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Method Article
Este protocolo describe el cultivo de queratinocitos recién obtenidos (pasaje 0) para su uso en la obtención de imágenes de células vivas.
El seguimiento de las células madre y el comportamiento comprometido de los progenitores a nivel de una sola célula en la piel humana ha sido un desafío tanto in vivo como in vitro. Las imágenes de células vivas han permitido avances significativos en la capacidad de identificar diferencias entre las células madre de queratinocitos y el comportamiento de los progenitores comprometidos. La obtención de imágenes de células vivas es un método en evolución y algo desafiante para estudiar el comportamiento de los queratinocitos in vitro. Este protocolo se ha desarrollado para cultivar queratinocitos a baja densidad de siembra, lo que permite la fotografía de lapso de tiempo a largo plazo y el seguimiento del comportamiento de las células individuales. Los queratinocitos del pasaje 0 se cultivan a densidad clonal, y la fotografía de lapso de tiempo permite documentar las divisiones celulares individuales y el momento de su aparición. Para obtener la máxima relevancia biológica, los queratinocitos humanos recién aislados se colocan in vitro. Este enfoque se centra en la proliferación. Sin embargo, este protocolo se puede adaptar para su uso en otras aplicaciones de adquisición de imágenes de células vivas que miden el comportamiento de células individuales, como la medición de la migración celular, la cicatrización de heridas y la motilidad.
El objetivo de este protocolo es proporcionar la capacidad de rastrear queratinocitos individuales en cultivo durante un período relativamente largo (varias semanas) gracias a bajas densidades de siembra y fotografía de lapso de tiempo. La obtención de imágenes de células vivas a baja densidad ofrece a los investigadores la oportunidad de visualizar el comportamiento de las células in vitro a nivel de una sola célula. Si bien no es posible en el cultivo celular convencional, la obtención de imágenes de células vivas permite desarrollar árboles de linaje en tiempo real, sin el uso de etiquetado, a partir del cual se puede obtener información sobre la cinética de división, como la duración del ciclo celular y la proporción de divisiones de proliferación y diferenciación en una colonia. También permite el estudio de la migración y motilidad celular. Puede ser un desafío técnico, con aspectos que deben optimizarse, dependiendo del tipo de celda y de los datos que se van a capturar. Otros laboratorios han utilizado queratinocitos neonatales y/o queratinocitos pasados que son más fáciles de cultivar1.
Sin embargo, las líneas celulares que se someten a un paso repetido son significativamente diferentes en comportamiento y morfología de su estado in vivo 2. Para obtener la mayor relevancia biológica con el fin de obtener el comportamiento más cercano al in vivo , se utilizan células de paso 0. En las poblaciones de queratinocitos, es posible distinguir entre la célula madre y el progenitor comprometido sin clasificación ni etiquetas, ya que existen claras diferencias en el comportamiento de la división que se pueden observar a través de imágenes de células vivas3.
Utilizamos imágenes de células vivas para estudiar la cinética de proliferación de queratinocitos. Un enfoque similar se ha utilizado para estudiar la motilidad de las células de melanoma cutáneo cocultivadas con queratinocitos4, la migración celular adherente de los ensayos de rasguño5 y cómo los inhibidores de ROCK afectan la proliferación de queratinocitos6. Este protocolo está diseñado específicamente para el cultivo de células con el fin de facilitar el rastreo del linaje mediante imágenes de células vivas, aunque puede adaptarse para otros fines.
Este protocolo describe el aislamiento de los queratinocitos del paso 0 con el fin de obtener imágenes de células vivas, analiza las complicaciones que pueden surgir y proporciona consideraciones que pueden requerir alteraciones en el protocolo (Figura 1).
Se requiere la aprobación del Comité de Investigación en Seres Humanos de la institución para el uso de tejido humano. Las muestras humanas para la investigación a menudo se obtienen de fuentes comerciales (por ejemplo, ATCC, tecnología de celdas Lifeline y Zen-Bio). Nuestros estudios utilizan tejido desechado en el momento de las cirugías o muestras de biopsia de piel tomadas específicamente con fines de estudio. Estas situaciones requieren diferentes aprobaciones y procedimientos de consentimiento. Todos los tejidos se obtienen después de la aprobación del Comité de Investigación Humana de la UCSF, utilizando el consentimiento informado por escrito y siguiendo los principios de la Declaración de Helsinki.
1. Separación de la epidermis de la dermis
2. Aislamiento de queratinocitos
Dadas las múltiples variables que pueden ser manipuladas en este método y que, en última instancia, dan lugar a una variedad de resultados, aquí describimos los errores comunes y sus resultados resultantes, así como proporcionamos resultados ejemplares y las circunstancias detrás de ellos.
Al igual que con cualquier técnica de cultivo celular, la contaminación es una posibilidad (Video complementario 1). Junto con las técnicas estéri...
Aquí, hemos detallado un método para el cultivo primario de queratinocitos humanos con el propósito de obtener imágenes de células vivas. Este método adapta las técnicas de cultivo celular existentes mediante siembra de baja densidad y cultivo a largo plazo para permitir estudios exitosos de imágenes de células vivas. El método preferido para la disociación de este tipo de células implica una digestión enzimática de dos pasos, que se ha demostrado que da lugar a queratinoci...
Los autores no tienen nada que revelar.
Un agradecimiento especial a T. Richard Parenteau, MD/PhD, y Alexandra Charruyer, PharmD/PhD, por enseñarme a cultivar queratinocitos. Gracias a la Dra. Merisa Piper por proporcionarnos muestras para aislar los queratinocitos. Agradecimientos finales al Dr. Michael Rosenblum por permitirnos acceder a su sistema de imágenes de células vivas para completar los experimentos.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
.05% Trypsin-EDTA (1X), 100 mL | Gibco | 25300-054 | |
100 um cell filter | Corning | 352360 | |
15 cc Falcon | Corning | 352096 | |
50 cc conical Falcon | Corning | 352070 | |
6 well microplate | Corning | 3516 | |
70% reagent alcohol, 4 L | VWR Chemicals | BDH1164-4LP | Can alternatively dilute your own |
Amphotericin B, 50 ml | Corning | 30-003-CF | Dilute to 5X (50 ug/mL) |
Dipase, 100 ml | Corning | 354235 | Dilute 1:1 with HBSS, add 1x gentamycin, filter sterilize |
Epilife, 50 mL | Gibco | MEP1500CA | Add HKGS, consider antibiotics |
Fetal Bovine Serum Value Heat Inactivated FBS, 500 ml | Gibco | A52568-01 | FBS |
Forceps | |||
Gentamicin, 10 ml | Gibco | 15750-060 | Dilute to 50 ug/ml for 5X |
Hank's Balanced Salt Solution (1X), 500 ml | Gibco | 14170-112 | (HBSS) |
HBSS 5X PSAG | This is HBSS + 5X concentrations of Pen/Strep/Ampho/Gent | ||
Hibiclens, Gallon | Molnlycke | 57591 | Dilute to 10% using deionized H20 |
Human Keratinocyte Growth Serum, 5 mL | Gibco | S-001-5 | Added to epilife |
Penicillin/Streptomycin, 100 ml | Corning | 30-002-Cl | Dilute to 5X (comes in 100x stock) for 5X PSA - 1X for media changes |
Petri Dish 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
Scalpel Blade NO 23 | VWR | 76457-480 | |
TrypLE | Gibco | 12604021 | A less caustic alternative to regular Trypsin |
Trypsin Neutralizing Solution | (TNS), this is HBSS with 10% FBS (some use less serum, 5%) |
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