Generazione di colture primarie per l'imaging di cellule vive di cheratinociti

Riepilogo

Questo protocollo delinea la coltura di cheratinociti appena ottenuti (passaggio 0) per l'uso nell'imaging di cellule vive.

Abstract

Il monitoraggio delle cellule staminali e del comportamento dei progenitori impegnati a livello di singola cellula nella pelle umana è stato impegnativo sia in vivo che in vitro. L'imaging di cellule vive ha permesso progressi significativi nella capacità di identificare le differenze tra le cellule staminali dei cheratinociti e il comportamento dei progenitori impegnati. L'imaging di cellule vive è un metodo in evoluzione e alquanto impegnativo per studiare il comportamento dei cheratinociti in vitro. Questo protocollo è stato sviluppato per coltivare cheratinociti a bassa densità di semina, consentendo la fotografia time-lapse a lungo termine e il monitoraggio del comportamento delle singole cellule. I cheratinociti del Passaggio 0 vengono coltivati a densità clonale e la fotografia time-lapse consente di documentare le singole divisioni cellulari e il momento in cui si sono verificate. Per la massima rilevanza biologica, i cheratinociti umani appena isolati vengono posti in vitro. Questo approccio si concentra sulla proliferazione. Tuttavia, questo protocollo può essere adattato per l'uso in altre applicazioni di imaging di cellule vive che misurano il comportamento delle singole cellule, come la misurazione della migrazione cellulare, della guarigione delle ferite e della motilità.

Introduzione

L'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire la capacità di tracciare i singoli cheratinociti in coltura per un periodo relativamente lungo (diverse settimane) grazie alle basse densità di semina e alla fotografia time-lapse. L'imaging di cellule vive a bassa densità offre ai ricercatori l'opportunità di visualizzare il comportamento cellulare in vitro a livello di singola cellula. Sebbene non sia possibile nelle colture cellulari convenzionali, l'imaging su cellule vive consente di sviluppare alberi di lignaggio in tempo reale, senza l'uso di marcatura, da cui è possibile accertare informazioni riguardanti la cinetica di divisione, come la durata del ciclo cellulare e la proporzione di divisioni di proliferazione e differenziazione in una colonia. Consente inoltre lo studio della migrazione e della motilità cellulare. Può essere tecnicamente impegnativo, con aspetti che necessitano di ottimizzazione, a seconda del tipo di cella e dei dati che devono essere acquisiti. Altri laboratori hanno utilizzato cheratinociti neonatali e/o cheratinociti passati che sono più facili da coltivare¹.

Tuttavia, le linee cellulari che subiscono passaggi ripetuti sono significativamente diverse nel comportamento e nella morfologia dal loro stato in vivo ². Per la massima rilevanza biologica al fine di ottenere il comportamento più vicino a quello in vivo , vengono utilizzate cellule di passaggio 0. Nelle popolazioni di cheratinociti, è possibile distinguere tra la cellula staminale e il progenitore impegnato senza smistamento o marcature perché ci sono differenze distinte nel comportamento di divisione che possono essere osservate tramite l'imaging di cellule vive³.

Utilizziamo l'imaging di cellule vive per studiare la cinetica di proliferazione dei cheratinociti. Un approccio simile è stato utilizzato per studiare la motilità delle cellule di melanoma cutaneo cocoltivate con cheratinociti⁴, la migrazione cellulare aderente dei saggi scratch⁵ e il modo in cui gli inibitori ROCK influenzano la proliferazione dei cheratinociti⁶. Questo protocollo è specificamente progettato per la coltura di cellule per facilitare il tracciamento del lignaggio mediante imaging di cellule vive, sebbene possa essere adattato per altri scopi.

Questo protocollo delinea l'isolamento dei cheratinociti del passaggio 0 ai fini dell'imaging di cellule vive, discute le complicanze che possono insorgere e fornisce considerazioni che possono richiedere modifiche al protocollo (Figura 1).

Protocollo

Per l'uso di tessuti umani è necessaria l'approvazione del Comitato per la ricerca umana dell'istituto. I campioni umani per la ricerca sono spesso ottenuti da fonti commerciali (ad esempio, ATCC, tecnologia cellulare Lifeline e Zen-Bio). I nostri studi utilizzano tessuti scartati al momento degli interventi chirurgici o campioni di biopsia cutanea prelevati appositamente per scopi di studio. Queste situazioni richiedono diverse approvazioni e procedure di autorizzazione. Tutti i tessuti sono ottenuti dopo l'approvazione del Comitato per la ricerca umana dell'UCSF, utilizzando il consenso informato scritto e seguendo i principi della Dichiarazione di Helsinki.

1. Separazione dell'epidermide dal derma

1. Assicurarsi che siano ottenute le approvazioni appropriate per utilizzare tessuti umani per lo studio.
2. Prelevare il campione di pelle e trasportarlo in un contenitore isolato con un impacco di ghiaccio. Collocare il campione in un terreno di raccolta contenente una concentrazione di 5 volte superiore a quella di penicillina, streptomicina e amfotericina.
   NOTA: La quantità richiesta dipenderà dall'applicazione. Nella nostra esperienza, circa 1.000.000 di cheratinociti per cm² sono ottenuti da pelle adulta e invecchiata. Tuttavia, questo può variare in modo significativo per ogni campione.
   1. Posizionare i prepuzi neonatali in terreni di coltura cellulare e iniziare la procedura di isolamento dei cheratinociti non più tardi di 48 ore dopo la circoncisione per ridurre al minimo la morte cellulare. Conservare il fazzoletto a 4 °C fino alla lavorazione. L'elaborazione di campioni adulti e invecchiati inizia in genere entro poche ore dalla raccolta.
3. Ottieni l'accesso a una cabina di biosicurezza con apparecchiature di livello BS2 progettate per lavorare con agenti che causano malattie per ingestione, mucosa o esposizione percutanea⁷. Assicurarsi che la cabina di biosicurezza sia sterilizzata ai raggi UV per almeno 15 minuti e che tutte le superfici siano spruzzate con alcol al 70% prima dell'uso.
4. Indossare i guanti, spruzzare il contenitore di raccolta con alcol al 70% e posizionare il contenitore nella cappa aspirante. Posiziona un tampone di raffreddamento sotto il fazzoletto per evitare che si riscaldi a temperatura ambiente e per mantenerne l'integrità. Se il fazzoletto è estremamente grande, tagliarne una parte per la lavorazione e mantenere il resto umido nel contenitore di raccolta.
   NOTA: Poiché molti degli esemplari invecchiati sono grandi strati di pelle addominale o mammaria da interventi chirurgici, ci vuole tempo per tagliare ed elaborare il tessuto. Il fazzoletto non deve mai essere posizionato direttamente sul cuscinetto, poiché il freddo estremo può causarne il congelamento. Invece, dovrebbe essere posizionato su una superficie intermedia, come una lastra di marmo.
5. Posizionare due piastre di Petri da 100 mm x 15 mm e un bisturi chirurgico sterile #23 nel cappuccio.
6. Aprire le piastre di Petri e posizionarle sulla superficie dell'armadio in modo che le superfici interne di ciascuna piastra siano rivolte verso l'alto. Aggiungere 10 ml di clorexidina gluconato al 10% in una delle piastre di Petri. Aggiungere 10 ml di 5x penicillina/streptomicina/amfotericina/gentamicina nella soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS; 5x) ad altre 2 metà della piastra di Petri (vedi Tabella dei materiali).
7. Preparare una piastra a 6 pozzetti per la fase Dispase. Per il tessuto neonatale, utilizzare 3 mL di Dispasi per pozzetto. Per campioni di tessuto invecchiati, utilizzare 4 ml. L'uso di quantità inadeguate di Dispase per il volume del tessuto può causare difficoltà a separare l'epidermide dal derma.
8. Usa un bisturi per tagliare il tessuto in pezzi più piccoli in modo che possa essere meglio penetrato dalla Dispae. La dispasi penetra solo fino a 5 mm dai bordi del tessuto, quindi tagliare lunghe strisce di tessuto larghe 0,5-1 cm. Se non tagliato abbastanza piccolo, non si verificherà la separazione dell'epidermide dal derma.
   1. Taglia il tessuto più spesso in pezzi più piccoli. Tagliare i prepuzi neonatali in 3 o 4 pezzi (~5 mm x 7 mm). Utilizzare un massimo di due prepuzi interi per pozzetto di Dispase. I lembi addominali superficiali tendono ad essere molto più sottili, con tessuto sottocutaneo minimo o assente, tagliarli in strisce più lunghe (~5 mm x 15 mm).
   2. Posizionare un massimo di quattro strisce per pozzetto di Dispase. Se il tessuto ottenuto ha molto grasso sottocutaneo attaccato, tagliare il tessuto sottocutaneo per aiutare Dispase a penetrare completamente nel tessuto. Se il tessuto è tagliato troppo piccolo, potrebbe essere necessario un microscopio da dissezione per determinare quale lato è epidermico e quale lato è dermico mentre si stacca l'epidermide. Tirare il lato sbagliato della pelle può provocare un ulteriore trauma tissutale.
9. Posizionare il tessuto con il lato epidermico rivolto verso il basso nella prima piastra di Petri preparata al punto 1.6, contenente il 10% di clorexidina gluconato, per 10-20 s Quindi trasferire il tessuto con il lato epidermico verso il basso nella seconda piastra di Petri, contenente 5x penicillina/streptomicina/amfotericina (PSA) con HBSS, e agitare per 10-20 s. Trasferire il tessuto con il lato epidermico rivolto verso il basso nella terza piastra di Petri, sempre contenente 5x PSA con HBSS, e agitare per altri 10 s. È accettabile l'elaborazione di più campioni con la stessa soluzione.
10. Trasferire il tessuto con il lato epidermico verso il basso nella piastra Dispase a 6 pozzetti preparata al punto 1.7.
    NOTA: Consigliamo il lato epidermico rivolto verso il basso secondo la nostra convenzione. Altri protocolli raccomandano il derma verso il basso⁸. Non tutte le Dispase sono ugualmente efficaci. Il peeling dell'epidermide dalla pelle invecchiata si è rivelato difficile con alcuni prodotti, anche a concentrazioni fino a 4 volte il livello raccomandato dal produttore. Ciò ha comportato la perdita di tempo e di campioni. Le aziende utilizzano unità non standardizzate per Dispase, rendendo difficile identificare le differenze tra le concentrazioni tra le marche. A causa di queste sfide, si consiglia vivamente l'uso di uno dei marchi Dispase elencati nella Tabella dei materiali .
11. Etichettare la piastra a 6 pozzetti contenente la Dispasi e i campioni e trasferirla a 4 °C. Incubare campioni neonatali per 16-18 ore in Dispase e campioni adulti/anziani per 24 ore.
    NOTA: Esiste un protocollo alternativo di 2 ore che può essere utilizzato per i campioni, in cui il campione viene posto in Dispasi a 37 °C per 2 ore, quindi l'epidermide viene sbucciata. Sfortunatamente, questo non sempre funziona e l'integrità del tessuto può essere compromessa dopo l'incubazione, con conseguente perdita dell'esemplare. L'incubazione notturna è preferita quando possibile.

2. Isolamento dei cheratinociti

1. Mettere lo 0,05% di tripsina-EDTA (o TrypLE), la soluzione neutralizzante della tripsina e i terreni per cheratinociti in un bagno d'acqua a 37 °C 20 minuti prima di iniziare la serie successiva di passaggi
2. Rimuovere una piastra a 6 pozzetti da 4 °C, spruzzarla con etanolo al 70% e collocarla in una cappa di biosicurezza preparata (vedere il passaggio 1.3).
3. Posizionare le pinze dentate sterili e le pinze non dentate in una provetta conica da 50 mL contenente 20 mL di etanolo al 70%. Se inizialmente si trova all'esterno della cappa, spruzzare una pinza con etanolo al 70% prima di inserirla nella cappa.
4. Usando una pinza sterilizzata chimicamente, afferrare un pezzo di tessuto e metterlo su una superficie sterile con il lato epidermico rivolto verso l'alto (utilizzare una capsula di Petri o l'interno della metà superiore della piastra a 6 pozzetti). Tenere la parte dermica del tessuto con una pinza dentata usando la mano non dominante e contemporaneamente afferrare saldamente l'epidermide con la pinza non dentata ed estrarla da un bordo all'altro. Dovrebbe staccarsi senza intoppi come un unico pezzo.
5. Posizionare l'epidermide all'interno del labbro di una provetta conica da 15 mL. Ogni provetta conica da 15 ml deve avere un'epidermide di massimo due prepuzi.
   1. Lavora in modo efficiente; Se il tessuto si secca, la resa sarà compromessa. Se la Dispasi non penetra adeguatamente nel tessuto, potrebbero esserci difficoltà a staccare l'epidermide. In tal caso, tirare/raschiare l'epidermide dal derma sottostante. Ciò si traduce anche in una resa molto più bassa e non è raccomandato.
6. Aggiungere 4 mL di tripsina-EDTA allo 0,05% nella provetta conica da 15 mL, quindi chiudere e capovolgere la provetta assicurandosi che tutta l'epidermide sia sospesa nella tripsina e non bloccata sul lato della provetta/del coperchio. Mettere a bagnomaria a 37 °C per 10 min. Agitare le cellule ogni 2 minuti a mano.
   NOTA: La tripsinizzazione per più di 10 minuti può comportare una minore resa della cella. Inoltre, se l'integrità delle proteine della superficie cellulare è un problema, utilizzare il TrypLE in quanto è più specifico per il suo sito di scissione, con conseguente minor danno alle cellule e ha dimostrato di non ridurre significativamente l'espressione dell'antigene di superficie rispetto alla tripsina-EDTA⁹. Inoltre, il bagnomaria è una fonte comune di contaminazione, quindi assicurati che venga pulito regolarmente. Cambiare regolarmente l'acqua con acqua deionizzata contenente la soluzione aquaguard-2.
7. Inserire una provetta conica da 50 mL nella camera di biosicurezza. Svitare il coperchio e posizionare un filtro cellulare da 100 μm sull'apertura del tubo conico.
8. Rimuovere la provetta conica da 15 ml contenente il campione digerito dal bagnomaria, asciugarla accuratamente e spruzzarla con alcol al 70% prima di riporla nella camera di biosicurezza. Battere il tubo conico 3 volte contro la superficie della cappa aspirante, quindi capovolgerlo 6 volte. Ripetere il ciclo di maschiatura-inversione 3 volte.
9. Aggiungere 6 mL di soluzione neutralizzante della tripsina nella provetta conica. Versare attraverso il colino cellulare nella provetta conica da 50 mL dal passaggio 2.7.
10. Sciacquare la provetta conica da 15 mL contenente il campione con 5 mL di soluzioni neutralizzanti la tripsina (TNS). Versare attraverso un colino cellulare nella provetta conica da 50 mL. Centrifugare a 300 x g per 5 min.
11. Estrarre immediatamente dalla centrifuga e pipettare il surnatante per evitare la perdita di cellule nel terreno. Dovrebbe rimanere solo il pellet con una piccola raccolta di liquido. Può essere difficile vedere il pellet da campioni di tessuto più piccoli.
    NOTA: C'è tripsina presente nel surnatante, quindi è meglio rimuoverne il più possibile senza perdere il pellet.
12. Risospendere il pellet di cheratinociti in 2 mL di terreno di coltura per cheratinociti.
    NOTA: Ci sono due considerazioni qui. Innanzitutto, quali media utilizzare. A tale scopo, si consiglia un terreno privo di siero e collagene. Storicamente, lo standard per la coltura cellulare di cheratinociti è stato il Modified Eagle's Medium (DMEM) di Dulbecco (DMEM) +10% di siero fetale bovino (FBS) + F-12 di Ham su uno strato di alimentazione di fibroblasti (3t3-J2s)¹⁰. Tuttavia, con l'avvento dei terreni privi di siero e la disponibilità di collagene, molte altre possibilità rimangono praticabili (vedi discussione)¹¹. La seconda considerazione è se l'uso di antibiotici nel terreno di coltura sia appropriato per l'applicazione di imaging di cellule vive. Ciò dipenderà dal tempo di imaging, dalla durata e dall'esperienza con il sistema di imaging. Le colonie vengono visualizzate per più settimane utilizzando un sistema di imaging condiviso, rendendo l'uso di antibiotici un approccio preferito nonostante il potenziale impatto sulle colture (vedi discussione). Durante la risospensione vengono utilizzati penicillina, streptomicina, amfotericina B e terreno cheratinocitario contenente gentamicina, seguito da un passaggio a terreni contenenti penicillina/streptomicina dopo il cambio iniziale del terreno. Questo metodo ha efficacemente impedito la contaminazione durante l'imaging esteso di cellule vive.
13. Contare le celle e seminare la piastra (vedere la discussione per i commenti sulla selezione della densità di semina). Per garantire una distribuzione uniforme della semina, prima della piastratura, risospendere le cellule dei cheratinociti nella quantità totale di terreno da piastrare. Dopo una leggera agitazione per inversione, agitare leggermente per 1-2 s e impiattare. Quindi, spostare la micropiastra a croce (su-giù, sinistra-destra) 3 volte nell'incubatrice.
14. Dopo 24 ore, posizionare la piastra nell'incubatore del sistema di imaging di cellule vive. Esegui l'imaging di cellule vive a 10x con immagini scattate ogni 20 minuti. Posizionare i campioni a 37 °C e 5% di CO₂ nell'incubatore collegato al microscopio.

Risultati

Date le molteplici variabili che possono essere manipolate in questo metodo e che alla fine si traducono in una varietà di risultati, qui descriviamo i passi falsi comuni e i risultati che ne derivano, oltre a fornire risultati esemplari e le circostanze dietro di essi.

Come con qualsiasi tecnica di coltura cellulare, la contaminazione è una possibilità (Video supplementare 1). Insieme a un'attenta tecnica di sterilizzazione, prendere in co...

Discussione

Qui, abbiamo dettagliato un metodo per la coltura primaria di cheratinociti umani ai fini dell'imaging di cellule vive. Questo metodo adatta le tecniche di coltura cellulare esistenti che utilizzano la placcatura a bassa densità e la coltura a lungo termine per consentire il successo degli studi di imaging di cellule vive. Il metodo preferito per la dissociazione di questo tipo di cellule prevede una digestione enzimatica in due fasi, che ha dimostrato di portare a cheratinociti, di cui...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
.05% Trypsin-EDTA (1X), 100 mL	Gibco	25300-054
100 um cell filter	Corning	352360
15 cc Falcon	Corning	352096
50 cc conical Falcon	Corning	352070
6 well microplate	Corning	3516
70% reagent alcohol, 4 L	VWR Chemicals	BDH1164-4LP	Can alternatively dilute your own
Amphotericin B, 50 ml	Corning	30-003-CF	Dilute to 5X (50 ug/mL)
Dipase, 100 ml	Corning	354235	Dilute 1:1 with HBSS, add 1x gentamycin, filter sterilize
Epilife, 50 mL	Gibco	MEP1500CA	Add HKGS, consider antibiotics
Fetal Bovine Serum Value Heat Inactivated FBS, 500 ml	Gibco	A52568-01	FBS
Forceps
Gentamicin, 10 ml	Gibco	15750-060	Dilute to 50 ug/ml for 5X
Hank's Balanced Salt Solution (1X), 500 ml	Gibco	14170-112	(HBSS)
HBSS 5X PSAG			This is HBSS + 5X concentrations of Pen/Strep/Ampho/Gent
Hibiclens, Gallon	Molnlycke	57591	Dilute to 10% using deionized H20
Human Keratinocyte Growth Serum, 5 mL	Gibco	S-001-5	Added to epilife
Penicillin/Streptomycin, 100 ml	Corning	30-002-Cl	Dilute to 5X (comes in 100x stock) for 5X PSA - 1X for media changes
Petri Dish 100 mm x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713
Scalpel Blade NO 23	VWR	76457-480
TrypLE	Gibco	12604021	A less caustic alternative to regular Trypsin
Trypsin Neutralizing Solution			(TNS), this is HBSS with 10% FBS (some use less serum, 5%)