הדמיה תלת מימדית של רקמות אבי העורקים בטרשת עורקים

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים אופטימליים לניקוי רקמות כדי לדמות את אבי העורקים העכברי בתלת מימד (3D). אנו מתארים נהלים חדישים לצביעה חיסונית, ניקוי אופטי והדמיה מתוך כוונה להגדיר את הקרבה האנטומית של מערכת העצבים ההיקפית עם פלאק טרשת עורקים והאדוונטיטיה בטרשת עורקים.

Abstract

מחקרים אחרונים קידם את ההבנה של טרשת עורקים כמחלה דלקתית כרונית טרנסמורלית המערבת את כל שלוש השכבות של דופן העורק, כולל רובד האינטימה, המדיה והאדוונטיטיה, היוצרת את מעטפת רקמת החיבור החיצונית של העורקים. המחקרים האחרונים שלנו הציעו כי האדוונטיציה משמשת את מערכת העצבים ההיקפית כצינור להגעה לכל תאי הרקמה. מצאנו גם שמערכת העצבים ההיקפית, כלומר מערכת העצבים התחושתית והסימפתטית, עוברת תהליכי שיפוץ גדולים הכוללים ניאוגנזה של רשתות אקסונים הסמוכות לפלאק טרשת עורקים. בהקשר זה, הבנת מבנה הרשת העצבית והאינטראקציות שלה עם מרכיבי כלי הדם של עורקים חולים טומנת בחובה הבטחות גדולות להבנה טובה יותר של פתוגנזה של מחלות לב וכלי דם. כדי להשיג מטרות אלה, יש צורך בשיטות להמחשת הארכיטקטורה התת-תאית של העורקים הבריאים והחולים השלמים יחד עם התאים הפרי-וסקולריים הסובבים אותם. ניקוי רקמות מאפשר הדמיה שלמה של רקמות עמוקות של תאי רקמה גדולים יותר שאינם נגישים אחרת. הוא מאפשר הדמיה נפחית של עורקים שלמים באמצעות שילוב של כלי תיוג, ניקוי, הדמיה מיקרוסקופית מתקדמת ועיבוד תמונה. כאן, אנו מתארים שתי גישות נפרדות אך משלימות לניקוי רקמות פסיביות, כלומר, ניקוי 2, 2-תיודיתנול (TDE) מבוסס מימי והדמיה תלת מימדית המאפשרת תיוג חיסוני מבוסס ממס של ניקוי איברים מנוקים מממס (iDISCO) כדי לדמות מקטעי אבי העורקים מבודדים או אבי העורקים השלם באתרו בעכבר כולו.

Introduction

טכניקות היסטולוגיות מספקות הבנה בסיסית של דגימות ביולוגיות באמצעות חתך רקמות/איברים. עם זאת, תיחום אינטראקציות אנטומיות מורכבות של תאים/תאים ורקמות/רקמות בשלושה דימנמנטים (תלת מימד) היה - עד לאחרונה - קשה להשגה. צורך בלתי מסופק זה היה בולט במיוחד בהקשר של מערכת הלב וכלי הדם במצבים בריאים וחולים. הדמיית רקמות שלמות הייתה מאתגרת בעבר עקב ספיגת אור ופיזור אור, מה שהופך אותן לאטומות במהותן. ניקוי רקמות הופך את הדגימה הביולוגית השלמה לשקופה על ידי מזעור מגבלות אלה. ההתפתחויות האחרונות בטכניקות ניקוי רקמות מאפשרות הדמיה תלת מימדית ברזולוציה גבוהה של רקמות שקופות לא חתוכות כדי לספק תובנה ניכרת לגבי המיקרו-ארכיטקטורה התאית והמבנית של איברים שלמים ברזולוציה מיקרומטרית, ובכך לאפשר הגדרה של רשתות קישוריות אנטומיות.

טרשת עורקים מערבת שלוש שכבות של דופן העורק, כולל שכבת האינטימה הפנימית, שכבת המדיה האמצעית ושכבת רקמת החיבור החיצונית, המכונה אדוונטיטיה. פלאק טרשת עורקים בשכבה הפנימית של העורקים היה יעד קונבנציונלי למחקר במשך עשרות שנים ^1,2. עם זאת, שכבת האדוונטיטיה מכילה כלי דם, כלי לימפה וסיבי עצב של מערכת העצבים ההיקפית. יתר על כן, האדוונטיציה קשורה לרקמת השומן הפרי-וסקולרית ולמרכיבי הרקמה העצבית, כולל עצבים היקפיים וגרעינים פריוסקולריים ^3,4. ידוע כי עצבים היקפיים משתמשים באדוונטיציה כצינורות כדי להגיע לרקמות מטרה רחוקות, ולמעשה, לתאים⁵. המחקרים האחרונים שלנו קידמו את ההתקדמות בהבנת האינטראקציות הרב-שכבתיות של המערכות הביולוגיות העיקריות, הכוללות את מערכת החיסון, מערכת העצבים ומערכת הלב וכלי הדם. קראנו לאינטראקציות הללו ממשקים נוירו-אימוניים-קרדיווסקולריים ^6,7. במהלך אטרוגנזה, רכיבי דופן העורקים עוברים ארגון מחדש ועיצוב מחדש חזקים. לדוגמה, בסמוך להתקדמות רובד טרשת עורקים באינטימה, נוצרים אגרגטים של תאים חיסוניים, וניאוגנזה של אקסון עצבי מתרחשת באדוונטיציה אבי העורקים של העכברים ^6,8,9. ככל שטרשת העורקים מתקדמת, אגרגטים של תאי חיסון מתפתחים לאיברי לימפה שלישוניים בעורקים (ATLOs) מובנים היטב עם אזורי תאי T, תאי B ותאי פלזמה מובחנים¹⁰. עם זאת, כדי לתאר את השינויים הללו בתלת מימד, הדמיה ברזולוציה גבוהה של הרקמה השלמה הייתה מאתגרת בגלל חדירות לא מספקת של הממברנה ופיזור אור מובנה¹¹. גישות ניקוי רקמות התגברו על המגבלות העיקריות של גישות היסטולוגיה קונבנציונליות 11,12,13,14,15 עם חדירה משופרת של נוגדנים כדי להגיע עמוק לרקמות או איברים שלמים על ידי התאמה אחידה של מקדם השבירה (RI), מה שמוביל לתמונות ברזולוציה בקנה מידה מיקרומטרי עם עומק הדמיה גבוה יותר בווקסלים. ניתן להתאים RIs של דגימות לגליצרול (RI 1.46) או לשמן טבילה (RI 1.52), ובכך להפחית מאוד את פיזור האור והסטיות הכדוריות, מה שמאפשר רזולוציה גבוהה. ההתקדמות האחרונה בטכניקות ניקוי של כל האיברים או רקמות הגוף כולו, כגון 2,2-תיודיתנול (TDE) מבוסס מים והדמיה תלת מימדית של איברים מנוקים ממסים (iDISCO), בהתאמה, יחד עם טכניקות הדמיה נפחית (כולל הדמיית מיקרוסקופיה קונפוקלית, מולטיפוטונית ומיקרוסקופיה קלה) אפשרו שחזורים של המיקרואנטומיה של ארכיטקטורת כלי הדם על ידי בניית אטלס הקישוריות שלהם^11,16. הדמיה של הקשרים התאיים והמבניים הללו בתלת מימד יכולה לספק תובנות חדשות כדי לענות על שאלות ביולוגיות שעד כה לא נענו.

Protocol

המחקר הנוכחי בוצע על פי הנחיות הוועדה המקומית והארצית לשימוש וטיפול בבעלי חיים. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בעכברי Apoe^-/- זכרים היפרליפידמיים על רקע C57BL/6J שנשמרו על דיאטת צ'או מכרסמים סטנדרטית המפתחים באופן ספונטני טרשת עורקים במהלך ההזדקנות.

1. הדמיה שלמה של אבי העורקים המבודד וניקוי TDE

1. הכנת רקמות
   1. הכן את חומר ההרדמה ב-150 מ"ג/ק"ג קטמין ו-30 מ"ג/ק"ג קסילזין (ראה טבלת חומרים) לכל עכבר. הרדמה עמוקה של עכברים על ידי הזרקה תוך צפקית ואישור זה על ידי חוסר תגובה לבדיקת הכאב העמוק.
      הערה: ריכוז ונפח ההזרקה הם כדלקמן: קטמין 100 מ"ג/מ"ל; קסילזין 20 מ"ג/מ"ל; נפח הזרקה 50:50 לפי נפח תערובת של קטמין וקסילזין ב-3 מיקרוליטר לגרם.
   2. הנח את העכבר על צלחת קצף מכוסה במגבות נייר כירורגיות, וקבע את הידיים והרגליים במצב שכיבה בעזרת סרטים. יש לחטא את החזה עם אתנול 75% (ראה טבלת חומרים) ולקחת דם דרך החדר השמאלי עם מזרק חד פעמי של 1 מ"ל כדי להסיר את הדם לזלוף טוב יותר.
      הערה: ניתן להשתמש גם באיסוף דם לבבי באמצעות כריתת בית החזה.
   3. בצע חתך בקו האמצע בחזה כדי לחשוף את הלב וחתך קטן בפרוזדור הימני כדי לאפשר זלוף טרנס-לבבי. החדרו את העכבר דרך החדר השמאלי עם 10 מ"ל של 5 מ"ל חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA; ראו טבלת חומרים) בתמיסת מלח עם פוספט (PBS) למשך 5 דקות, ולאחר מכן 20 מ"ל של PBS למשך 5-10 דקות עד שהדם נשטף החוצה. לבסוף, יש להחדיר 10 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 20 דקות.
      הערה: ניתן לבצע את כל ההליכים באמצעות משאבת זלוף פריסטלטית בלחץ של 100-125 מ"מ כספית בטמפרטורת החדר (RT). מחט הזלוף מוחדרת ללב העכבר דרך אותו חור כמו שאיבת הדם.
   4. הסר איברים פנימיים, כולל הטחול, הכבד, הריאות ואיברי מערכת העיכול והרבייה, באמצעות מכשירים כירורגיים. שמור על הלב, אבי העורקים והכליות שלמים באתרם.
      הערה: מכשירים כירורגיים המשמשים לדיסקציה והסרת איברים הם מספריים לדיסקציה, מספריים קשתית עדינה, מספריים קפיציים, מלקחיים קהים, מלקחיים מעוקלים ומלקחיים עדינים מעוקלים.
   5. חשוף את כל אבי העורקים מאבי העורקים העולה להתפצלות הכסל תחת הסטריאומיקרוסקופ המנתח (הגדלה פי 30-40). הסר בזהירות את בלוטת התימוס ורקמת השומן מבלי לפגוע באבי העורקים.
      הערה: היזהר לא לחתוך את אבי העורקים. עבור עכברי Apoe^-/- , שמור על רקמת השומן הפרי-וסקולרית המינימלית של אבי העורקים למבנה מחובר.
   6. קצרו את כל אבי העורקים לצלחת פטרי מלאה ב-PBS. הפרד את אבי העורקים למקטעים שונים ופצל את כל אבי העורקים לאורך באמצעות קשתית או מספריים קפיציים כדי לחשוף את המשטח האינטימי בהתאם לרצף ולכיוון המצוינים באיור 1A לניקוי TDE.
   7. הצמד את אבי העורקים על לוחית השעווה השחורה השטוחה בצורת Y, כפי שמצוין באיור 1A. מקבעים אותו ב-4% PFA למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
      הערה: הצמד את אבי העורקים לצלחת השעווה לפני הקיבוע כדי למנוע קיפול וסלסול בשלבים הבאים.
   8. בטל את הצמדת אבי העורקים והעבר אותו ל-PBS. יש לשטוף היטב את אבי העורקים למשך 5 דקות למשך 5 פעמים.
      הערה: העבירו את אבי העורקים לצינורות שונים מלאים ב-PBS בכל פעם לשטיפה.
2. מכתים נוגדנים לאבי העורקים בפנים
   הערה: כל שלבי הדגירה מבוצעים בצינורות נעילה בטוחה של 2 מ"ל עם סיבוב עדין או טלטול ב-RT.
   1. העבירו את אבי העורקים הקבוע לתמיסת חסימה למשך שעתיים לחסימה וחדירה.
      הערה: תמיסת החסימה משתנה בהתאם לנוגדנים הראשוניים והמשניים. לדוגמה, תמיסת חסימה: 0.5 מ"ג/מ"ל CD16/32 (1:100), 10% סרום חמור רגיל, 2% טריטון X-100 ב-PBS (ראה טבלת חומרים)
   2. דגרו על אבי העורקים עם נוגדנים ראשוניים בתמיסת החסימה לעיל (שלב 1.2.1), לדוגמה, CD3e (דילול 1:100), NF200 (דילול 1:200) ו-B220 (דילול 1:200) למשך 24 שעות (ראה טבלת חומרים). שטפו את אבי העורקים ב-PBS למשך 5 דקות למשך 5 פעמים.
   3. דגירה על אבי העורקים עם נוגדנים משניים בסרום חמור רגיל של 10% (דילול של 1:300) ו-4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI; 1 מ"ג/מ"ל) לצביעה גרעינית למשך הלילה (ראה טבלת חומרים). שטפו את אבי העורקים ב-PBS למשך 5 דקות 5 פעמים ואחסנו את אבי העורקים ב-PBS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד להליך ניקוי הרקמות.
      הערה: העבירו את אבי העורקים לצינורות שונים מלאים ב-PBS בכל פעם לשטיפה. מכסים את הצינורות בנייר אלומיניום כדי לשמור אותם בחושך לשלב 1.2.3.
3. ניקוי רקמות TDE
   הערה: כל שלבי הדגירה מבוצעים בצינורות נעילה בטוחה של 2 מ"ל, מסתובבים בעדינות ב-RT, ומכוסים בנייר אלומיניום בחושך. פתרונות עבודה TDE (ראה טבלת חומרים) הם חדירים מאוד ויש לטפל בהם בזהירות במכסה אדים. אסוף והשליך פסולת בהתאם לתקנות המקומיות.
   1. העבירו את אבי העורקים המוכתם לתמיסות עבודה של 20% TDE ודגרו למשך שעה.
   2. העבירו את אבי העורקים לתמיסות עבודה של 47% TDE ודגרו למשך 12 שעות. העבירו את אבי העורקים לתמיסות עבודה של 60% TDE ודגרו במשך 24-36 שעות עד שהדגימות הופכות שקופות באור נראה כדי להתאים ל-RI.
   3. אחסן את אבי העורקים ב-60% TDE ב-RT בחושך עד להדמיה.
      הערה: רענן פתרונות עבודה כל 30 דקות לטווח הדגירה הקצר (למשלample, שלב 1.3.1) וכל 4 שעות לטווח ארוך של דגירה (למשלample, שלב 1.3.2). ניתן להתאים את זמן הדגירה לכל שלב בהתאם לגודל הרקמה כדי לקבל חדירת נוגדנים טובה יותר או שקיפות ניקוי. עבור אבי העורקים של עכבר Apoe^-/- המוקף ברקמת שומן, יש להאריך את זמן הדגירה כראוי.
4. הדמיה של אבי העורקים מנקה TDE באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM)
   1. השתמש בבארות מרווח הדמיה מלבניות דביקות דו-צדדיות הזמינות מסחרית בעובי של 0.2 מ"מ (ראה טבלת חומרים). הדביקו את הבאר למגלשת זכוכית נקייה והעבירו את אבי העורקים הנקי. ודא שההרפתקאות אבי העורקים פונות לכיסוי.
      הערה: הקש בעדינות על אבי העורקים שטוח עם הצד הבלומינלי של אבי העורקים בחלק העליון באמצעות מלקחיים זוויתיים. ערמו בארות מרווח הדמיה מרובות כך שיתאימו לגודל הרקמה במידת הצורך.
   2. הרכיבו את אבי העורקים בטיפות של תמיסת TDE 60%. חבר בזהירות כיסוי לבאר, הימנע מבועות אוויר בין הדגימה לכיסוי.
      הערה: הסר בזהירות את הבועות בעזרת מחט לפני החלקת הכיסוי. אל תשתמש בכמות מוגזמת של תמיסת הרכבה, מכיוון שהדגימה עלולה לצוף.
   3. השתמש במכשיר CLSM הפוך (ראה טבלת חומרים) המצויד במטרת טבילה (רב-תכליתית) פי 20 (NA: 0.75).
      הערה: CLSM מאפשר הדמיה נפחית בעומק של עד 70 מיקרומטר ברזולוציה גבוהה יותר, הדרושה לניתוח קוטר העצב והאינטראקציה בין תאי העצב והחיסון באדוונטיציה של אבי העורקים.
   4. בחר את יעד הטבילה (שמן) של 20x/0.75. כוונן את גלאי הדיודות ההיברידיות על סמך הצבעים המוכתמים. התאם את הגדרות התצוגה ובחר בפורמט XY של 1024 x 1024 פיקסלים להדמיה.
      הערה: לכידת עדשת אובייקט טבילה בשמן מאותתת טוב יותר ממים.
   5. זרוק שמן טבילה (עם גליצרול) באופן שווה לאורך אבי העורקים על הכיסוי. הזז את המטרה פי 63 גס לכיוון הדגימה עד שהיא נוגעת בשמן הטבילה/כיסוי.
   6. הזז את המטרה פי 63 בעדינות מתחת למיקרוסקופ כדי לאתר את אזור העניין. רכוש Z-stack מהצד האדוונטיטי של אבי העורקים הפנימי בגודל צעד של 2-4 מיקרומטר עד לעומק של 60 מיקרומטר עבור הדמיה תלת מימדית.
   7. תן שם לקובץ עם פרטים לדוגמה, סרוק פרטים ושמור את הנתונים.
5. הדמיה של אבי העורקים מנקה TDE באמצעות מיקרוסקופ מולטיפוטון
   1. בצע את שלבים 1.4.1-1.4.2 כדי להרכיב את אבי העורקים על השקופית.
   2. השתמש במיקרוסקופ רב-פוטוני זקוף (ראה טבלת חומרים) המצויד במטרה פי 20 (טבילה במים, NA: 1.00, מרחק עבודה = 2 מ"מ), המאפשר הדמיה נפחית בעומק של עד 1.5 מ"מ.
   3. רכשו חבילות Z מהצד האלומינלי בגודל צעד של 10-15 מיקרומטר עד לעומק של 700 מיקרומטר. תן שם לקובץ ושמור את הנתונים כמו בשלב 1.4.7.

2. צביעה חיסונית של כל הגוף וניקוי רקמות iDISCO

1. הכנת רקמות
   1. בצע את השלבים 1.1.1-1.1.3 לעיל להרדמה, קיבוע העכבר וזילוף.
   2. הסר את העור והאיברים הפנימיים, כולל הטחול, הכבד, הריאות ואיברי מערכת העיכול והרבייה, באמצעות מכשירים כירורגיים. שמור על הלב, אבי העורקים והכליות שלמים באתרם.
   3. נתח את חלק הגוף מעל רמת הסרעפת וקבע את חלק פלג הגוף התחתון עם 4% PFA למשך 1-2 ימים ב-4 מעלות צלזיוס.
      הערה: בצע את הקיבוע, הכביסה והדגירה בצינורות של 50 מ"ל על שייקר מסתובב בעדינות. רענן את התמיסה בצינורות חדשים 2-3 פעמים.
   4. שטפו היטב את הדגימה למשך 10 דקות 3 פעמים ב-RT.
      הערה: העבירו את אבי העורקים לצינורות שונים מלאים ב-PBS בכל פעם.
   5. דגרו את הדגימה בקוקטיילים של הדמיית מוח/גוף שקופים וללא הפרעה ובתמיסת ניתוח חישובי (CUBIC) למשך 48 שעות להסרת צבע.
      הערה: לקבלת תמיסה של 20% מעוקב, ממיסים 25 גרם אוריאה ב-15 מ"ל של Triton X-100 ו-28 מ"ל של Quadrol, ומוסיפים PBS לנפח הסופי של 100 מ"ל. הכן אותו במכסה המנוע מכיוון שהמרכיבים מגרים (ראה טבלת חומרים).
   6. שטפו היטב את הדגימה למשך שעה חמש פעמים ב-PBS ב-RT.
2. צביעת נוגדנים
   הערה: כל שלבי הדגירה מבוצעים בצינורות נעילה בטוחה של 50 מ"ל עם סיבוב עדין או טלטול ב-4 מעלות צלזיוס.
   1. דגרו את הדגימה בתמיסת PBS-gelatin-Triton X-100-serum (PGST) למשך הלילה לחדירה וחסימה.
      הערה: תמיסת החסימה משתנה בהתאם לנוגדנים. לדוגמה, תמיסת חסימה: תמיסת PBS-gelatin-Triton X-100-serum (PGST, ראה טבלת חומרים): 0.2% ג'לטין עור חזיר, 0.5% טריטון X-100 ו-5% סרום עיזים ב-PBS.
   2. דגרו את הדגימה עם נוגדנים ראשוניים בתמיסת PGST, למשלample, NF200 (דילול 1:200, ראה טבלת חומרים) ב-4 מעלות צלזיוס, ונערו בעדינות במשך 10-12 ימים. לאחר מכן, שטפו היטב את הדגימה ב-PGST למשך שעה 5 פעמים ב-RT.
   3. דגרו את הדגימה עם תמיסת נוגדנים משנית (דילול של 1:300) ו-DAPI (1 מ"ג/מ"ל) ב-PGST ב-4 מעלות צלזיוס למשך 7 ימים.
   4. שטפו היטב את הדגימה ב-PGST למשך שעה 5 פעמים ב-RT. העבירו את הדגימה ל-PBS ואחסנו את אבי העורקים ב-PBS ב-4 מעלות צלזיוס לשלבים נוספים.
      הערה: מכסים את הצינורות בנייר אלומיניום כדי לשמור עליהם כהים לשלבים 2.2.3-2.2.4.
3. ניקוי רקמות iDISCO שונה
   הערה: במהלך הניקוי, יש לכסות את הצינורות בנייר אלומיניום כדי למנוע הלבנה/כיבוי אותות עקב חשיפה ישירה לאור טבעי/מלאכותי. כל הריאגנטים האורגניים המשמשים בניקוי DISCO מזיקים, וכל שלבי הפינוי צריכים להיעשות במכסה אדים. ללבוש חלוק מעבדה, כפפות ומסכה בעת התמודדות עם הריאגנטים כדי למנוע שאיפה ומגע עם העור והעיניים. אסוף והשליך את פסולת הפינוי למיכלי פסולת מתאימים במכסה המנוע.
   1. העבר את הדגימות המוכתמות משלב 2.2.4 לסדרה של ריכוזים מוגברים של טטרהידרופוראן (THF, ראה טבלת חומרים) פתרונות עבודה להתייבשות, כלומר 50%, 70%, 90% ו-100% (פעמיים 100%). דגירה למשך 12 שעות לכל ריכוז.
      הערה: יש לדלל את מגיב ה-THF (99%-100%) במים מזוקקים לתמיסות עבודה בריכוזים שונים במכסה המנוע. רענון פתרונות עבודה כל 6 שעות.
   2. העבר את הדגימה לתמיסת דיכלורומתאן מוחלטת (DCM, ראה טבלת חומרים) למשך 3 שעות להסרת שומנים.
   3. העבר את הדגימה לפתרון עבודה תואם RI בנזיל-אלכוהול-בנזיל-בנזואט (BABB) (ראה טבלת חומרים). דגרו במשך 3-6 שעות עד שהרקמה שקופה ובעיקר שקופה באור נראה.
      הערה: להכנת תמיסת עבודה של BABB, מערבבים חלק אחד של בנזיל אלכוהול ו-2 חלקים של בנזיל בנזואט (1:2) בבקבוק זכוכית. יש לנער אותו בעדינות למשך 5 דקות במכסה המנוע.
4. הדמיה של רקמת ניקוי iDISCO באמצעות מיקרוסקופ יריעת אור
   הערה: צלם את הדגימה שנוקה ברגע שהושגה שקיפות אופטימלית. מיקרוסקופ גיליון אור, כגון אולטרה-מיקרוסקופ-II (ראה טבלת חומרים), משמש להדמיה. מלאו את מאגר ההדמיה בתמיסת הפינוי הסופית, תמיסת BABB. היזהר לא לשפוך BABB על המכשיר כדי למנוע נזק למכשיר.
   1. השתמש במטרת אוויר 1x לתמונות בהגדלה נמוכה המכסות את כל רוחב הדגימה כולה. העבירו בעדינות את הדגימה מתמיסת הפינוי על מטלית נייר וייבשו אותה תוך זמן קצר.
      הערה: השתמש במלקחיים קהים כדי למנוע סחיטת הדגימה.
   2. בחר מחזיק מדגם בגודל מתאים על סמך גודל הדגימה/רקמה והצמד את הצד האחורי של הדגימה למחזיק המדגם בעזרת דבק-על.
      הערה: המתן 1-2 דקות עד שהדגימה מחוברת היטב למחזיק הדגימה.
   3. מלאו את מאגר ההדמיה של מיקרוסקופ גיליון האור בתמיסת BABB והניחו לתוכו בעדינות את הדגימה. כוונן את מחזיק המדגם כדי להבטיח שהדגימה מאונכת לגיליון האור ומוארת כהלכה.
   4. הורד את המטרה כדי למקד את הדגימה ולהתאים את הגדרות התצוגה תוך כדי מיקוד כדי view הדגימה כראוי. בחר את גיליון האור המתאים בתוכנת המיקרוסקופ והתאם את רוחבו כדי להאיר באופן שווה את כל שדה התצוגה.
      הערה: במערכת אולטרה-מיקרוסקופ עם תאורת לייזר משני הצדדים, התחל ביישור ומיקוד הלייזר בצד אחד. לאחר ששני הצדדים מוגדרים, הפעל את שני הלייזרים הצדדיים כדי לצפות בתמונת סריקה ממוזגת משתי התאורות.
   5. בחר ערוץ אדום רחוק (680 ננומטר) כדי לדמות מבנים עצביים מוכתמים ב-NF200 ותעלה אוטופלואורסצנטית (488 ננומטר) כדי לדמות אבי עורקים ורקמות חיבור לא מוכתמים. התאם את עוצמת הלייזר בהתאם לעוצמת האות הפלואורסצנטי לקבלת יחס אות לרעש אופטימלי, זמן החשיפה ורוחב גיליון האור.
   6. בחר את מצב הסריקה xyz. הגדר את סריקת z-stack עם צעד z של 2-8 מיקרומטר ובחר חפיפה של 25%-60% לאורך ציר ה-y האורכי של סריקות האריחים (16 סיביות) המכסות את משטחי הגחון והגב של הדגימות כדי לדמות את כל נפח הדגימה (עד 6-8 מ"מ עומק).
   7. תן שם לסריקה עם מידע מפורט, כולל תאריך הסריקה, שם המדגם, הנוגדן בו נעשה שימוש, אובייקטיבי, גורם זום, שלבי z ולייזרים שבהם נעשה שימוש. שמור את הנתונים.
   8. שנה להגדלה גבוהה יותר (2x או 4x) באמצעות פונקציית זום כדי לדמות אזורי עניין ספציפיים בגוף.
   9. בצע את השלבים 2.4.4-2.4.7 לעיל להדמיה ושמור את הנתונים.

3. עיבוד תמונה וניתוחים

הערה: יש צורך בתחנת עבודה לעיבוד בעוצמה גבוהה לצורך העיבוד. ודא גיבוי נתונים מיד לאחר העיבוד עקב נפח ההדמיה הגבוה (5-100 GB לתמונה).

1. עיבוד תמונה של תמונות CLSM ורב-פוטונים
   1. טען את התמונות המרוצפות באריחי Z ממיקרוסקופים CLSM ורב-פוטונים לתחנת העבודה לעיבוד תמונה המצוידת בתוכנת Las X, Imaris (תוכנת ניתוח תמונה) או פיג'י להדמיה, פילוח וכימות תלת מימדיים ודו-ממדיים (2D).
   2. כדי לקודד בצבע את עומק הנפח של תא או מבנה, השתמש בתוכנת שחזור תמונה (ראה טבלת חומרים) כדי לפרק את התמונה הגולמית וליצור הקרנה בעוצמה מקסימלית של הנתונים המפותלים באמצעות קידוד צבע זמני בלאס X או פיג'י.
2. עיבוד תמונה של תמונות גיליון אור
   1. טען את סדרת תמונות ה-TIFF באריחי Z-stack לתוכנת פיג'י. תפר תמונות עם תוסף התפירה של פיג'י ושמור תמונות תפורות בפורמט TIFF.
      הערה: במידת הצורך, דחוס את התמונות התפורות בפורמט LZW כדי לאפשר עיבוד מהיר עם תוכנות שונות.
   2. טען את התמונות התפורות בתוכנת הדמיה תלת-ממדית (ראה טבלת חומרים) לצורך פילוח תמונה. עקוב ידנית אחר המבנים העצביים וכלי הדם בציר xyz. למעקב ידני אחר סיבי עצב קטנים, בחר ידנית את אותות NF200⁺ פיקסל אחר פיקסל בכל מישור z לאורך כל הנתיב של סיב העצב בין אבי העורקים לגרעין.
   3. טען תמונות מעובדות מראש לתוכנת ניתוח תמונות (ראה טבלת חומרים) ליצירת וידאו, הדמיה דו-ממדית ותלת-ממדית של התמונות.
   4. השתמש באוטופלואורסצנציה כדי לפלח את אבי העורקים ורקמות החיבור, כולל בלוטות לימפה ושרירים, בתוכנת ניתוח התמונה. החל פסאודו-צבעים נפרדים בתוכנת ניתוח התמונות כדי לדמיין מקטעים מובהקים של אבי העורקים כגון דופן אבי העורקים ורובד.
   5. השתמש בפונקציית השוואת היסטוגרמה אדפטיבית מוגבלת ניגודיות (CLAHE) בתוכנת פיג'י כדי לשפר את הניגודיות המקומית על רקע התמונות המעובדות.

תוצאות

כדי להדגים את המיקרואנטומיה של אבי העורקים הבריא והחולה השלם, ולחשוף את החיבורים הפיזיים בין מערכת החיסון, מערכת העצבים ומערכת הלב וכלי הדם במודלים של טרשת עורקים בעכברים, השתמשנו בשתי גישות משלימות לניקוי רקמות: ניקוי TDE של אבי העורקים המבודד, וניקוי iDISCO של העכבר כולו (

Discussion

ניתן לראות בטרשת עורקים מחלה דלקתית טרנסמורלית של עורקים המערבת את כל שלוש השכבות של דופן העורק. יתר על כן, העורקים מוקפים ברקמות השומן הפרי-וסקולריות והעצביות. במהלך התקדמות טרשת עורקים, כל אחת מהרקמות הללו עוברת שינויים תאיים ומבניים ניכרים, מה שמחייב שיטות לרכישת גיש?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2’-thiodiethanol (TDE)	Sigma	166782	Clearing reagent
Amira	Thermo Fisher Scientific		3D visualization software; Image processing software used for manual segmentation and tracing in 3D images
Benzyl alcohol	Sigma	W213713	Clearing reagent
Benzyl benzoate	Sigma	B6630	Clearing reagent
CD16/32	eBioscience	14-0161-82	Blocking solution
Confocal laser scanning microscope	Leica Microsystems	TCS- SP8 3X	Imaging device for multidimensional high-resolution imaging of intact biological tissues or sections with high specificity at subcellular resolution.
DAPI	Invitrogen	D3571	Nuclei marker
Dichloromethane (DCM)	Sigma	270997	Clearing reagent
Dissecting pan-black wax	Thermo Scientific	S17432	Aorta dissection and fixation
Dissection stereomicroscope	Leica Microsystems	Stemi 2000	Mouse organ dissection
Ethanol	Sigma	E7023	Defection
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Roth	8040.1	Perfusion buffer
Fiji	(ImageJ, NIH)		Open source image processing software for 2D and 3D images
Goat anti-Hamster IgG, Cy3	Dianova	127-165-099	Secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 680	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	A-21109	Secondary antibody
Goat anti-Rat IgG, Cy5	Dianova	712-175-150	Secondary antibody
Hamster Anti-CD3e	BD Bioscience	145-2C11	Pan-T cell marker
Huygens Professional	Scientific Volume Imaging, The Netherlands	Version 19.10	Image restoration software; Image processing software used mainly for deconvolution of 2D and 3D images
Image processing workstation	MIFCOM	MIFCOM X5	Image processing workstation equipped with all image processing software including Leica application suite X, Fiji, and Imaris for post-processing of images acquired by confocal, multiphoton and light sheet microscopes
Imaris	Bitplane	Version 8.4	Image analysis software; Image processing software used for automated segmentation of 3D images
Incubator and rotator	Marshall Scientific	Innova 4230	Incubation and rotation device during tissue clearing
iSpacer	Sunjin Lab	IS4020	Rectangular well as the sample holder
Ketamine	Livisto		Anesthetic
Leica Application Suite X (LAS-X)	Leica Microsystems	Version 3.5	Image processing software for the images acquired with Leica microscope
Light microscope	Leica Microsystems	DM LB	Imaging device for bright filed imaging
Light sheet  microscope	LaVision BioTech	Ultramicroscope II	Imaging technique for fast, high-resolution imaging of large biological specimens or whole mouse with low light exposure by rapidly acquiring images of thin optical sections.
Multiphoton microscopy	Leica Microsystems	TCS-SP5II MP	Imaging modality for multidimensional, high-resolution imaging of intact and viable biological tissues at sub-cellular and molecular level over prolonged periods of time, deep in the sample and with minimal invasion.
Normal goat serum	Sigma	G9023	Blocking solution
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P-6148	Fixation
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma	P4417-100TAB	Washing buffer
Porcine skin gelatin	Sigma	G1890	Incubation buffer
Quadrol	Sigma	122262	CUBIC clearing reagent
Rabbit Anti-NF200	Sigma	N4142	Pan-neuronal marker
Rat Anti-B220	BD Bioscience	RA3-6B2	Pan-B cell marker
Sucrose	Sigma	90M003524V	Dehydration
Sytox	Thermo Fisher Scientific	S11380	Nuclei marker
Tetrahydrofuran	Sigma	401757	Clearing reagent
Triton X-100	Roth	3051.1	Penetration
Urea	Sigma	U5128	CUBIC clearing reagent
Xylene	Fisher Chemical	x/0250/17	Anesthetic