Generación de cultivos primarios para la obtención de imágenes de células vivas de queratinocitos

Resumen

Este protocolo describe el cultivo de queratinocitos recién obtenidos (pasaje 0) para su uso en la obtención de imágenes de células vivas.

Resumen

El seguimiento de las células madre y el comportamiento comprometido de los progenitores a nivel de una sola célula en la piel humana ha sido un desafío tanto in vivo como in vitro. Las imágenes de células vivas han permitido avances significativos en la capacidad de identificar diferencias entre las células madre de queratinocitos y el comportamiento de los progenitores comprometidos. La obtención de imágenes de células vivas es un método en evolución y algo desafiante para estudiar el comportamiento de los queratinocitos in vitro. Este protocolo se ha desarrollado para cultivar queratinocitos a baja densidad de siembra, lo que permite la fotografía de lapso de tiempo a largo plazo y el seguimiento del comportamiento de las células individuales. Los queratinocitos del pasaje 0 se cultivan a densidad clonal, y la fotografía de lapso de tiempo permite documentar las divisiones celulares individuales y el momento de su aparición. Para obtener la máxima relevancia biológica, los queratinocitos humanos recién aislados se colocan in vitro. Este enfoque se centra en la proliferación. Sin embargo, este protocolo se puede adaptar para su uso en otras aplicaciones de adquisición de imágenes de células vivas que miden el comportamiento de células individuales, como la medición de la migración celular, la cicatrización de heridas y la motilidad.

Introducción

El objetivo de este protocolo es proporcionar la capacidad de rastrear queratinocitos individuales en cultivo durante un período relativamente largo (varias semanas) gracias a bajas densidades de siembra y fotografía de lapso de tiempo. La obtención de imágenes de células vivas a baja densidad ofrece a los investigadores la oportunidad de visualizar el comportamiento de las células in vitro a nivel de una sola célula. Si bien no es posible en el cultivo celular convencional, la obtención de imágenes de células vivas permite desarrollar árboles de linaje en tiempo real, sin el uso de etiquetado, a partir del cual se puede obtener información sobre la cinética de división, como la duración del ciclo celular y la proporción de divisiones de proliferación y diferenciación en una colonia. También permite el estudio de la migración y motilidad celular. Puede ser un desafío técnico, con aspectos que deben optimizarse, dependiendo del tipo de celda y de los datos que se van a capturar. Otros laboratorios han utilizado queratinocitos neonatales y/o queratinocitos pasados que son más fáciles de cultivar¹.

Sin embargo, las líneas celulares que se someten a un paso repetido son significativamente diferentes en comportamiento y morfología de su estado in vivo ². Para obtener la mayor relevancia biológica con el fin de obtener el comportamiento más cercano al in vivo , se utilizan células de paso 0. En las poblaciones de queratinocitos, es posible distinguir entre la célula madre y el progenitor comprometido sin clasificación ni etiquetas, ya que existen claras diferencias en el comportamiento de la división que se pueden observar a través de imágenes de células vivas³.

Utilizamos imágenes de células vivas para estudiar la cinética de proliferación de queratinocitos. Un enfoque similar se ha utilizado para estudiar la motilidad de las células de melanoma cutáneo cocultivadas con queratinocitos⁴, la migración celular adherente de los ensayos de rasguño⁵ y cómo los inhibidores de ROCK afectan la proliferación de queratinocitos⁶. Este protocolo está diseñado específicamente para el cultivo de células con el fin de facilitar el rastreo del linaje mediante imágenes de células vivas, aunque puede adaptarse para otros fines.

Este protocolo describe el aislamiento de los queratinocitos del paso 0 con el fin de obtener imágenes de células vivas, analiza las complicaciones que pueden surgir y proporciona consideraciones que pueden requerir alteraciones en el protocolo (Figura 1).

Protocolo

Se requiere la aprobación del Comité de Investigación en Seres Humanos de la institución para el uso de tejido humano. Las muestras humanas para la investigación a menudo se obtienen de fuentes comerciales (por ejemplo, ATCC, tecnología de celdas Lifeline y Zen-Bio). Nuestros estudios utilizan tejido desechado en el momento de las cirugías o muestras de biopsia de piel tomadas específicamente con fines de estudio. Estas situaciones requieren diferentes aprobaciones y procedimientos de consentimiento. Todos los tejidos se obtienen después de la aprobación del Comité de Investigación Humana de la UCSF, utilizando el consentimiento informado por escrito y siguiendo los principios de la Declaración de Helsinki.

1. Separación de la epidermis de la dermis

1. Asegurarse de que se obtengan las aprobaciones adecuadas para utilizar tejido humano para el estudio.
2. Obtenga una muestra de piel y transpórtela en un recipiente aislado con una bolsa de hielo. Coloque la muestra en un medio de recolección que contenga una concentración 5 veces mayor de penicilina, estreptomicina y anfotericina.
   NOTA: La cantidad requerida dependerá de la aplicación. En nuestra experiencia, aproximadamente 1.000.000 de queratinocitos por^cm2 se obtienen de pieles adultas y envejecidas. Sin embargo, esto puede variar significativamente para cada muestra.
   1. Coloque los prepucios neonatales en medios de cultivo celular e inicie el procedimiento de aislamiento de queratinocitos no más de 48 horas después de la circuncisión para minimizar la muerte celular. Guarde el tejido a 4 °C hasta su procesamiento. El procesamiento de muestras adultas y envejecidas generalmente comienza a las pocas horas de la recolección.
3. Obtener acceso a una cabina de bioseguridad con equipo de nivel BS2 diseñado para trabajar con agentes causantes de enfermedades por ingestión, membrana mucosa o exposición percutánea⁷. Asegúrese de que la cabina de bioseguridad esté esterilizada con rayos UV durante al menos 15 minutos y que todas las superficies se rocíen con alcohol al 70% antes de su uso.
4. Póngase los guantes, rocíe el recipiente de recolección con alcohol al 70% y coloque el recipiente en la campana extractora. Coloque una almohadilla de enfriamiento debajo del pañuelo para evitar que se caliente a temperatura ambiente y para mantener su integridad. Si el tejido es extremadamente grande, corte una porción para procesarla y mantenga el resto húmedo en el recipiente de recolección.
   NOTA: Como muchos de los especímenes envejecidos son grandes de piel abdominal o mamaria debido a cirugías, se necesita tiempo para cortar y procesar el tejido. El pañuelo nunca debe colocarse directamente sobre la almohadilla, ya que el frío extremo puede hacer que se congele. En su lugar, debe colocarse sobre una superficie intermedia, como una losa de mármol.
5. Coloque dos placas de Petri de 100 mm x 15 mm y un bisturí quirúrgico estéril #23 en la capucha.
6. Abra las placas de Petri y colóquelas en la superficie del gabinete de manera que las superficies internas de cada placa miren hacia arriba. Agregue 10 mL de gluconato de clorhexidina al 10% a una de las placas de Petri. Agregue 10 mL de 5x penicilina/estreptomicina/anfotericina/gentamicina en la Solución Salina Balanceada de Hank (HBSS; 5x) a otras 2 mitades de la placa de Petri (Ver Tabla de Materiales).
7. Prepare una placa de 6 pocillos para el paso de Dispasa. Para el tejido neonatal, use 3 mL de Dispasa por pocillo. Para muestras de tejido envejecido, use 4 mL. El uso de cantidades inadecuadas de dispasa para el volumen de tejido puede resultar en dificultad para separar la epidermis de la dermis.
8. Use un bisturí para cortar el tejido en pedazos más pequeños para que la dispasa penetre mejor. La dispasa solo penetra hasta 5 mm desde los bordes del tejido, por lo que debe cortar tiras largas de tejido de 0,5 a 1 cm de ancho. Si no se corta lo suficientemente pequeño, no se producirá la separación de la epidermis de la dermis.
   1. Corta el tejido más grueso en pedazos más pequeños. Corta los prepucios neonatales en 3 o 4 pedazos (~5 mm x 7 mm). Utilice un máximo de dos prepucios enteros por pocillo de Dispasa. Los colgajos abdominales superficiales tienden a ser mucho más delgados, con un mínimo o ningún tejido subcutáneo, córtelos en tiras más largas (~ 5 mm x 15 mm).
   2. Coloque un máximo de cuatro tiras por pocillo de Dispasa. Si el tejido obtenido tiene una gran cantidad de grasa subcutánea adherida, recorte el tejido subcutáneo para ayudar a que la dispasa penetre completamente en el tejido. Si el tejido se corta demasiado pequeño, es posible que se requiera un microscopio de disección para determinar qué lado es epidérmico y qué lado es dérmico mientras se despega la epidermis. Tirar del lado equivocado de la piel puede provocar un traumatismo tisular adicional.
9. Coloque el tejido con el lado epidérmico hacia abajo en la primera placa de Petri preparada en el paso 1.6, que contiene gluconato de clorhexidina al 10%, durante 10-20 s Luego transfiera el tejido con el lado epidérmico hacia abajo a la segunda placa de Petri, que contiene 5x penicilina/estreptomicina/anfotericina (PSA) con HBSS, y agite durante 10-20 s. Transfiera el tejido con el lado epidérmico hacia abajo a la tercera placa de Petri, que nuevamente contenga 5x PSA con HBSS, y agite durante otros 10 s. Es aceptable procesar varias muestras con la misma solución.
10. Transfiera el tejido con el lado epidérmico hacia abajo a la placa de dispasa de 6 pocillos preparada en el paso 1.7.
    NOTA: Recomendamos el lado epidérmico hacia abajo según nuestra convención. Otros protocolos recomiendan la dermis hacia abajo⁸. No todas las dispasas son igualmente eficaces. Pelar la epidermis de la piel envejecida resultó un desafío con ciertos productos, incluso en concentraciones de hasta 4 veces el nivel recomendado por el fabricante. Esto resultó en la pérdida de tiempo y especímenes. Las empresas utilizan unidades no estandarizadas para Dispasa, lo que dificulta la identificación de cómo difieren las concentraciones entre las marcas. Debido a estos desafíos, se recomienda encarecidamente el uso de una de las marcas de Dispasa enumeradas en la Tabla de Materiales .
11. Etiquete la placa de 6 pocillos que contiene la dispasa y las muestras, y transfiérala a 4 °C. Incubar muestras neonatales durante 16-18 h en Dispasa y muestras adultas/envejecidas durante 24 h.
    NOTA: Existe un protocolo alternativo de 2 h que se puede utilizar para las muestras, en el que la muestra se coloca en Dispasa a 37 °C durante 2 h, y luego se pela la epidermis. Desafortunadamente, esto no siempre funciona, y la integridad del tejido puede verse comprometida después de la incubación, lo que resulta en la pérdida de una muestra. Se prefiere la incubación nocturna siempre que sea posible.

2. Aislamiento de queratinocitos

1. Coloque tripsina-EDTA al 0,05 % (o TrypLE), la solución neutralizante de tripsina y los medios de queratinocitos en un baño de agua a 37 °C 20 minutos antes de comenzar el siguiente conjunto de pasos
2. Retire una placa de 6 pocillos a 4 °C, rocíela con etanol al 70% y colóquela en una cabina de bioseguridad preparada (consulte el paso 1.3).
3. Coloque pinzas dentadas estériles y pinzas no dentadas en un tubo cónico de 50 mL que contenga 20 mL de etanol al 70%. Si está fuera de la campana inicialmente, rocíe las pinzas con etanol al 70% antes de colocarlas en la campana.
4. Con pinzas esterilizadas químicamente, agarre un trozo de tejido y colóquelo sobre una superficie estéril con el lado epidérmico hacia arriba (use una placa de Petri o el interior de la mitad superior de la placa de 6 pocillos). Sostenga la porción dérmica del tejido con pinzas dentadas con la mano no dominante y, al mismo tiempo, agarre firmemente la epidermis con las pinzas no dentadas y tire de ella de borde a borde. Debe desprenderse suavemente como una sola pieza.
5. Coloque la epidermis en el interior del labio de un tubo cónico de 15 mL. Cada tubo cónico de 15 mL debe tener una epidermis de dos prepucios como máximo.
   1. Trabajar de manera eficiente; Si el tejido se seca, el rendimiento se verá comprometido. Si la dispasa no penetró adecuadamente en el tejido, puede haber dificultad para despegar la epidermis. En tal caso, tire/raspe la epidermis de la dermis subyacente. Esto también da como resultado un rendimiento mucho menor y no se recomienda.
6. Agregue 4 mL de Tripsina-EDTA al 0,05% en el tubo cónico de 15 mL, luego cierre e invierta el tubo asegurándose de que toda la epidermis quede suspendida en la Tripsina y no se pegue en el costado del tubo/tapa. Colocar en un baño de agua a 37 °C durante 10 min. Agite las células cada 2 minutos con la mano.
   NOTA: La tripsinización durante más de 10 minutos puede resultar en un menor rendimiento de celdas. Además, si la integridad de las proteínas de la superficie celular es una preocupación, use TrypLE, ya que es más específico para su sitio de escisión, lo que resulta en menos daño a las células y se ha demostrado que no disminuye significativamente la expresión de antígeno de superficie en comparación con Trypsin-EDTA⁹. Además, el baño de agua es una fuente común de contaminación, así que asegúrese de limpiarlo regularmente. Cambie el agua regularmente con agua desionizada que contenga la solución aquaguard-2.
7. Coloque un tubo cónico de 50 mL en la cabina de bioseguridad. Desenrosque la tapa y coloque un colador de células de 100 μm en la abertura del tubo cónico.
8. Retire el tubo cónico de 15 mL que contiene la muestra digerida del baño de agua, séquelo completamente y rocíe con alcohol al 70% antes de volver a colocarlo en la cabina de bioseguridad. Golpee el tubo cónico 3 veces contra la superficie de la campana extractora y luego invierta 6 veces. Repita el ciclo de inversión de roscado 3 veces.
9. Agregue 6 mL de solución neutralizante de tripsina en el tubo cónico. Vierta a través del filtro de células en el tubo cónico de 50 ml del paso 2.7.
10. Enjuague el tubo cónico de 15 mL que contiene la muestra con 5 mL de soluciones neutralizantes de tripsina (TNS). Vierta a través de un colador de células en el tubo cónico de 50 mL. Centrifugar a 300 x g durante 5 min.
11. Retire inmediatamente de la centrífuga y pipetee el sobrenadante para evitar la pérdida de células en el medio. Solo debe quedar el pellet con una pequeña acumulación de líquido. Puede ser difícil ver el gránulo a partir de muestras de tejido más pequeñas.
    NOTA: Hay tripsina presente en el sobrenadante, por lo que es mejor eliminar la mayor cantidad posible sin perder el pellet.
12. Vuelva a suspender el pellet de queratinocitos en 2 mL de medio de queratinocitos.
    NOTA: Aquí hay dos consideraciones. En primer lugar, qué medios utilizar. Para ello, se recomiendan medios sin suero y sin colágeno. Históricamente, el estándar para el cultivo de células de queratinocitos ha sido el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) +10% de suero fetal bovino (FBS) + F-12 de Ham en una capa alimentadora de fibroblastos (3t3-J2s)¹⁰. Sin embargo, con el advenimiento de los medios sin suero y la disponibilidad de colágeno, muchas otras posibilidades siguen siendo viables (ver discusión)¹¹. La segunda consideración es si el uso de antibióticos en el medio de cultivo es apropiado para la aplicación de imágenes de células vivas. Esto dependerá del tiempo de obtención de imágenes, la duración y la experiencia con el sistema de imágenes. Las colonias se toman imágenes durante varias semanas utilizando un sistema de imágenes compartido, lo que hace que el uso de antibióticos sea un enfoque preferido a pesar del impacto potencial en los cultivos (ver discusión). La penicilina, la estreptomicina, la anfotericina B y el medio de queratinocitos que contienen gentamicina se utilizan durante la resuspensión, seguido de un cambio a un medio que contiene penicilina/estreptomicina después del cambio de medio inicial. Este método ha evitado eficazmente la contaminación durante la obtención de imágenes de células vivas prolongadas.
13. Cuente las celdas y siembre la placa (consulte la discusión para obtener comentarios sobre la selección de la densidad de siembra). Para asegurar una distribución uniforme de la siembra, antes de la siembra, vuelva a suspender las células de queratinocitos en la cantidad total de medio a sembrar. Después de una agitación suave por inversión, vórtice ligeramente durante 1-2 s y plaque. Luego, mueva la microplaca en un patrón en forma de cruz (arriba-abajo, izquierda-derecha) 3 veces en la incubadora.
14. Después de 24 h, coloque la placa en la incubadora del sistema de imágenes de células vivas. Realice imágenes de células vivas a 10x con imágenes tomadas cada 20 minutos. Coloque las muestras a 37 °C y 5% de CO₂ en la incubadora adjunta al microscopio.

Resultados

Dadas las múltiples variables que pueden ser manipuladas en este método y que, en última instancia, dan lugar a una variedad de resultados, aquí describimos los errores comunes y sus resultados resultantes, así como proporcionamos resultados ejemplares y las circunstancias detrás de ellos.

Al igual que con cualquier técnica de cultivo celular, la contaminación es una posibilidad (Video complementario 1). Junto con las técnicas estéri...

Discusión

Aquí, hemos detallado un método para el cultivo primario de queratinocitos humanos con el propósito de obtener imágenes de células vivas. Este método adapta las técnicas de cultivo celular existentes mediante siembra de baja densidad y cultivo a largo plazo para permitir estudios exitosos de imágenes de células vivas. El método preferido para la disociación de este tipo de células implica una digestión enzimática de dos pasos, que se ha demostrado que da lugar a queratinoci...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
.05% Trypsin-EDTA (1X), 100 mL	Gibco	25300-054
100 um cell filter	Corning	352360
15 cc Falcon	Corning	352096
50 cc conical Falcon	Corning	352070
6 well microplate	Corning	3516
70% reagent alcohol, 4 L	VWR Chemicals	BDH1164-4LP	Can alternatively dilute your own
Amphotericin B, 50 ml	Corning	30-003-CF	Dilute to 5X (50 ug/mL)
Dipase, 100 ml	Corning	354235	Dilute 1:1 with HBSS, add 1x gentamycin, filter sterilize
Epilife, 50 mL	Gibco	MEP1500CA	Add HKGS, consider antibiotics
Fetal Bovine Serum Value Heat Inactivated FBS, 500 ml	Gibco	A52568-01	FBS
Forceps
Gentamicin, 10 ml	Gibco	15750-060	Dilute to 50 ug/ml for 5X
Hank's Balanced Salt Solution (1X), 500 ml	Gibco	14170-112	(HBSS)
HBSS 5X PSAG			This is HBSS + 5X concentrations of Pen/Strep/Ampho/Gent
Hibiclens, Gallon	Molnlycke	57591	Dilute to 10% using deionized H20
Human Keratinocyte Growth Serum, 5 mL	Gibco	S-001-5	Added to epilife
Penicillin/Streptomycin, 100 ml	Corning	30-002-Cl	Dilute to 5X (comes in 100x stock) for 5X PSA - 1X for media changes
Petri Dish 100 mm x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713
Scalpel Blade NO 23	VWR	76457-480
TrypLE	Gibco	12604021	A less caustic alternative to regular Trypsin
Trypsin Neutralizing Solution			(TNS), this is HBSS with 10% FBS (some use less serum, 5%)