Трехмерная визуализация тканей аорты при атеросклерозе

Резюме

В этой статье мы представляем оптимизированные протоколы очистки тканей для получения изображений аорты мыши в трех измерениях (3D). Мы описываем современные методы иммуноокрашивания, оптического клиринга и визуализации с целью определения анатомической близости периферической нервной системы с атеросклеротическими бляшками и адвентицией при атеросклерозе.

Аннотация

Недавние исследования продвинулись в понимании атеросклероза как трансмурального хронического воспалительного заболевания, затрагивающего все три слоя артериальной стенки, включая интимную бляшку, медиа и адвентицию, которая образует внешнюю соединительнотканную оболочку артерий. Наши недавние исследования показали, что адвентиция используется периферической нервной системой в качестве канала для доступа ко всем тканевым клеткам. Мы также обнаружили, что периферическая нервная система, то есть сенсорная и симпатическая нервная система, претерпевает серьезные процессы ремоделирования, включающие неогенез сетей аксонов, прилегающих к атеросклеротическим бляшкам. В этом контексте понимание структуры нейронной сети и ее взаимодействия с сосудистыми компонентами пораженных артерий открывает большие перспективы для лучшего понимания патогенеза сердечно-сосудистых заболеваний. Для достижения этих целей необходимы методы визуализации субклеточной архитектуры интактных здоровых и больных артерий вместе с окружающими их периваскулярными компартментами. Очистка тканей позволяет получить неповрежденную визуализацию глубоких тканей больших тканевых компартментов, которые в противном случае недоступны. Он позволяет проводить объемную визуализацию интактных артерий за счет интеграции инструментов маркировки, очистки, передовой микроскопической визуализации и обработки изображений. В данной работе мы описываем два различных, но дополняющих друг друга подхода к пассивному очищению тканей, а именно: очистку 2-тиодиотанола (TDE) на водной основе и трехмерную визуализацию очищенного растворителем органа (iDISCO) с помощью иммуномаркировки на основе растворителя для визуализации изолированных сегментов аорты или всей аорты in-situ у всей мыши.

Введение

Гистологические методы обеспечивают базовое понимание биологических образцов путем среза тканей/органов. Тем не менее, очертание сложных анатомических взаимодействий между клетками и тканью/тканью в трех димэншнах (3D) до недавнего времени было труднодостижимо. Эта неудовлетворенная потребность была особенно очевидна в контексте сердечно-сосудистой системы в здоровых и больных условиях. В прошлом визуализация неповрежденных тканей была сложной задачей из-за поглощения и рассеяния света, что делало их непрозрачными по своей сути. Очистка тканей делает неповрежденный биологический образец прозрачным, сводя к минимуму эти ограничения. Последние разработки в области методов очистки тканей позволяют проводить 3D-визуализацию неразрезанных прозрачных тканей с высоким разрешением, чтобы получить значительное представление о клеточной и структурной микроархитектуре целых органов с микрометровым разрешением, тем самым позволяя определять анатомические сети связи.

Атеросклероз включает в себя три слоя артериальной стенки, включая внутренний слой интимы, средний слой медиа и внешний слой соединительной ткани, который называется адвентицией. Атеросклеротические бляшки во внутреннем слое артерий были традиционной мишенью исследований на протяжении десятилетий ^1,2. Тем не менее, слой адвентиции содержит кровеносные сосуды, лимфатические сосуды и нервные волокна периферической нервной системы. Кроме того, адвентиция связана с периваскулярной жировой тканью и компонентами нейрональной ткани, включая периферические нервы и периваскулярные ганглии ^3,4. Известно, что периферические нервы используют адвентиции в качестве каналов для доступа к отдаленным тканям-мишеням и, по сути^{, к} клеткам. Наши недавние исследования продвинули вперед в понимании многоуровневых взаимодействий основных биологических систем, включая иммунную систему, нервную систему и сердечно-сосудистую систему. Мы назвали эти взаимодействия нейроиммунно-сердечно-сосудистыми интерфейсами ^6,7. Во время атерогенеза компоненты артериальной стенки претерпевают сильную реструктуризацию и ремоделирование. Например, наряду с прогрессированием атеросклеротических бляшек в интиме формируются агрегаты иммунных клеток, а в адвентиции аорты мышей происходит неогенез аксонов нейронов ^6,8,9. По мере прогрессирования атеросклероза агрегаты иммунных клеток развиваются в хорошо структурированные артерийные третичные лимфоидные органы (АТЛО) с различными участками Т-клеток, В-клеток и плазматических клеток¹⁰. Тем не менее, для того, чтобы очертить эти изменения в 3D, визуализация интактной ткани с высоким разрешением была сложной задачей из-за недостаточной проницаемости мембраны и присущего ей рассеяния света¹¹. Подходы к очищению тканей преодолели основные ограничения традиционных гистологических подходов 11,12,13,14,15 с усиленным проникновением антител глубоко в интактные ткани или органы путем равномерной регулировки показателя преломления (RI), что приводит к получению изображений микрометрового разрешения с большей глубиной визуализации в вокселях. RI образцов могут быть сопоставлены либо с глицерином (RI 1,46), либо с иммерсионным маслом (RI 1,52), что значительно снижает рассеяние света и сферические аберрации, обеспечивая высокое разрешение. Последние достижения в методах очистки всего органа или всего тела, такие как 2,2-тиодиотанол на водной основе (TDE) и 3D-визуализация органов, очищенных растворителем (iDISCO), соответственно, вместе с методами объемной визуализации (включая конфокальную, многофотонную и световую микроскопию) позволили реконструировать микроанатомию сосудистой архитектуры путем построения атласа их связей^11,16. Визуализация этих клеточных и структурных связей в 3D может дать новое понимание и ответить на биологические вопросы, на которые до сих пор не было ответа.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Настоящее исследование было выполнено в соответствии с рекомендациями местного и национального комитета по использованию и уходу за животными. В настоящем исследовании были использованы гиперлипидемические самцы мышей Apoe^-/- на фоне C57BL/6J, которые находились на стандартной диете грызунов, у которых спонтанно развивается атеросклероз с возрастом.

1. Визуализация изолированной аорты целиком и очистка TDE

1. Подготовка тканей
   1. Приготовьте анестетик в дозе 150 мг/кг кетамина и 30 мг/кг ксилазина (см. Таблицу материалов) на каждую мышь. Глубоко обезболить мышей путем внутрибрюшинного введения и подтвердить это отсутствием реакции на глубокий болевой тест.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация и объем инъекции следующие: Кетамин 100 мг/мл; Ксилазин 20 мг/мл; Объем инъекции 50:50 по объему смеси кетамина и ксилазина в концентрации 3 мкл/г.
   2. Поместите мышь на поролоновую пластину, застеленную хирургическими бумажными полотенцами, и зафиксируйте руки и ноги в лежачем положении скотчем. Продезинфицируйте грудную клетку 75% этанолом (см. Таблицу материалов) и возьмите кровь через левый желудочек с помощью одноразового шприца объемом 1 мл для удаления крови для лучшей перфузии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно использовать забор сердечной крови с помощью торакотомии.
   3. Сделайте разрез по средней линии на грудной клетке, чтобы обнажить сердце, и небольшой разрез в правом предсердии, чтобы обеспечить транссердечную перфузию. Перфузируйте мышь через левый желудочек 10 мл 5 мл этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА; см. Таблицу материалов) в фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение 5 минут, а затем 20 мл PBS в течение 5-10 минут, пока кровь не будет вымыта. Наконец, перфузируйте 10 мл 4% параформальдегида (PFA) в течение 20 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры могут быть выполнены с помощью перистальтического перфузионного насоса с давлением 100-125 мм рт.ст. при комнатной температуре (ОТ). Перфузионная игла вводится в сердце мыши через то же отверстие, что и при заборе крови.
   4. Удалите внутренние органы, включая селезенку, печень, легкие, желудочно-кишечный тракт и репродуктивные органы, с помощью хирургических инструментов. Сохраняйте сердце, аорту и почки в целости и сохранности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургическими инструментами, используемыми для препарирования и удаления органов, являются ножницы для препарирования, ножницы для тонкой радужной оболочки, пружинные ножницы, тупые щипцы, изогнутые щипцы и изогнутые тонкие щипцы.
   5. Обнажите всю аорту от восходящей аорты до бифуркации подвздошной кости под рассекающим стереомикроскопом (30-40-кратное увеличение). Аккуратно удалите тимус и жировую ткань, не травмируя аорту.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не разрезать аорту. Для мышей Apoe^-/- сохраняйте минимально окруженную периваскулярную жировую ткань аорты для соединительной структуры.
   6. Соберите всю аорту в чашку Петри, наполненную PBS. Разделите аорту на разные сегменты и разделите всю аорту в продольном направлении с помощью радужной оболочки или пружинных ножниц, чтобы обнажить интимную поверхность, следуя последовательности и направлению, указанным на рисунке 1A для очистки TDE.
   7. Прикрепите лицевую аорту к плоской черной восковой пластине в форме буквы Y, как показано на рисунке 1А. Поместите его в 4% PFA на ночь при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прикрепите аорту к восковой пластине перед фиксацией, чтобы избежать сгибания и скручивания в следующих этапах.
   8. Открепите аорту и переведите ее в PBS. Тщательно промойте аорту в течение 5 мин 5 раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый раз перекладывайте аорту в разные трубки, наполненные PBS, для промывки.
2. Окрашивание антителами для аорты на лице
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы инкубации выполняются в пробирках объемом 2 мл с безопасным замком с осторожным вращением или встряхиванием при лучевой терапии.
   1. Переведите неподвижную аорту в раствор для блокировки на 2 ч для блокировки и пермеабилизации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Решение для блокирования варьируется в зависимости от первичных и вторичных антител. Например, блокирующий раствор: 0,5 мг/мл CD16/32 (1:100), 10% обычная ослиная сыворотка, 2% Тритон Х-100 в PBS (см. Таблицу материалов)
   2. Инкубируйте аорту с первичными антителами в блокирующем растворе, указанном выше (шаг 1.2.1), например, CD3e (разведение 1:100), NF200 (разведение 1:200) и B220 (разведение 1:200) в течение 24 ч (см. Таблицу материалов). Промойте аорту в PBS в течение 5 мин 5 раз.
   3. Инкубируйте аорту со вторичными антителами в 10% нормальной сыворотке осла (разведение 1:300) и 4',6-диамидино-2-фенилиндоле (DAPI; 1 мг/мл) для ядерного окрашивания в течение ночи (см. Таблицу материалов). Промойте аорту в PBS в течение 5 минут 5 раз и храните аорту в PBS при температуре 4 °C до процедуры очищения тканей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый раз перекладывайте аорту в разные трубки, наполненные PBS, для промывки. Накройте трубки алюминиевой фольгой, чтобы они оставались в темноте для шага 1.2.3.
3. Очищение тканей TDE
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы инкубации выполняются в пробирках объемом 2 мл с безопасным замком, аккуратно вращающихся в режиме RT, и накрытых алюминиевой фольгой в темноте. Рабочие растворы TDE (см. Таблицу материалов) обладают высокой проницаемостью, и с ними следует осторожно обращаться в вытяжном шкафу. Собирайте и утилизируйте отходы в соответствии с местными правилами.
   1. Переведите окрашенную аорту в рабочие растворы с 20% TDE и инкубируйте в течение 1 ч.
   2. Переведите аорту в рабочие растворы с 47% TDE и инкубируйте в течение 12 часов. Переведите аорту в рабочие растворы с 60% TDE и инкубируйте в течение 24-36 часов, пока образцы не станут прозрачными в видимом свете, чтобы соответствовать RI.
   3. Храните аорту в 60% TDE при RT в темноте до визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обновляйте рабочие растворы каждые 30 минут для краткосрочного периода инкубации (например, шаг 1.3.1) и каждые 4 часа для длительного периода инкубации (например, шаг 1.3.2). Время инкубации для каждого этапа может быть скорректировано в зависимости от размера ткани для лучшего проникновения антител или прозрачности очистки. Для апоэ^-/- мышиной аорты, окруженной жировой тканью, время инкубации должно быть соответствующим образом увеличено.
4. Визуализация аорты с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (CLSM)
   1. Используйте имеющиеся в продаже двусторонние двусторонние липкие прямоугольные дистанционные отверстия для визуализации толщиной 0,2 мм (см. Таблицу материалов). Приклейте колодец к чистому предметному стеклу и переложите очищенную аорту. Убедитесь, что аортальная адвентиция en face обращена к покровному листу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно постучите по плоской аорте на лицевой поверхности с помощью скошенных щипцов. При необходимости сложите несколько отверстий для спейсера визуализации в соответствии с размером ткани.
   2. Смонтируйте аорту каплями 60% раствора TDE. Осторожно прикрепите покровное стекло к лунке, не допуская попадания пузырьков воздуха между образцом и покровным стеклом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно удалите пузыри иглой до того, как покровная пленка будет закрыта. Не используйте чрезмерное количество монтажного раствора, так как образец может плавать.
   3. Используйте перевернутый инструмент CLSM (см. Таблицу материалов), оснащенный 20-кратным иммерсионным (мульти) объективом (NA: 0,75).
      ПРИМЕЧАНИЕ: CLSM позволяет проводить объемную визуализацию на глубине до 70 мкм с более высоким разрешением, что необходимо для анализа диаметра нерва и взаимодействия нервно-иммунных клеток в адвентиции аорты.
   4. Выберите объектив «Погружение 20x/0,75 (масло)». Настройте гибридные диодные детекторы на основе окрашенных красителей. Отрегулируйте параметры отображения и выберите формат XY 1024 x 1024 пикселя для создания изображений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Масляный иммерсионный объектив улавливает сигналы лучше, чем вода.
   5. Капните погружное масло (с глицерином) равномерно вдоль аорты на покровном стекле. Переместите объектив 63x грубо по направлению к образцу, пока он не коснется погружного масла/покровного стекла.
   6. Переместите объектив 63x точно под микроскопом, чтобы определить интересующую область. Получение Z-стека со стороны придатия лицевой аорты с шагом 2-4 мкм на глубину до 60 мкм для 3D-визуализации.
   7. Присвойте файлу имя с указанием образца, сведения о сканировании и сохраните данные.
5. Визуализация TDE-очищения аорты с помощью многофотонного микроскопа
   1. Выполните шаги 1.4.1-1.4.2 для установки лицевой аорты на предметное стекло.
   2. Используйте вертикальный многофотонный микроскоп (см. Таблицу материалов), оснащенный 20-кратным объективом (погружение в воду, NA: 1,00, рабочее расстояние = 2 мм), позволяющим получать объемные изображения на глубине до 1,5 мм.
   3. Получение Z-стеков с алюминальной стороны с шагом 10-15 мкм на глубине до 700 мкм. Назовите файл и сохраните данные, как описано в шаге 1.4.7.

2. Иммуноокрашивание всего тела и очищение тканей iDISCO

1. Подготовка тканей
   1. Выполните шаги 1.1.1-1.1.3 выше для анестезии, фиксации мыши и перфузии.
   2. Удалите кожу и внутренние органы, включая селезенку, печень, легкие, желудочно-кишечный тракт и репродуктивные органы, с помощью хирургических инструментов. Сохраняйте сердце, аорту и почки в целости и сохранности.
   3. Рассеките часть тела выше уровня диафрагмы и зафиксируйте нижнюю часть тела 4% PFA на 1-2 дня (с) при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте фиксацию, промывку и инкубацию в пробирках объемом 50 мл на мягко вращающемся шейкере. Освежите раствор в новых пробирках 2-3 раза.
   4. Тщательно промойте образец в течение 10 мин 3 раза при температуре RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый раз перекладывайте аорту в разные трубки, заполненные PBS.
   5. Инкубируйте образец в 20% прозрачном, беспрепятственном растворе для визуализации мозга и тела и вычислительном анализе (CUBIC) в течение 48 часов для обесцвечивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для 20% раствора CUBIC растворите 25 г мочевины в 15 мл Triton X-100 и 28 мл Quadrol, и добавьте PBS до конечного объема 100 мл. Готовьте его в вытяжке, так как ингредиенты стимулируют (см. Таблицу материалов).
   6. Тщательно промойте образец в течение 1 ч пять раз в PBS при RT.
2. Окрашивание антителами
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы инкубации выполняются в пробирках объемом 50 мл с безопасным замком при осторожном вращении или встряхивании при 4 °C.
   1. Инкубируйте образец в растворе PBS-желатин-Triton X-100-сыворотки (PGST) в течение ночи для пермеабилизации и блокировки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор для блокирования зависит от антител. Например, блокирующий раствор: PBS-желатин-сыворотка Triton X-100 (PGST, см. Таблицу материалов): 0,2% желатин из свиной кожи, 0,5% Triton X-100 и 5% козья сыворотка в PBS.
   2. Инкубируйте образец с первичными антителами в растворе PGST, например, NF200 (разведение 1:200, см. Таблицу материалов) при 4 °С, и осторожно встряхивайте в течение 10-12 дней. Затем тщательно промойте образец в PGST в течение 1 ч 5 раз при RT.
   3. Инкубируйте образец с раствором вторичного антитела (разведение 1:300) и DAPI (1 мг/мл) в PGST при 4 °C в течение 7 дней.
   4. Тщательно промойте образец в PGST в течение 1 часа 5 раз в RT. Перенесите образец в PBS и храните аорту в PBS при температуре 4 °C для дальнейших действий.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Накройте трубки алюминиевой фольгой, чтобы они оставались темными на этапах 2.2.3-2.2.4.
3. Модифицированная очистка тканей iDISCO
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время очистки трубки должны быть покрыты алюминиевой фольгой, чтобы избежать отбеливания/затухания сигнала из-за прямого воздействия естественного/искусственного света. Все органические реагенты, используемые при очистке DISCO, вредны, и все этапы очистки следует выполнять в вытяжном шкафу. При работе с реагентами надевайте лабораторный халат, перчатки и маску, чтобы избежать вдыхания и контакта с кожей и глазами. Соберите и сбросьте отходы уборки в соответствующие контейнеры для мусора в капюшоне.
   1. Переведите окрашенные образцы с шага 2.2.4 на ряд повышенных концентраций тетрагидрофурана (ТГФ, см. Таблицу материалов) рабочих растворов для обезвоживания, то есть 50%, 70%, 90% и 100% (два раза по 100%). Инкубировать в течение 12 ч на каждую концентрацию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разведите реагент ТГФ (99%-100%) в дистиллированной воде для рабочих растворов различной концентрации в вытяжке. Обновляйте рабочие растворы каждые 6 ч.
   2. Перенесите образец в раствор абсолютного дихлорметана (ДКМ, см. Таблицу материалов) на 3 ч для удаления липидов.
   3. Перенесите образец в рабочий раствор RI, соответствующий бензиловому спирту-бензилбензоату (BABB) (см. Таблицу материалов). Инкубируйте в течение 3-6 часов, пока ткань не станет полупрозрачной и преимущественно прозрачной в видимом свете.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления рабочего раствора BABB смешайте в стеклянной бутылке 1 часть бензилового спирта и 2 части бензилбензоата (1:2). Аккуратно встряхните его в течение 5 минут в вытяжке.
4. Визуализация очищающей ткани iDISCO с помощью светового микроскопа
   ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализируйте очищенный образец, как только будет достигнута оптимальная прозрачность. Для получения изображений используется световой микроскоп, такой как ультрамикроскоп-II (см. Таблицу материалов). Заполните резервуар для визуализации окончательным раствором для очистки, раствором BABB. Будьте осторожны, чтобы не пролить BABB на инструмент, чтобы избежать его повреждения.
   1. Используйте воздушный объектив 1x для получения изображений с малым увеличением, охватывающих всю ширину всего образца. Аккуратно переложите образец из очищающего раствора на бумажную ткань и быстро высушите.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте тупые щипцы, чтобы не сдавливать образец.
   2. Выберите держатель для образцов подходящего размера в зависимости от размера образца/ткани и прикрепите заднюю сторону образца к держателю для образцов с помощью суперклея.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подождите 1-2 минуты, пока образец не будет надежно прикреплен к держателю для образцов.
   3. Заполните емкость для изображения светолистового микроскопа раствором BABB и аккуратно поместите в него образец. Отрегулируйте держатель образца так, чтобы образец был перпендикулярен световому полотну и освещался должным образом.
   4. Опустите объектив, чтобы сфокусировать образец, и отрегулируйте параметры отображения во время фокусировки, чтобы правильно просмотреть образец. Выберите подходящий световой лист (листы) в программном обеспечении микроскопа и отрегулируйте его ширину, чтобы равномерно освещать все поле зрения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В системе ультрамикроскопа с двусторонним лазерным освещением начните с выравнивания и фокусировки лазера с одной стороны. После установки обеих сторон активируйте лазеры с обеих сторон, чтобы наблюдать объединенное изображение сканирования от обоих источников освещения.
   5. Выберите дальний красный канал (680 нм) для изображения окрашенных NF200 нейронных структур и канал автофлуоресценции (488 нм) для изображения неокрашенной аорты и соединительных тканей. Отрегулируйте мощность лазера в зависимости от интенсивности флуоресцентного сигнала для получения оптимального соотношения сигнал/шум, времени экспозиции и ширины светового листа (слоев).
   6. Выберите режим сканирования x-y-z. Установите z-стековое сканирование с шагом z 2-8 мкм и выберите перекрытие 25%-60% вдоль продольной оси y развертки плитки (16 бит), охватывающей вентральную и дорсальную поверхности образцов, чтобы отобразить весь объем образца (глубиной до 6-8 мм).
   7. Назовите сканирование с подробной информацией, включая дату сканирования, название образца, используемое антитело, объектив, коэффициент масштабирования, z-шаги и используемые лазеры. Сохраните данные.
   8. Изменяйте увеличение на большее (2x или 4x) с помощью функции увеличения, чтобы получить изображение определенных областей тела, представляющих интерес.
   9. Выполните шаги 2.4.4-2.4.7 выше для создания образа и сохраните данные.

3. Обработка и анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Для обработки требуется высокопроизводительная рабочая станция. Обеспечьте резервное копирование данных сразу после обработки благодаря большому объему изображений (5-100 ГБ на образ).

1. Обработка изображений CLSM и многофотонных изображений
   1. Загружайте мозаичные изображения Z-стека с CLSM и многофотонных микроскопов на рабочую станцию обработки изображений, оснащенную программным обеспечением Las X, Imaris (программное обеспечение для анализа изображений) или программное обеспечение Fiji для 3D- и двумерной (2D) визуализации, сегментации и количественной оценки.
   2. Чтобы обозначить цветом объемную глубину ячейки или структуры, используйте программное обеспечение для восстановления изображений (см. Таблицу материалов) для деконволюции исходного изображения и создания проекции максимальной интенсивности деконволютированных данных с использованием временного цветового кодирования в Лас-Х или на Фиджи.
2. Обработка световых изображений
   1. Загрузите серию изображений TIFF с Z-стеком в программное обеспечение Fiji. Сшивайте изображения с помощью плагина сшивки Fiji и сохраняйте сшитые изображения в формате TIFF.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости сожмите сшитые изображения в формате LZW, чтобы обеспечить быструю обработку с помощью различных программ.
   2. Загрузите сшитые изображения в программное обеспечение для 3D-визуализации (см. Таблицу материалов) для сегментации изображений. Вручную проследите нейронные и сосудистые структуры по оси x-y-z. Для ручного отслеживания мелких нервных волокон вручную выберите сигналы NF200⁺ пиксель за пикселем в каждой z-плоскости по всему пути нервного волокна между аортой и ганглиями.
   3. Загрузите предварительно обработанные изображения в программное обеспечение для анализа изображений (см. Таблицу материалов) для создания видео, 2D и 3D визуализации изображений.
   4. Используйте автофлуоресценцию для сегментации аорты и соединительных тканей, включая лимфатические узлы и мышцы, в программном обеспечении для анализа изображений. Применяйте отдельные псевдоцвета в программном обеспечении для анализа изображений, чтобы визуализировать отдельные сегменты аорты, такие как стенка аорты и бляшка.
   5. Используйте функцию адаптивного выравнивания гистограммы с ограничением контраста (CLAHE) в программном обеспечении Fiji для усиления локального контраста на фоне обработанных изображений.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Чтобы продемонстрировать микроанатомию здоровой и больной аорты и выявить физические связи между иммунной системой, нервной системой и сердечно-сосудистой системой в мышиных моделях атеросклероза, мы использовали два дополнительных подхода к очищению тканей: очищ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Атеросклероз можно рассматривать как трансмуральное воспалительное заболевание артерий, вовлекающее все три слоя артериальной стенки. Кроме того, артерии окружены периваскулярной жировой и нейрональной тканями. Во время прогрессирования атеросклероза каждая из э?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2’-thiodiethanol (TDE)	Sigma	166782	Clearing reagent
Amira	Thermo Fisher Scientific		3D visualization software; Image processing software used for manual segmentation and tracing in 3D images
Benzyl alcohol	Sigma	W213713	Clearing reagent
Benzyl benzoate	Sigma	B6630	Clearing reagent
CD16/32	eBioscience	14-0161-82	Blocking solution
Confocal laser scanning microscope	Leica Microsystems	TCS- SP8 3X	Imaging device for multidimensional high-resolution imaging of intact biological tissues or sections with high specificity at subcellular resolution.
DAPI	Invitrogen	D3571	Nuclei marker
Dichloromethane (DCM)	Sigma	270997	Clearing reagent
Dissecting pan-black wax	Thermo Scientific	S17432	Aorta dissection and fixation
Dissection stereomicroscope	Leica Microsystems	Stemi 2000	Mouse organ dissection
Ethanol	Sigma	E7023	Defection
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Roth	8040.1	Perfusion buffer
Fiji	(ImageJ, NIH)		Open source image processing software for 2D and 3D images
Goat anti-Hamster IgG, Cy3	Dianova	127-165-099	Secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 680	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	A-21109	Secondary antibody
Goat anti-Rat IgG, Cy5	Dianova	712-175-150	Secondary antibody
Hamster Anti-CD3e	BD Bioscience	145-2C11	Pan-T cell marker
Huygens Professional	Scientific Volume Imaging, The Netherlands	Version 19.10	Image restoration software; Image processing software used mainly for deconvolution of 2D and 3D images
Image processing workstation	MIFCOM	MIFCOM X5	Image processing workstation equipped with all image processing software including Leica application suite X, Fiji, and Imaris for post-processing of images acquired by confocal, multiphoton and light sheet microscopes
Imaris	Bitplane	Version 8.4	Image analysis software; Image processing software used for automated segmentation of 3D images
Incubator and rotator	Marshall Scientific	Innova 4230	Incubation and rotation device during tissue clearing
iSpacer	Sunjin Lab	IS4020	Rectangular well as the sample holder
Ketamine	Livisto		Anesthetic
Leica Application Suite X (LAS-X)	Leica Microsystems	Version 3.5	Image processing software for the images acquired with Leica microscope
Light microscope	Leica Microsystems	DM LB	Imaging device for bright filed imaging
Light sheet  microscope	LaVision BioTech	Ultramicroscope II	Imaging technique for fast, high-resolution imaging of large biological specimens or whole mouse with low light exposure by rapidly acquiring images of thin optical sections.
Multiphoton microscopy	Leica Microsystems	TCS-SP5II MP	Imaging modality for multidimensional, high-resolution imaging of intact and viable biological tissues at sub-cellular and molecular level over prolonged periods of time, deep in the sample and with minimal invasion.
Normal goat serum	Sigma	G9023	Blocking solution
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P-6148	Fixation
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma	P4417-100TAB	Washing buffer
Porcine skin gelatin	Sigma	G1890	Incubation buffer
Quadrol	Sigma	122262	CUBIC clearing reagent
Rabbit Anti-NF200	Sigma	N4142	Pan-neuronal marker
Rat Anti-B220	BD Bioscience	RA3-6B2	Pan-B cell marker
Sucrose	Sigma	90M003524V	Dehydration
Sytox	Thermo Fisher Scientific	S11380	Nuclei marker
Tetrahydrofuran	Sigma	401757	Clearing reagent
Triton X-100	Roth	3051.1	Penetration
Urea	Sigma	U5128	CUBIC clearing reagent
Xylene	Fisher Chemical	x/0250/17	Anesthetic