرة ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2’-thiodiethanol (TDE)	Sigma	166782	Clearing reagent
Amira	Thermo Fisher Scientific		3D visualization software; Image processing software used for manual segmentation and tracing in 3D images
Benzyl alcohol	Sigma	W213713	Clearing reagent
Benzyl benzoate	Sigma	B6630	Clearing reagent
CD16/32	eBioscience	14-0161-82	Blocking solution
Confocal laser scanning microscope	Leica Microsystems	TCS- SP8 3X	Imaging device for multidimensional high-resolution imaging of intact biological tissues or sections with high specificity at subcellular resolution.
DAPI	Invitrogen	D3571	Nuclei marker
Dichloromethane (DCM)	Sigma	270997	Clearing reagent
Dissecting pan-black wax	Thermo Scientific	S17432	Aorta dissection and fixation
Dissection stereomicroscope	Leica Microsystems	Stemi 2000	Mouse organ dissection
Ethanol	Sigma	E7023	Defection
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Roth	8040.1	Perfusion buffer
Fiji	(ImageJ, NIH)		Open source image processing software for 2D and 3D images
Goat anti-Hamster IgG, Cy3	Dianova	127-165-099	Secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 680	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	A-21109	Secondary antibody
Goat anti-Rat IgG, Cy5	Dianova	712-175-150	Secondary antibody
Hamster Anti-CD3e	BD Bioscience	145-2C11	Pan-T cell marker
Huygens Professional	Scientific Volume Imaging, The Netherlands	Version 19.10	Image restoration software; Image processing software used mainly for deconvolution of 2D and 3D images
Image processing workstation	MIFCOM	MIFCOM X5	Image processing workstation equipped with all image processing software including Leica application suite X, Fiji, and Imaris for post-processing of images acquired by confocal, multiphoton and light sheet microscopes
Imaris	Bitplane	Version 8.4	Image analysis software; Image processing software used for automated segmentation of 3D images
Incubator and rotator	Marshall Scientific	Innova 4230	Incubation and rotation device during tissue clearing
iSpacer	Sunjin Lab	IS4020	Rectangular well as the sample holder
Ketamine	Livisto		Anesthetic
Leica Application Suite X (LAS-X)	Leica Microsystems	Version 3.5	Image processing software for the images acquired with Leica microscope
Light microscope	Leica Microsystems	DM LB	Imaging device for bright filed imaging
Light sheet  microscope	LaVision BioTech	Ultramicroscope II	Imaging technique for fast, high-resolution imaging of large biological specimens or whole mouse with low light exposure by rapidly acquiring images of thin optical sections.
Multiphoton microscopy	Leica Microsystems	TCS-SP5II MP	Imaging modality for multidimensional, high-resolution imaging of intact and viable biological tissues at sub-cellular and molecular level over prolonged periods of time, deep in the sample and with minimal invasion.
Normal goat serum	Sigma	G9023	Blocking solution
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P-6148	Fixation
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma	P4417-100TAB	Washing buffer
Porcine skin gelatin	Sigma	G1890	Incubation buffer
Quadrol	Sigma	122262	CUBIC clearing reagent
Rabbit Anti-NF200	Sigma	N4142	Pan-neuronal marker
Rat Anti-B220	BD Bioscience	RA3-6B2	Pan-B cell marker
Sucrose	Sigma	90M003524V	Dehydration
Sytox	Thermo Fisher Scientific	S11380	Nuclei marker
Tetrahydrofuran	Sigma	401757	Clearing reagent
Triton X-100	Roth	3051.1	Penetration
Urea	Sigma	U5128	CUBIC clearing reagent
Xylene	Fisher Chemical	x/0250/17	Anesthetic