Получение первичных культур для визуализации живых клеток кератиноцитов

Резюме

Этот протокол описывает культуру свежеполученных (пассаж 0) кератиноцитов для использования в визуализации живых клеток.

Аннотация

Отслеживание стволовых клеток и фиксированного поведения предшественников на уровне отдельных клеток в коже человека было сложной задачей как in vivo , так и in vitro. Визуализация живых клеток позволила добиться значительного прогресса в выявлении различий между стволовыми клетками кератиноцитов и поведением предшественников. Визуализация живых клеток является развивающимся и довольно сложным методом изучения поведения кератиноцитов in vitro. Этот протокол был разработан для культивирования кератиноцитов при низкой плотности посева, что позволяет проводить относительно долгосрочную покадровую фотосъемку и мониторинг поведения отдельных клеток. Кератиноциты Passage 0 выращиваются с клональной плотностью, а покадровая съемка позволяет документировать отдельные клеточные деления и время их возникновения. Для максимальной биологической значимости свежевыделенные кератиноциты человека помещаются in vitro. Этот подход ориентирован на распространение. Тем не менее, этот протокол может быть адаптирован для использования в других приложениях визуализации живых клеток, измеряющих поведение отдельных клеток, таких как измерение миграции клеток, заживления ран и подвижности.

Введение

Цель этого протокола состоит в том, чтобы обеспечить возможность отслеживания отдельных кератиноцитов в культуре в течение относительно длительного периода времени (несколько недель), что стало возможным благодаря низкой плотности посева и покадровой съемке. Визуализация живых клеток с низкой плотностью дает исследователям возможность визуализировать поведение клеток in vitro на уровне одной клетки. Хотя визуализация живых клеток невозможна в традиционной клеточной культуре, она позволяет создавать деревья линий в режиме реального времени, без использования мечения, из которых можно получить информацию о кинетике деления, такую как продолжительность клеточного цикла и доля делений пролиферации и дифференцировки в колонии. Это также позволяет изучать миграцию и подвижность клеток. Она может быть технически сложной, с аспектами, которые требуют оптимизации в зависимости от типа ячейки и данных, которые должны быть собраны. В других лабораториях использовались неонатальные кератиноциты и/или пассажные кератиноциты, которые легче выращивать¹.

Тем не менее, клеточные линии, которые подвергаются повторному пассионгу, значительно отличаются по поведению и морфологии от своего состояния in vivo ². Для достижения наибольшей биологической значимости с целью получения поведения, наиболее близкого к in vivo , используются клетки пассажа 0. В популяциях кератиноцитов можно провести различие между стволовой клеткой и коммитированным предшественником без сортировки или меток, поскольку существуют явные различия в поведении деления, которые можно наблюдать с^{помощью визуализации} живых клеток.

Мы используем визуализацию живых клеток для изучения кинетики пролиферации кератиноцитов. Аналогичный подход был использован для изучения подвижности клеток меланомы кожи, совместно культивируемых с кератиноцитами⁴, миграции адгезивных клеток в анализах царапин⁵ и того, как ингибиторы ROCK влияют на пролиферацию кератиноцитов⁶. Этот протокол специально разработан для культивирования клеток, чтобы облегчить отслеживание линии с помощью визуализации живых клеток, хотя он может быть адаптирован и для других целей.

В этом протоколе описывается выделение кератиноцитов пассажа 0 с целью визуализации живых клеток, обсуждаются осложнения, которые могут возникнуть, и приводятся соображения, которые могут потребовать внесения изменений в протокол (Рисунок 1).

протокол

Для использования человеческих тканей требуется одобрение Комитета по исследованиям на человеке учреждения. Человеческие образцы для исследований часто получают из коммерческих источников (например, ATCC, клеточная технология Lifeline, Zen-Bio). В наших исследованиях используются отбракованные ткани во время операций или образцы биопсии кожи, взятые специально для исследовательских целей. Эти ситуации требуют различных согласований и процедур согласия. Все ткани получают после одобрения Комитета UCSF по исследованиям на людях с использованием письменного информированного согласия и в соответствии с принципами Хельсинкской декларации.

1. Отделение эпидермиса от дермы

1. Убедитесь в получении соответствующих разрешений на использование тканей человека для исследования.
2. Возьмите образец кожи и транспортируйте его в изолированном контейнере с пакетом со льдом. Поместите образец в среду для сбора, содержащую в 5-кратной концентрации пенициллина, стрептомицина и амфотерицина.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимое количество будет зависеть от области применения. По нашему опыту, примерно 1 000 000 кератиноцитов на^см2 получают из взрослой и возрастной кожи. Однако это может значительно варьироваться для каждого образца.
   1. Поместите неонатальную крайнюю плоть в среду для клеточных культур и начните процедуру выделения кератиноцитов не позднее чем через 48 ч после обрезания, чтобы свести к минимуму гибель клеток. Храните салфетку при температуре 4 °C до обработки. Обработка взрослых и старых образцов обычно начинается в течение нескольких часов после сбора.
3. Получите доступ к шкафу биобезопасности с оборудованием уровня BS2, предназначенным для работы с агентами, вызывающими заболевание при проглатывании, слизистой оболочке или чрескожном воздействии⁷. Перед использованием убедитесь, что шкаф для биобезопасности стерилизован ультрафиолетовым излучением в течение не менее 15 минут и что все поверхности опрысканы 70% спиртом.
4. Наденьте перчатки, опрыскайте емкость для сбора 70% спиртом и поместите емкость в вытяжной шкаф. Подложите охлаждающую салфетку под салфетку, чтобы предотвратить ее нагрев до комнатной температуры и сохранить ее целостность. Если ткань очень большая, отрежьте часть для обработки, а остальную часть держите влажной в контейнере для сбора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку многие из старых образцов имеют большую кожу живота или молочной железы после операций, требуется время для разреза и обработки ткани. Салфетку никогда не следует класть непосредственно на прокладку, так как сильный холод может привести к ее замерзанию. Вместо этого его следует разместить на промежуточной поверхности, например, на мраморной плите.
5. Поместите в капюшон две чашки Петри размером 100 мм x 15 мм и стерильный хирургический скальпель #23.
6. Откройте чашки Петри и поставьте их на поверхность шкафа так, чтобы внутренние поверхности каждой чашки были обращены вверх. Добавьте 10 мл 10% глюконата хлоргексидина в одну из чашек Петри. Добавьте 10 мл 5x пенициллина/стрептомицина/амфотерицина/гентамицина в сбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS; 5x) в 2 другие половинки чашки Петри (см. Таблицу материалов).
7. Подготовьте 6-луночную пластину для этапа Dispase. Для тканей новорожденных используйте 3 мл Dispase на лунку. Для старых образцов тканей используйте 4 мл. Использование недостаточного количества Dispase для объема ткани может привести к трудностям с отделением эпидермиса от дермы.
8. С помощью скальпеля разрежьте ткань на более мелкие кусочки так, чтобы она лучше проникала Dispase. Диспасе проникает только на расстоянии до 5 мм от краев ткани, поэтому нарезают длинными полосками ткани шириной 0,5-1 см. Если не обрезать достаточно мелко, то отделения эпидермиса от дермы не произойдет.
   1. Более плотную ткань нарежьте на более мелкие кусочки. Разрежьте неонатальную крайнюю плоть на 3 или 4 части (~5 мм x 7 мм). Используйте не более двух полных крайних плотей на лунку Dispase. Поверхностные лоскуты брюшной полости, как правило, намного тоньше, с минимальным количеством подкожной клетчатки или без нее, разрежьте их на более длинные полоски (~5 мм x 15 мм).
   2. Положите максимум четыре полоски на лунку Dispase. Если к полученной ткани прикреплено много подкожного жира, обрежьте подкожную клетчатку, чтобы помочь Dispase полностью проникнуть в ткань. Если ткань разрезана слишком мелко, может потребоваться препарирующий микроскоп, чтобы определить, какая сторона является эпидермальной, а какая — дермальной, при отслаивании эпидермиса. Вытягивание неправильной стороны кожи может привести к дополнительной травме тканей.
9. Поместите тканевую эпидермальную сторону вниз в первую чашку Петри, приготовленную на шаге 1.6, содержащую 10% глюконата хлоргексидина, на 10-20 с. Затем перенесите тканевую эпидермальную сторону вниз во вторую чашку Петри, содержащую 5x пенициллин/стрептомицин/амфотерицин (ПСА) с HBSS, и перемешивайте в течение 10-20 с. Перенесите тканевую эпидермальную сторону вниз в третью чашку Петри, снова содержащую 5x ПСА с HBSS, и перемешивайте еще 10 секунд. Допустима обработка нескольких образцов одним и тем же раствором.
10. Перенесите эпидермальную сторону ткани вниз на 6-луночный планшет Dispase, приготовленный на шаге 1.7.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем использовать эпидермальную сторону вниз в соответствии с нашей конвенцией. Другие протоколы рекомендуют дерму вниз⁸. Не все рассуждения одинаково эффективны. Отшелушивание эпидермиса с возрастной кожи оказалось сложной задачей при использовании некоторых продуктов, даже в концентрациях, в 4 раза превышающих рекомендованный производителем. Это привело к потере времени и образцов. Компании используют нестандартизированные единицы измерения для Dispase, что затрудняет определение различий концентраций между брендами. В связи с этими проблемами настоятельно рекомендуется использовать один из брендов Dispase, перечисленных в Таблице материалов .
11. Пометьте 6-луночный планшет, содержащий раствор и образцы, и переведите при температуре 4 °C. Инкубируйте неонатальные образцы в течение 16-18 ч в Dispase и взрослые/старые образцы в течение 24 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Существует альтернативный протокол 2 часов, который можно использовать для образцов, когда образец помещается в диспазу при 37 °C на 2 часа, а затем эпидермис отшелушивается. К сожалению, это не всегда работает, и целостность ткани может быть нарушена после инкубации, что приведет к потере образца. По возможности предпочтительна ночная инкубация.

2. Выделение кератиноцитов

1. Поместите 0,05% Trypsin-EDTA (или TrypLE), нейтрализующий раствор Trypsin и кератиноцитарные среды в водяную баню при температуре 37 °C за 20 минут до начала следующего набора шагов
2. Снимите 6-луночный планшет с температурой 4 °C, распылите на него 70% этанола и поместите в подготовленный шкаф биобезопасности (см. шаг 1.3).
3. Поместите стерильные зубчатые щипцы и незубчатые щипцы в коническую трубку объемом 50 мл, содержащую 20 мл 70% этанола. Если капюшон изначально находится вне колпака, распылите щипцы с 70% этанолом, прежде чем положить его в капот.
4. С помощью химически стерилизованных щипцов захватите кусочек ткани и положите его на стерильную поверхность эпидермальной стороной вверх (используйте чашку Петри или внутреннюю часть верхней половины 6-луночной пластины). Удерживайте дермальную часть ткани зубчатыми щипцами с помощью недоминантной руки и одновременно крепко захватывайте эпидермис незубчатыми щипцами и оттягивайте его от края к краю. Он должен гладко сойти как единое целое.
5. Поместите эпидермис на внутреннюю сторону губы конической трубки объемом 15 мл. Каждая коническая трубка объемом 15 мл должна иметь эпидермис максимум из двух крайних плоттей.
   1. Работать эффективно; Если ткань высохнет, урожайность будет поставлена под угрозу. Если диспаза не проникла должным образом в ткани, могут возникнуть трудности с отшелушиванием эпидермиса. В таком случае оттяните/соскребите эпидермис с подлежащей дермы. Это также приводит к гораздо более низкой урожайности и не рекомендуется.
6. Добавьте 4 мл 0,05% трипсина-ЭДТА в коническую пробирку объемом 15 мл, затем закройте и переверните пробирку, следя за тем, чтобы весь эпидермис был взвешенным в трипсине и не застрял на боковой стороне пробирки/крышки. Поставьте на водяную баню при температуре 37 °C на 10 минут. Перемешивайте клетки каждые 2 минуты вручную.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Трипсинизация в течение более 10 минут может привести к снижению выхода клеток. Кроме того, если целостность белков клеточной поверхности вызывает беспокойство, используйте TrypLE, поскольку он более специфичен для места его расщепления, что приводит к меньшему повреждению клеток и, как было показано, не приводит к значительному снижению экспрессии поверхностного антигена по сравнению с Trypsin-EDTA⁹. Кроме того, водяная баня является распространенным источником загрязнения, поэтому регулярно очищайте ее. Регулярно меняйте воду с деионизированной водой, содержащей раствор аквагард-2.
7. Поместите коническую пробирку объемом 50 мл в шкаф для биобезопасности. Открутите крышку и поместите сетчатый фильтр 100 μм на отверстие конической трубки.
8. Извлеките коническую пробирку объемом 15 мл с переваренным образцом из водяной бани, тщательно высушите и распылите на нее 70% спирт, прежде чем поместить ее обратно в шкаф для биобезопасности. Постучите конической трубкой 3 раза по поверхности вытяжного шкафа, затем переверните 6 раз. Повторите цикл постукивания и инверсии 3 раза.
9. Добавьте в коническую пробирку 6 мл нейтрализующего трипсин раствора. Налейте фильтр через ячейки в коническую пробирку объемом 50 мл с шага 2.7.
10. Промойте коническую пробирку объемом 15 мл с образцом 5 мл растворов, нейтрализующих трипсин (TNS). Налейте через клеточное ситечко в коническую пробирку объемом 50 мл. Центрифугируйте при 300 х г в течение 5 мин.
11. Немедленно снимите с центрифуги и пипеткой надосадочную жидкость, чтобы предотвратить потерю клеток в среду. Должна остаться только гранула с небольшим скоплением жидкости. Может быть трудно увидеть гранулу из небольших образцов ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В надосадочной жидкости присутствует трипсин, поэтому лучше удалить его как можно больше, не теряя гранулы.
12. Ресуспендируйте кератиноцитарную гранулу в 2 мл кератиноцитарной среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь есть два соображения. Во-первых, какие носители использовать. Для этого рекомендуется использовать бессывороточные среды без коллагена. Исторически сложилось так, что стандартом для культивирования кератиноцитарных клеток была модифицированная среда Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) +10% фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS) + F-12 Ham's на слое фидера фибробластов (3t3-J2s)¹⁰. Тем не менее, с появлением бессывороточных сред и доступностью коллагена, многие другие возможности остаются жизнеспособными (см. обсуждение)¹¹. Второе соображение заключается в том, является ли использование антибиотиков в культуральной среде подходящим для визуализации живых клеток. Это будет зависеть от времени визуализации, продолжительности и опыта работы с системой визуализации. Колонии визуализируются в течение нескольких недель с использованием общей системы визуализации, что делает использование антибиотиков предпочтительным подходом, несмотря на потенциальное воздействие на культуры (см. обсуждение). Пенициллин, стрептомицин, амфотерицин В и гентамицинсодержащая кератиноцитарная среда используют во время ресуспензии с последующим переходом на пенициллин/стрептомицинсодержащую среду после первоначальной смены среды. Этот метод эффективно предотвращает загрязнение во время расширенной визуализации живых клеток.
13. Подсчитайте ячейки и засейте планшет (см. обсуждение для комментариев по выбору плотности посева). Чтобы обеспечить равномерное распределение посева, перед нанесением покрытия проводят ресуспендию клеток кератиноцитов в общем количестве плоской среды. После легкого перемешивания путем инверсии, слегка перемешать в течение 1-2 с, и надавить на тарелку. Затем переместите микропланшет крестообразно (вверх-вниз, влево-вправо) 3 раза в инкубаторе.
14. Через 24 ч поместите планшет в инкубатор системы визуализации живых клеток. Выполняйте визуализацию живых клеток с 10-кратной скоростью каждые 20 минут. Поместите образцы при температуре 37 °C и 5%_CO2 в инкубатор, прикрепленный к микроскопу.

Результаты

Учитывая множество переменных, которыми можно манипулировать в этом методе, что в конечном итоге приводит к различным результатам, здесь мы описываем распространенные ошибки и их результирующие результаты, а также приводим примеры результатов и обстоятельства, стоя...

Обсуждение

Здесь мы подробно описали метод первичного культивирования кератиноцитов человека с целью визуализации живых клеток. Этот метод адаптирует существующие методы культивирования клеток с использованием низкоплотного осаждения и долговременного культивирования, что...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
.05% Trypsin-EDTA (1X), 100 mL	Gibco	25300-054
100 um cell filter	Corning	352360
15 cc Falcon	Corning	352096
50 cc conical Falcon	Corning	352070
6 well microplate	Corning	3516
70% reagent alcohol, 4 L	VWR Chemicals	BDH1164-4LP	Can alternatively dilute your own
Amphotericin B, 50 ml	Corning	30-003-CF	Dilute to 5X (50 ug/mL)
Dipase, 100 ml	Corning	354235	Dilute 1:1 with HBSS, add 1x gentamycin, filter sterilize
Epilife, 50 mL	Gibco	MEP1500CA	Add HKGS, consider antibiotics
Fetal Bovine Serum Value Heat Inactivated FBS, 500 ml	Gibco	A52568-01	FBS
Forceps
Gentamicin, 10 ml	Gibco	15750-060	Dilute to 50 ug/ml for 5X
Hank's Balanced Salt Solution (1X), 500 ml	Gibco	14170-112	(HBSS)
HBSS 5X PSAG			This is HBSS + 5X concentrations of Pen/Strep/Ampho/Gent
Hibiclens, Gallon	Molnlycke	57591	Dilute to 10% using deionized H20
Human Keratinocyte Growth Serum, 5 mL	Gibco	S-001-5	Added to epilife
Penicillin/Streptomycin, 100 ml	Corning	30-002-Cl	Dilute to 5X (comes in 100x stock) for 5X PSA - 1X for media changes
Petri Dish 100 mm x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713
Scalpel Blade NO 23	VWR	76457-480
TrypLE	Gibco	12604021	A less caustic alternative to regular Trypsin
Trypsin Neutralizing Solution			(TNS), this is HBSS with 10% FBS (some use less serum, 5%)