动脉粥样硬化中主动脉组织的三维成像

摘要

在这里，我们提出了优化的组织透明化方案，以对小鼠主动脉进行三维 （3D） 成像。我们描述了用于免疫染色、光学透明化和成像的最新程序，旨在确定周围神经系统与动脉粥样硬化斑块和动脉粥样硬化外膜的解剖学接近程度。

摘要

最近的研究推进了对动脉粥样硬化作为一种透壁慢性炎症性疾病的理解，涉及动脉壁的所有三层，包括内膜斑块、中层和外膜，形成动脉的外结缔组织涂层。我们最近的研究表明，外膜被周围神经系统用作到达所有组织细胞的管道。我们还发现，周围神经系统，即感觉和交感神经系统，经历了重大的重塑过程，涉及动脉粥样硬化斑块附近轴突网络的新生。在这种情况下，了解神经网络的结构及其与患病动脉血管成分的相互作用对于更好地了解心血管疾病的发病机制具有重大前景。为了实现这些目标，需要将完整、健康和患病动脉的亚细胞结构及其周围的血管周围隔室可视化的方法。组织透明化可以对原本无法接近的较大组织隔室进行完整的深层组织成像。它通过集成标记、清除、高级显微成像和图像处理工具，允许对完整动脉进行体积成像。在这里，我们描述了两种不同但互补的被动组织透明化方法，即基于水性的 2,2-硫代二乙醇 （TDE） 透明化和基于溶剂的免疫标记启用的溶剂透明化器官 （iDISCO） 透明化三维成像，以对孤立的主动脉段或整个主动脉进行原位成像整个小鼠。

引言

组织学技术通过组织/器官的切片提供了对生物样本的基本了解。然而，直到最近，在三个视图 （3D） 中描绘复杂的解剖细胞/细胞和组织/组织相互作用一直难以实现。这种未满足的需求在健康和疾病条件下的心血管系统环境中尤为明显。由于光吸收和光散射，使它们本质上不透明，因此过去对完整组织进行成像一直具有挑战性。组织透明化通过最大限度地减少这些限制使完整的生物样品透明。组织透明化技术的最新发展使未切片透明组织的高分辨率 3D 成像成为可能，从而以微米级分辨率为整个器官的细胞和结构微结构提供相当大的见解，从而能够定义解剖连接网络。

动脉粥样硬化涉及动脉壁的三层，包括内膜内层、中间中层和外结缔组织层，称为外膜。几十年来，动脉内层的动脉粥样硬化斑块一直是研究的常规目标 ^1,2。然而，外膜层包含周围神经系统的血管、淋巴管和神经纤维。此外，外膜与血管周围脂肪组织和神经元组织成分相连，包括周围神经和血管周围神经节 ^3,4。众所周知，周围神经使用外膜作为到达远处目标组织甚至细胞的管道⁵。我们最近的研究推动了理解主要生物系统（包括免疫系统、神经系统和心血管系统）的多层相互作用的进展。我们将这些相互作用称为神经免疫-心血管接口 ^6,7。在动脉粥样硬化形成过程中，动脉壁成分经历稳健的重组和重塑。例如，在内膜动脉粥样硬化斑块进展附近，免疫细胞聚集形成，神经元轴突新生发生在小鼠主动脉外膜 ^6,8,9。随着动脉粥样硬化的进展，免疫细胞聚集体发育成结构良好的动脉三级淋巴器官 （ATLO），具有不同的 T 细胞、B 细胞和浆细胞区域¹⁰。然而，要在 3D 中描绘这些变化，由于膜透化不足和固有的光散射，完整组织的高分辨率成像一直具有挑战性¹¹。组织透明化方法克服了传统组织学方法^{11、12、13、14、15} 的主要局限性，通过均匀调整折射率 （RI） 增强了抗体的渗透性，以深入完整的组织或器官，从而获得微米级分辨率图像，在体素中具有更高的成像深度。样品的 RI 可以与甘油 （RI 1.46） 或浸油 （RI 1.52） 匹配，从而大大减少光散射和球面像差，从而实现高分辨率。整个器官或全身组织透明化技术的最新进展，例如水性 2,2-硫代二乙醇 （TDE） 和基于免疫标记的溶剂透明化器官 3D 成像 （iDISCO），以及体积成像技术（包括共聚焦、多光子和光片显微镜成像）允许通过构建其连接图谱来重建血管结构的显微解剖结构^11,16.以 3D 形式可视化这些细胞和结构连接可以提供新的见解，以回答迄今为止尚未解决的生物学问题。

研究方案

本研究是根据当地和国家动物使用和护理委员会的指导方针进行的。本研究使用维持标准啮齿动物食物饮食的 C57BL/6J 背景上的高脂血症雄性 Apoe^-/- 小鼠，这些小鼠在衰老过程中自发发展为动脉粥样硬化。

1. 离体主动脉和 TDE 清除的整装成像

1. 组织制备
   1. 每只小鼠制备 150 mg/kg 氯胺酮和 30 mg/kg 甲苯噻嗪（参见 材料表）的麻醉剂。通过腹膜内注射对小鼠进行深度麻醉，并通过对深部疼痛试验无反应来证实这一点。
      注意:注射剂的浓度和体积如下:氯胺酮 100 mg/mL;甲苯噻嗪 20 毫克/毫升;注射体积 50:50 氯胺酮和甲苯噻嗪的 3 μL/g 混合物。
   2. 将鼠标放在覆盖有手术纸巾的泡沫板上，并用胶带将手臂和腿固定在仰卧位。用 75% 乙醇对胸部进行消毒（见 材料表），并用 1 mL 一次性注射器通过左心室采血以去除血液以获得更好的灌注。
      注意:也可以使用通过开胸术采集心脏血液。
   3. 在胸部做一个中线切口，露出心脏，在右心房做一个小切口，以便进行经心灌注。用 10 mL 5 mM 乙二胺四乙酸（EDTA;参见 材料表）的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 溶液通过左心室灌注小鼠 5 分钟，然后用 20 mL PBS 灌注 5-10 分钟，直到血液被冲走。最后，用 10 mL 4% 多聚甲醛 （PFA） 灌注 20 分钟。
      注意:所有程序都可以在室温 （RT） 下使用压力为 100-125 mm Hg 的蠕动灌注泵进行。灌注针通过与血液提取相同的孔插入小鼠心脏。
   4. 使用手术器械切除内脏器官，包括脾脏、肝脏、肺、胃肠道和生殖器官。原 位保持心脏、主动脉和肾脏完整。
      注意:用于解剖和切除器官的手术器械有解剖剪刀、细虹膜剪刀、弹簧剪刀、钝镊子、弯曲镊子和弯曲细镊子。
   5. 在解剖立体显微镜（30-40 倍放大倍率）下，将整个主动脉从升主动脉暴露到髂分叉处。小心地去除胸腺和脂肪组织，不要损伤主动脉。
      注意:小心不要割伤主动脉。对于 Apoe ^{- / -} 小鼠，保持主动脉的最小周围血管周围脂肪组织以连接结构。
   6. 将整个主动脉收获到装满 PBS 的培养皿中。将主动脉分成不同的段，并使用虹膜或弹簧剪刀纵向劈开整个主动脉，按照 图 1A 中指示的顺序和方向暴露内膜表面，以进行 TDE 清除。
   7. 将 en face 主动脉以 Y 形固定在平坦的黑色蜡板上，如图 1A 所示。在 4% PFA 中于 4 °C 下固定过夜。
      注意:固定前将主动脉固定在蜡板上，以避免在以下步骤中折叠和卷曲。
   8. 解开主动脉并将其转移到 PBS 中。彻底清洗主动脉 5 分钟，持续 5 次。
      注:每次将主动脉转移到装有 PBS 的不同试管中进行洗涤。
2. 面主动脉抗体染色
   注:所有孵育步骤均在 2 mL 安全锁管中进行，并在室温下轻轻旋转或摇晃。
   1. 将固定的主动脉转移到封闭溶液中 2 小时以进行封闭和透化。
      注:封闭溶液因一抗和二抗而异。例如，封闭溶液:0.5 mg/mL CD16/32 （1:100），10% 正常驴血清，2% Triton X-100 的 PBS 溶液（参见 材料表）
   2. 将主动脉与上述封闭溶液中的一抗孵育（步骤 1.2.1），例如 CD3e（1:100 稀释）、NF200（1:200 稀释）和 B220（1:200 稀释）24 小时（参见 材料表）。在 PBS 中洗涤主动脉 5 分钟，持续 5 次。
   3. 将主动脉与 10% 正常驴血清（1:300 稀释）和 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI;1 mg/mL） 中的二抗孵育过夜，用于核染色过夜（参见 材料表）。在 PBS 中洗涤主动脉 5 分钟 5 次，并将主动脉储存在 4 °C 的 PBS 中，直至组织透明化程序。
      注:每次将主动脉转移到装有 PBS 的不同试管中进行洗涤。用铝箔盖住试管，让它们在黑暗中用于步骤 1.2.3。
3. TDE 组织透明化
   注:所有孵育步骤均在 2 mL 安全锁管中进行，在 RT 下轻轻旋转，并在黑暗中用铝箔覆盖。TDE（参见 材料表）工作溶液具有高度渗透性，应在通风橱中小心处理。根据当地法规收集和丢弃废物。
   1. 将染色的主动脉转移到 20% TDE 工作溶液中并孵育 1 小时。
   2. 将主动脉转移到 47% TDE 工作溶液中并孵育 12 小时。将主动脉转移到 60% TDE 工作溶液中并孵育 24-36 小时，直到样品在可见光下变得透明以匹配 RI。
   3. 将主动脉储存在 60% TDE 中，在 RT 下避光直至成像。
      注意:短期孵育每 30 分钟刷新一次工作溶液（例如，步骤 1.3.1），长期孵育每 4 小时刷新一次（例如，步骤 1.3.2）。每个步骤的孵育时间可以根据组织大小进行调整，以获得更好的抗体渗透或清除透明度。对于被脂肪组织包围的 Apoe^-/- 小鼠主动脉，应适当延长孵育时间。
4. 使用共聚焦激光扫描显微镜 （CLSM） 对 TDE 清除主动脉进行成像
   1. 使用市售的厚度为 0.2 mm 的双面粘性矩形成像垫片孔（参见 材料表）。将孔粘在干净的载玻片上并转移已清除的主动脉。确保 en face 主动脉外膜面向盖玻片。
      注意:使用倾斜的镊子轻轻敲击 en face 主动脉，将 en face 主动脉的腔侧放在顶部。如有必要，堆叠多个成像垫片孔以匹配组织大小。
   2. 用 60% TDE 溶液滴加主动脉。小心地将盖玻片连接到孔上，避免样品和盖玻片之间出现气泡。
      注意:在盖玻片之前用针小心地去除气泡。请勿使用过量的封片剂，因为样品可能会四处漂浮。
   3. 使用配备 20 倍浸入（多）物镜（NA:0.75）的倒置 CLSM 仪器（参见 材料表）。
      注意:CLSM 允许以更高的分辨率进行长达 70 μm 的体积成像，这是分析主动脉外膜中神经直径和神经-免疫细胞相互作用所必需的。
   4. 选择 20x/0.75 浸没（油）物镜。根据染色染料调整混合二极管检测器。调整显示设置并选择 1024 x 1024 像素 XY 格式进行成像。
      注:油浸物镜捕获的信号比水更好。
   5. 沿盖玻片上的主动脉均匀滴入浸油（含甘油）。将 63 倍物镜粗略地移向样品，直到它接触到浸油/盖玻片。
   6. 在显微镜下精细移动 63 倍物镜以定位感兴趣区域。以 2-4 μm 的步长从 en face 主动脉的外膜侧采集 Z 堆栈，深度可达 60 μm，用于 3D 成像。
   7. 使用示例详细信息、扫描详细信息命名文件，然后保存数据。
5. 使用多光子显微镜对 TDE 清除主动脉进行成像
   1. 按照步骤 1.4.1-1.4.2 将 en face 主动脉安装在载玻片上。
   2. 使用配备 20 倍物镜（水浸，NA:1.00，工作距离 = 2 mm）的正置多光子显微镜（参见 材料表），允许高达 1.5 mm 的体积成像。
   3. 以 10-15 μm 的步长从 700 μm 深度从腔腔侧采集 Z 堆栈。命名文件并保存数据，如步骤 1.4.7 所示。

2. 全身免疫染色和 iDISCO 组织透明化

1. 组织制备
   1. 按照上述步骤 1.1.1-1.1.3 进行麻醉、固定鼠标和灌注。
   2. 使用手术器械切除皮肤和内脏器官，包括脾脏、肝脏、肺、胃肠道和生殖器官。原 位保持心脏、主动脉和肾脏完整。
   3. 解剖隔膜水平以上的身体部位，并在 4 °C 下用 4% PFA 固定下半身 1-2 天 （s）。
      注:在轻轻旋转的摇床上，在 50 mL 试管中进行固定、洗涤和孵育。在新试管中刷新溶液 2-3 次。
   4. 在 RT 下彻底洗涤样品 10 分钟 3 次。
      注意:每次将主动脉转移到充满 PBS 的不同管中。
   5. 将样品在 20% 透明、无遮挡的脑/身体成像混合物和计算分析 （CUBIC） 溶液中孵育 48 小时以进行脱色。
      注:对于 20% 立方溶液，将 25 g 尿素溶解在 15 mL Triton X-100 和 28 mL Quadrol 中，并加入 PBS 至最终体积为 100 mL。在引擎盖中准备它，因为成分具有刺激性（参见 材料表）。
   6. 在 RT 下用 PBS 彻底洗涤样品 1 小时 5 次。
2. 抗体染色
   注:所有孵育步骤均在 50 mL 安全锁管中进行，并在 4 °C 下轻轻旋转或摇动。
   1. 将样品在 PBS-明胶-Triton X-100-血清 （PGST） 溶液中孵育过夜，以进行透化和封闭。
      注:封闭溶液因抗体而异。例如，封闭溶液:PBS-明胶-Triton X-100-血清（PGST，参见 材料表）溶液:0.2% 猪皮明胶、0.5% Triton X-100 和 5% 山羊血清的 PBS 溶液。
   2. 将样品与 PGST 溶液中的一抗，例如 NF200（1:200 稀释，参见 材料表）在 4 °C 下孵育，然后轻轻摇动 10-12 天。然后，在 RT 下在 PGST 中彻底洗涤样品 1 小时 5 次。
   3. 将样品与二抗溶液（1:300 稀释）和 DAPI （1 mg/mL） 在 PGST 中于 4 °C 下孵育 7 天。
   4. 在 RT 下在 PGST 中彻底洗涤样品 1 小时 5 次。将样品转移到 PBS 中，并将主动脉储存在 4 °C 的 PBS 中以用于进一步的步骤。
      注:在步骤 2.2.3-2.2.4 中，用铝箔盖住试管，使其保持黑暗。
3. 改良的 iDISCO 组织透明化
   注意:在清除过程中，应用铝箔覆盖管子，以避免由于自然光/人造光直接照射而导致信号漂白/淬灭。DISCO 清除中使用的所有有机试剂都是有害的，所有清除步骤都应在通风橱中进行。处理试剂时，请穿上实验服、手套和口罩，以避免吸入和接触皮肤和眼睛。收集清理废物并将其倾倒到引擎盖中适当的废物容器中。
   1. 将步骤 2.2.4 中的染色样品转移到一系列浓度增加的四氢呋喃（THF，参见 材料表）脱水工作溶液中，即 50%、70%、90% 和 100%（100% 的两倍）。每个浓度孵育 12 小时。
      注:在蒸馏水中稀释 THF 试剂 （99%-100%），以获得通风橱中不同浓度的工作溶液。每 6 小时刷新一次工作溶液。
   2. 将样品转移到无水二氯甲烷（DCM，参见 材料表）溶液中 3 小时以去除脂质。
   3. 将样品转移到匹配的 RI 匹配苯甲醇-苄基-苯甲酸盐 （BABB） 工作溶液中（参见 材料表）。孵育 3-6 小时，直到组织半透明并且在可见光下大部分透明。
      注:要制备 BABB 工作溶液，请在玻璃瓶中混合 1 份苯甲醇和 2 份苯甲酸苄酯 （1:2）。在引擎盖中轻轻摇晃 5 分钟。
4. 使用光片显微镜对 iDISCO 透明化组织进行成像
   注意:一旦达到最佳透明度，就立即对清除的样品进行成像。光片显微镜，如超显微镜-II（见 材料表），用于成像。用最终的透明化溶液 BABB 溶液填充成像储液槽。小心不要将 BABB 溅到仪器上，以免损坏仪器。
   1. 使用 1 倍空气物镜拍摄覆盖整个样品整个宽度的低放大倍率图像。将样品从透明溶液中轻轻转移到纸布上，并很快擦干。
      注意:使用钝镊子以避免挤压样品。
   2. 根据样品/组织大小选择合适尺寸的样品架，并用强力胶将样品的背面连接到样品架上。
      注:等待 1-2 分钟，直到样品牢固地连接到样品架上。
   3. 用 BABB 溶液填充光片显微镜的成像储液器，然后将样品轻轻放入其中。调整样品架，确保样品垂直于光片并正确照明。
   4. 降低物镜以聚焦样品，并在聚焦时调整显示设置以正确查看样品。在显微镜软件中选择合适的光片并调整其宽度以均匀照亮整个视场。
      注意:在具有两侧激光照明的超显微镜系统中，首先将激光对准并聚焦在一侧。设置两侧后，激活两侧激光器以观察来自两种照明的合并扫描图像。
   5. 选择一个远红通道 （680 nm） 对 NF200 染色的神经元结构进行成像，选择一个自发荧光通道 （488 nm） 对未染色的主动脉和结缔组织进行成像。根据荧光信号强度调整激光功率，以获得最佳信噪比、曝光时间和光片宽度。
   6. 选择 x-y-z 扫描模式。将 z 堆栈扫描设置为 2-8 μm 的 z 步长，并沿覆盖样品腹面和背表面的平铺扫描（16 位）的纵向 y 轴选择 25%-60% 的重叠，以对整个样品体积（深度可达 6-8 毫米）进行成像。
   7. 使用详细信息命名扫描，包括扫描日期、样品名称、使用的抗体、物镜、缩放系数、z 步长和使用的激光。保存数据。
   8. 通过放大功能更改为更高的放大倍率（2 倍或 4 倍），以对感兴趣的特定身体区域进行成像。
   9. 按照上面的步骤 2.4.4-2.4.7 进行成像并保存数据。

3. 图像处理和分析

注意:处理需要一个高功率的处理工作站。由于成像量大（每个映像 5-100 GB），请确保在处理后立即备份数据。

1. CLSM 和多光子图像的图像处理
   1. 将 CLSM 和多光子显微镜的 Z 堆栈平铺图像加载到配备 Las X、Imaris（图像分析软件）或 Fiji 软件的图像处理工作站，用于 3D 和二维 （2D） 可视化、分割和量化。
   2. 要对细胞或结构的体积深度进行颜色编码，请使用图像恢复软件（参见 材料表）对原始图像进行去卷积，并使用 Las X 或 Fiji 中的时间颜色编码生成去卷积数据的最大强度投影。
2. 光片图像的图像处理
   1. 将 Z 堆栈平铺 TIFF 图像系列加载到 Fiji 软件。使用斐济的拼接插件拼接图像，并以 TIFF 格式保存拼接的图像。
      注意:如果需要，将拼接的图像压缩为 LZW 格式，以便使用不同的软件进行快速处理。
   2. 将拼接的图像加载到 3D 可视化软件中（请参阅 材料表）以进行图像分割。在 x-y-z 轴上手动追踪神经元和血管结构。对于小神经纤维的手动追踪，沿着主动脉和神经节之间神经纤维的整个路径，在每个 z 平面上手动逐个像素地选择 NF200⁺ 信号。
   3. 将预处理后的图像加载到图像分析软件中（参见 材料表），用于图像的视频生成、2D 和 3D 可视化。
   4. 在图像分析软件中使用自发荧光分割主动脉和结缔组织，包括淋巴结和肌肉。在图像分析软件中应用单独的伪彩色，以可视化不同的主动脉段，例如主动脉壁和斑块。
   5. 使用 Fiji 软件中的对比度限制自适应直方图均衡化 （CLAHE） 功能来增强处理图像背景的局部对比度。

结果

为了证明完整健康和患病主动脉的微观解剖结构，并揭示动脉粥样硬化小鼠模型中免疫系统、神经系统和心血管系统之间的物理连接，我们使用了两种互补的组织透明化方法:离体主动脉的 TDE 清除和整个小鼠的 iDISCO 清除（图 1）。全安装免疫染色后，用一系列 TDE 工作溶液清除 enface 主动脉。RI 匹配在 1.4-1.5，具体取决于最后一步的 TDE 浓度，...

讨论

动脉粥样硬化可被视为动脉透壁炎症性疾病，累及动脉壁的所有三层。此外，动脉被血管周围脂肪和神经元组织包围。在动脉粥样硬化进展过程中，这些组织中的每一个都经历了相当大的细胞和结构改变，这需要方法获得对健康和患病动脉周围完整组织的亚细胞光学访问。这里提供这些方法是为了更好地了解细胞 - 细胞和细胞 - 组织相互作用，并促进对心血管疾病发病机...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2’-thiodiethanol (TDE)	Sigma	166782	Clearing reagent
Amira	Thermo Fisher Scientific		3D visualization software; Image processing software used for manual segmentation and tracing in 3D images
Benzyl alcohol	Sigma	W213713	Clearing reagent
Benzyl benzoate	Sigma	B6630	Clearing reagent
CD16/32	eBioscience	14-0161-82	Blocking solution
Confocal laser scanning microscope	Leica Microsystems	TCS- SP8 3X	Imaging device for multidimensional high-resolution imaging of intact biological tissues or sections with high specificity at subcellular resolution.
DAPI	Invitrogen	D3571	Nuclei marker
Dichloromethane (DCM)	Sigma	270997	Clearing reagent
Dissecting pan-black wax	Thermo Scientific	S17432	Aorta dissection and fixation
Dissection stereomicroscope	Leica Microsystems	Stemi 2000	Mouse organ dissection
Ethanol	Sigma	E7023	Defection
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Roth	8040.1	Perfusion buffer
Fiji	(ImageJ, NIH)		Open source image processing software for 2D and 3D images
Goat anti-Hamster IgG, Cy3	Dianova	127-165-099	Secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 680	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	A-21109	Secondary antibody
Goat anti-Rat IgG, Cy5	Dianova	712-175-150	Secondary antibody
Hamster Anti-CD3e	BD Bioscience	145-2C11	Pan-T cell marker
Huygens Professional	Scientific Volume Imaging, The Netherlands	Version 19.10	Image restoration software; Image processing software used mainly for deconvolution of 2D and 3D images
Image processing workstation	MIFCOM	MIFCOM X5	Image processing workstation equipped with all image processing software including Leica application suite X, Fiji, and Imaris for post-processing of images acquired by confocal, multiphoton and light sheet microscopes
Imaris	Bitplane	Version 8.4	Image analysis software; Image processing software used for automated segmentation of 3D images
Incubator and rotator	Marshall Scientific	Innova 4230	Incubation and rotation device during tissue clearing
iSpacer	Sunjin Lab	IS4020	Rectangular well as the sample holder
Ketamine	Livisto		Anesthetic
Leica Application Suite X (LAS-X)	Leica Microsystems	Version 3.5	Image processing software for the images acquired with Leica microscope
Light microscope	Leica Microsystems	DM LB	Imaging device for bright filed imaging
Light sheet  microscope	LaVision BioTech	Ultramicroscope II	Imaging technique for fast, high-resolution imaging of large biological specimens or whole mouse with low light exposure by rapidly acquiring images of thin optical sections.
Multiphoton microscopy	Leica Microsystems	TCS-SP5II MP	Imaging modality for multidimensional, high-resolution imaging of intact and viable biological tissues at sub-cellular and molecular level over prolonged periods of time, deep in the sample and with minimal invasion.
Normal goat serum	Sigma	G9023	Blocking solution
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P-6148	Fixation
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma	P4417-100TAB	Washing buffer
Porcine skin gelatin	Sigma	G1890	Incubation buffer
Quadrol	Sigma	122262	CUBIC clearing reagent
Rabbit Anti-NF200	Sigma	N4142	Pan-neuronal marker
Rat Anti-B220	BD Bioscience	RA3-6B2	Pan-B cell marker
Sucrose	Sigma	90M003524V	Dehydration
Sytox	Thermo Fisher Scientific	S11380	Nuclei marker
Tetrahydrofuran	Sigma	401757	Clearing reagent
Triton X-100	Roth	3051.1	Penetration
Urea	Sigma	U5128	CUBIC clearing reagent
Xylene	Fisher Chemical	x/0250/17	Anesthetic