A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
يحدد هذا البروتوكول ثقافة الخلايا الكيراتينية التي تم الحصول عليها حديثا (المقطع 0) لاستخدامها في تصوير الخلايا الحية.
كان تتبع الخلايا الجذعية وسلوك السلف الملتزم على مستوى الخلية المفردة في جلد الإنسان يمثل تحديا في الجسم الحي وفي المختبر. سمح تصوير الخلايا الحية بإحراز تقدم كبير في القدرة على تحديد الاختلافات بين الخلايا الجذعية للخلايا الكيراتينية وسلوك السلف الملتزم. تصوير الخلايا الحية هو طريقة متطورة وصعبة إلى حد ما لدراسة سلوك الخلايا الكيراتينية في المختبر. تم تطوير هذا البروتوكول لزراعة الخلايا الكيراتينية بكثافة بذر منخفضة ، مما يتيح التصوير الفوتوغرافي بفاصل زمني طويل الأمد نسبيا ومراقبة سلوك الخلية الفردية. ينمو مرور 0 الخلايا الكيراتينية بكثافة نسيلة ، ويسمح التصوير الفوتوغرافي بفاصل زمني بتوثيق انقسامات الخلايا الفردية ووقت حدوثها. لتحقيق أقصى قدر من الأهمية البيولوجية ، يتم وضع الخلايا الكيراتينية البشرية المعزولة حديثا في المختبر. ويركز هذا النهج على الانتشار. ومع ذلك ، يمكن تكييف هذا البروتوكول للاستخدام في تطبيقات تصوير الخلايا الحية الأخرى التي تقيس سلوك الخلية الفردية ، مثل قياس هجرة الخلايا والتئام الجروح والحركة.
الهدف من هذا البروتوكول هو توفير القدرة على تتبع الخلايا الكيراتينية الفردية في المزرعة على مدى فترة طويلة نسبيا (عدة أسابيع) تم تمكينها من خلال كثافة البذر المنخفضة والتصوير الفوتوغرافي بفاصل زمني. يتيح تصوير الخلايا الحية بكثافة منخفضة للباحثين الفرصة لتصور سلوك الخلية في المختبر على مستوى خلية واحدة. على الرغم من أنه غير ممكن في زراعة الخلايا التقليدية ، إلا أن تصوير الخلايا الحية يجعل من الممكن تطوير أشجار النسب في الوقت الفعلي ، دون استخدام الملصقات ، والتي يمكن للمرء من خلالها التأكد من المعلومات المتعلقة بحركية الانقسام ، مثل مدة دورة الخلية ونسبة انقسامات التكاثر والتمايز في المستعمرة. كما يسمح بدراسة هجرة الخلايا وحركتها. قد يكون الأمر صعبا من الناحية الفنية ، مع الجوانب التي تحتاج إلى تحسين ، اعتمادا على نوع الخلية والبيانات التي سيتم التقاطها. استخدمت مختبرات أخرى الخلايا الكيراتينية لحديثي الولادة و / أو الخلايا الكيراتينية التي يسهلنموها 1.
ومع ذلك ، فإن خطوط الخلايا التي تخضع لمرور متكرر تختلف اختلافا كبيرا في السلوك والتشكل عن حالتها في الجسم الحي 2. للحصول على أكبر أهمية بيولوجية من أجل الحصول على أقرب سلوك في الجسم الحي ، يتم استخدام مرور 0 خلايا. في مجموعات الخلايا الكيراتينية ، من الممكن التمييز بين الخلايا الجذعية والسلف الملتزم دون فرز أو تسميات لأن هناك اختلافات واضحة في سلوك الانقسام يمكن ملاحظتها من خلال تصوير الخلايا الحية3.
نحن نستخدم تصوير الخلايا الحية لدراسة حركية تكاثر الخلايا الكيراتينية. تم استخدام نهج مماثل لدراسة حركة خلايا الورم الميلانيني الجلدي المزروعة مع الخلايا الكيراتينية4 ، وهجرة الخلايا الملتصقة لمقايسات الخدش5 ، وكيف تؤثر مثبطات ROCK على تكاثر الخلايا الكيراتينية6. تم تصميم هذا البروتوكول خصيصا لزراعة الخلايا لتسهيل تتبع النسب عن طريق تصوير الخلايا الحية ، على الرغم من أنه يمكن تكييفه لأغراض أخرى.
يحدد هذا البروتوكول عزل مرور 0 خلايا كيراتينية لغرض تصوير الخلايا الحية ، ويناقش المضاعفات التي قد تنشأ ، ويوفر الاعتبارات التي قد تتطلب تعديلات على البروتوكول (الشكل 1).
مطلوب موافقة من لجنة البحوث البشرية التابعة للمؤسسة لاستخدام الأنسجة البشرية. غالبا ما يتم الحصول على عينات بشرية للبحث من مصادر تجارية (على سبيل المثال ، ATCC ، وتقنية خلايا شريان الحياة ، و Zen-Bio). تستخدم دراساتنا الأنسجة المهملة في وقت العمليات الجراحية أو عينات خزعة الجلد المأخوذة خصيصا لأغراض الدراسة. تتطلب هذه الحالات موافقات وإجراءات موافقة مختلفة. يتم الحصول على جميع المناديل بعد موافقة لجنة البحوث البشرية بجامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو ، باستخدام موافقة خطية مستنيرة واتباع مبادئ إعلان هلسنكي.
1. فصل البشرة عن الأدمة
2. عزل الخلايا الكيراتينية
بالنظر إلى المتغيرات المتعددة التي يمكن التلاعب بها في هذه الطريقة والتي تؤدي في النهاية إلى مجموعة متنوعة من النتائج ، فإننا هنا نحدد العثرات الشائعة ونتائجها الناتجة ، بالإضافة إلى تقديم نتائج نموذجية والظروف الكامنة وراءها.
كما هو الحال مع أي تقنية لز...
هنا ، قمنا بتفصيل طريقة للثقافة الأولية للخلايا الكيراتينية البشرية لغرض تصوير الخلايا الحية. تتكيف هذه الطريقة مع تقنيات زراعة الخلايا الحالية باستخدام الطلاء منخفض الكثافة والثقافة طويلة الأمد للسماح بإجراء دراسات تصوير ناجحة للخلايا الحية. تتضمن الطريقة المفضلة ل?...
المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.
شكر خاص ل T. Richard Parenteau ، دكتوراه في الطب / دكتوراه ، وألكسندرا شاروير ، دكتور / دكتوراه ، لتعليمي كيفية زراعة الخلايا الكيراتينية. شكرا ل Merisa Piper MD لتزويدنا بعينات لعزل الخلايا الكيراتينية منها. شكرا أخيرا لمايكل روزنبلوم ، دكتوراه في الطب ، للسماح لنا بالوصول إلى نظام تصوير الخلايا الحية الخاص به لإكمال التجارب.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
.05% Trypsin-EDTA (1X), 100 mL | Gibco | 25300-054 | |
100 um cell filter | Corning | 352360 | |
15 cc Falcon | Corning | 352096 | |
50 cc conical Falcon | Corning | 352070 | |
6 well microplate | Corning | 3516 | |
70% reagent alcohol, 4 L | VWR Chemicals | BDH1164-4LP | Can alternatively dilute your own |
Amphotericin B, 50 ml | Corning | 30-003-CF | Dilute to 5X (50 ug/mL) |
Dipase, 100 ml | Corning | 354235 | Dilute 1:1 with HBSS, add 1x gentamycin, filter sterilize |
Epilife, 50 mL | Gibco | MEP1500CA | Add HKGS, consider antibiotics |
Fetal Bovine Serum Value Heat Inactivated FBS, 500 ml | Gibco | A52568-01 | FBS |
Forceps | |||
Gentamicin, 10 ml | Gibco | 15750-060 | Dilute to 50 ug/ml for 5X |
Hank's Balanced Salt Solution (1X), 500 ml | Gibco | 14170-112 | (HBSS) |
HBSS 5X PSAG | This is HBSS + 5X concentrations of Pen/Strep/Ampho/Gent | ||
Hibiclens, Gallon | Molnlycke | 57591 | Dilute to 10% using deionized H20 |
Human Keratinocyte Growth Serum, 5 mL | Gibco | S-001-5 | Added to epilife |
Penicillin/Streptomycin, 100 ml | Corning | 30-002-Cl | Dilute to 5X (comes in 100x stock) for 5X PSA - 1X for media changes |
Petri Dish 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
Scalpel Blade NO 23 | VWR | 76457-480 | |
TrypLE | Gibco | 12604021 | A less caustic alternative to regular Trypsin |
Trypsin Neutralizing Solution | (TNS), this is HBSS with 10% FBS (some use less serum, 5%) |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved