JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

أنواع متعددة من الخلايا في شبكية العين ، بما في ذلك الخلايا البطانية والخلايا العصبية والخلايا الدبقية ، تعبر عن ناقلات الجلوكوز (GLUTs) لتمكين امتصاص الجلوكوز في الخلايا. باستخدام شبكية العين العصبية للفأر خارج الجسم الحي والجلوكوز الفلوري التناظري 6-NBDG ، نصف طريقة سريعة وغير مكلفة نسبيا لقياس امتصاص الجلوكوز في شبكية الفأر بأكملها.

Abstract

شبكية العين عبارة عن نسيج استقلابي عالي مع أنواع متعددة من الخلايا تتطلب الجلوكوز ومشتقاته لإنتاج الطاقة في شكل ATP. تعبر خلايا الشبكية ، بما في ذلك الخلايا البطانية والخلايا العصبية والمستقبلات الضوئية والخلايا الدبقية عن ناقلات الجلوكوز (GLUTs ؛ على سبيل المثال ، GLUT1-4) لتمكين امتصاص الجلوكوز لإنتاج الطاقة. GLUT1 هو ناقل الجلوكوز الأكثر تعبيرا بكثرة في شبكية العين. يمكن هذا البروتوكول الباحثين من قياس امتصاص الجلوكوز في شبكية الفئران العصبية في ظروف خارج الجسم الحي باستخدام نظير الجلوكوز الفلوري 6- (N- (7-Nitrobenz-2-oxa-1،3-diazol-4-yl) amino) -6-Deoxyglucose (6-NBDG). بعد تشريح الشبكية ، يمكن تحديد إجمالي مستويات 6-NBDG في شبكية العين بسهولة عن طريق قياس نقطة النهاية الفلورية باستخدام قارئ الألواح. من أجل الاتساق ، نوصي بتطبيع النتائج إلى إجمالي مستويات البروتين. على الرغم من أن 6-NBDG محدد للغاية ل GLUT1 ، إلا أنه تم اكتشاف امتصاص هذا التناظرية في وجود مثبط GLUT1 BAY-876. على هذا النحو ، يوفر هذا الاختبار طريقة سريعة نسبيا وغير مكلفة لقياس امتصاص الجلوكوز خارج الجسم الحي في شبكية العين العصبية للفأر بالكامل ، والتي يتم بوساطة GLUT1 جزئيا.

Introduction

الجلوكوز هو مستقلب أساسي للشبكية العصبية ، حيث يتم استخدامه لتغذية معدلات عالية من تحلل السكر وتنفس الميتوكوندريا لإنتاج الطاقة في شكل أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) 1. نظرا لأن الجلوكوز هو ركيزة الطاقة المفضلة ، فإن العديد من خلايا الشبكية تعبر عن ناقلات الجلوكوز (GLUTs) لتسهيل امتصاص الجلوكوز من الأوعية الدموية والأنسجة المحيطة2. تتكون GLUTs من عائلة من البروتينات السكرية الغشائية الجوهرية المسؤولة عن نقل الجلوكوز إلى خلايا الثدييات3. ناقل GLUT-1 (GLUT1) هو ناقل الجلوكوز الأساسي في شبكية العين ، ويتم التعبير عنه في جميع أنحاء طبقات الشبكية4 والخلايا البطانية الشعرية التي تشكل حاجز الدم والشبكية (BRB)5. ومن المثير للاهتمام ، في الأمراض التنكسية العصبية للجهاز العصبي المركزي (CNS) ، بما في ذلك مرض الزهايمر ، فإن انخفاض مستويات بروتين GLUT1 وامتصاص الجلوكوز يسبق ضمور الدماغ والخلل الوظيفي العصبي لدى البشر6،7. في نموذج الفئران لارتفاع ضغط الدم في العين ، لوحظت أيضا مستويات أقل من GLUT1 في الشعيرات الدموية8. ينطوي انخفاض نقل الجلوكوز إلى شبكية العين الخارجية على فقدان المستقبلات الضوئية في النماذج الحيوانية لالتهاب الشبكية الصباغي البشري وقد يلعب أيضا دورا في التنكس العصبي للشبكية ، مثل ذلك الذي لوحظ في الجلوكوما. لذلك ، يلزم فهم نقل الجلوكوز في شبكية العين العصبية لتحديد دوره في التنكس العصبي للشبكية.

هنا ، نصف طريقة كيميائية حيوية جديدة وغير مكلفة ومباشرة لقياس امتصاص 6-NBDG في شبكية العين العصبية الفئران خارج الجسم الحي ، أي باستثناء ظهارة الشبكية المصطبغة والمشيمية. بالمقارنة مع نظائر الفلورسنت الأخرى مثل 2-NBDG ، يتكون 6-NBDG من جزء من الجلوكوز تحل فيه مجموعة النيتروبنزوكسي ديازوأمينو الفلورية محل مجموعة الهيدروكسيل في الكربون 6 ، مما يمنع الفسفرة بواسطة الهيكسوكيناز والمزيد من الانهيار الأيضي9. على الرغم من أن 6-NBDG لديه خصوصية عالية ل GLUT1 ، مع تقارب ارتباط أعلى ب 300 مرة من الجلوكوز9 ، إلا أننا نكتشف امتصاص هذا التناظرية في وجود مثبطات GLUT110. على هذا النحو ، يوفر هذا الاختبار طريقة سريعة وغير مكلفة نسبيا لقياس امتصاص الجلوكوز خارج الجسم الحي في شبكية الفأر بأكملها ، والتي يتم بوساطة GLUT1 جزئيا.

يعد قياس امتصاص الجلوكوز في الأنسجة في الوقت الفعلي أمرا صعبا ، وغالبا ما يتطلب وضع العلامات على النظائر المشعة أو طرق تصوير عالية الدقة. هنا ، نستخدم مقايسة كيميائية حيوية فلورية لتحديد امتصاص 6-NBDG بسرعة عبر عينات متعددة من الشبكية في ظروف خارج الجسم الحي . يوفر البروتوكول معلومات حول امتصاص الجلوكوز الكلي في الشبكية. لا يوفر معلومات حول مستويات امتصاص 6-NBDG الخاصة بخلايا الشبكية.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) التابعة للمركز الطبي بجامعة فاندربيلت.

1. التحضير للفحص

ملاحظة: يجب أن يتم التحضير في يوم الفحص مباشرة قبل إجراء الفحص. هذا ضروري بسبب طبيعة البروتوكول الحساسة للوقت.

  1. التحضير العام قبل التجربة
    ملاحظة: 6-NBDG حساس للضوء ويجب حمايته من الضوء. قم بتغطية جميع حلول 6-NBDG بورق الألمنيوم.
    1. حل مخزون 5 ملي مولار 6-NBDG في 50٪ DMSO / 1x PBS مستقر عند -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر. قم بعمل حل مخزون وقم بتخزين 500 ميكرولتر من الحصص للمقايسات المستقبلية.
    2. ضع أنبوبا مخروطيا سعة 50 مل من الوسائط العصبية القاعدية (بدون جلوكوز) على الثلج.
    3. تأكد من ضبط الحمام المائي على 37 درجة مئوية.
    4. تسمية 4 × 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة لكل شبكية العين: 1) تجويع الجلوكوز ، 2) حضانة 6-NBDG ، 3) صوتنة ، و 4) أنبوب تجميع لعينة لفحص بيرس (على سبيل المثال ، إذا كان لديك أربعة شبكية العين في المجموع ، فستحتاج إلى 16 أنبوب طرد مركزي دقيق). انظر الشكل 1 للحصول على ملخص لإعداد الأنبوب.
    5. أضف 200 ميكرولتر من الوسط العصبي القاعدي A من الأنبوب المخروطي سعة 50 مل على الجليد إلى أنابيب الصوتنة المسماة مسبقا واضبطها على الجليد للخطوة 2.5.4.
    6. قم بتشغيل قارئ اللوحة.
    7. قم بإعداد معلومات اللوحة في برنامج قارئ اللوحة باستخدام ميزة مقايسة نقطة النهاية الفلورية مع المعلمات التالية: الإثارة 483 نانومتر ، والانبعاث 550 نانومتر ، والقطع 530 نانومتر (المعلمات المحددة مسبقا ل 6-NBDG).
  2. تحضير الكاشف قبل التجربة: 6-NBDG
    1. اصنع محلولا عمليا ل 6-NBDG في الوسائط العصبية القاعدية A بتركيز نهائي قدره 500 ميكرومتر عن طريق تخفيف مخزون 5 ملي مولار المصنوع في الخطوة 1.1.1.
      ملاحظة: تذكر تغطية جميع حلول 6-NBDG بورق الألمنيوم. قم بعمل حجم مناسب من 500 ميكرومتر 6-NBDG حل العمل للفحص بأكمله (تحتاج إلى 200 ميكرولتر من محلول 6-NBDG العامل لكل شبكية العين ؛ قم بتضمين حجم إضافي للخطأ والمبالغ اللازمة لإنشاء حلول قياسية في الخطوة 2.4).
    2. ماصة 200 ميكرولتر من محلول العمل 6-NBDG في الأنابيب ذات العلامات المسماة مسبقا المصنوعة في الخطوة 1.1.4 لخطوة حضانة 6-NBDG.

2. تشغيل مقايسة الاستيعاب 6-NBDG

ملاحظة: انظر الشكل 2 للحصول على نظرة عامة خطوة بخطوة.

  1. تشريح أنسجة الشبكية
    1. تخدير الفأر باستخدام تخدير الأيزوفلوران المستنشق (2٪ إيزوفلوران في 5٪ ثاني أكسيد الكربون / 95٪ أكسجين).
      ملاحظة: تأكد من تخدير الماوس بشكل كاف عن طريق الضغط على وسادة القدم على كلتا القدمين الخلفيتين. إذا تم تخديره بشكل صحيح ، فلا ينبغي أن تكون هناك حركة اهتزاز (منعكس سحب الدواسة). إذا كانت هناك حركة انعكاسية، فارجع إلى الخطوة 2.1.1.
    2. القتل الرحيم للفأر عن طريق خلع عنق الرحم متبوعا بقطع الرأس ثم استئصال العينين بسرعة. ضع العيون المنزوعة النواة في طبق بتري مملوء ب 5-10 مل من الوسائط العصبية القاعدية المثلجة (بدون الجلوكوز) على الثلج.
      ملاحظة: فيما يلي إرشادات أساسية لتشريح الشبكية العصبية (باستثناء ظهارة صبغة الشبكية والمشيمية) ؛ لمزيد من التعليمات والإرشادات المتعمقة ، راجع البروتوكول11 المنشور مسبقا واتبع قسم "تشريح شبكية الفأر".
    3. ضع طبق بتري تحت مجهر تشريح على الثلج.
    4. قم بطي منديل خال من النسالة في مربع صغير وبللها باستخدام وسائط Neurobasal A.
    5. انقل العين إلى منديل مبلل وخالي من النسالة باستخدام ماصة نقل بلاستيكية مع قطع الطرف.
      ملاحظة: يوفر المنديل الخالي من النسالة احتكاكا متزايدا لمنع العين من الحركة أثناء التشريح.
    6. خذ إبرة 26 جم وثقب جانب القرنية الأمامي للطيف.
    7. استخدم مقص Vannas لقطع طول الطرف من نقطة الثقب لإزالة القرنية.
    8. بمجرد إزالة القرنية ، أمسك الصلبة في منتصف الطريق بين الأطراف ورأس العصب البصري باستخدام زوج من الملقط. باستخدام زوج آخر من الملقط في اليد المعاكسة ، أمسك العدسة وقم بإزالتها بسرعة بحركة واحدة سريعة.
      ملاحظة: إذا تمت إزالة العدسة ببطء ، فستظل شبكية العين ملتصقة بالعدسة ويصبح من الصعب تشريحها.
    9. انقل كوب العين إلى طبق بتري مع Neurobasal A البارد على الثلج.
    10. باستخدام الملقط في كلتا يديك ، خذ كوب العين وامسك الكوب بحذر في أورا سيراتا.
      1. لتحرير كوب الشبكية من الصلبة ، قم بتضييق الغلق على الصلبة باستخدام الملقط ، مع الحرص على عدم تثبيت أنسجة الشبكية.
      2. حرك الملقط بعناية بين الأنسجة الصلبة وأنسجة الشبكية حول الكرة الأرضية بأكملها حتى يتم تحرير شبكية العين بأكملها من الطرف.
    11. باستخدام مقص Vannas ، قم بعمل شق صغير في الصلبة عند الطرف.
    12. خذ ملقطا للاستيلاء على حواف الشق وتقشير الأنسجة الصلبة وصولا إلى منطقة رأس العصب البصري. أمسك الصلبة باستخدام ملقط في اليد غير المهيمنة وقم بتوجيه شبكية العين برفق بعيدا عن الصلبة باستخدام ملقط مغلق في اليد المهيمنة.
    13. قص رأس العصب البصري بالمقص لفصل الشبكية تماما عن الصلبة وأي عصب بصري متبقي.
    14. انقل شبكية العين باستخدام ماصة نقل مشذبة إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق المحضر مسبقا سعة 1.5 مل لتجويع الجلوكوز من الخطوة 1.1.4 ، والذي يحتوي على 200 ميكرولتر من الوسائط العصبية القاعدية A (بدون الجلوكوز) -1 شبكية العين لكل أنبوب.
  2. خطوة تجويع الجلوكوز
    1. انقل الأنابيب من الخطوة 2.1.14 إلى حمام مائي 37 درجة مئوية واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  3. حضانة NBDG
    1. انقل كل شبكية إلى أنبوب جديد مسمى مسبقا لحضانة 6-NBDG من الخطوة 1.1.4 ، والذي يحتوي على 200 ميكرولتر من 500 ميكرومتر 6-NBDG في وسط عصبي قاعدي A من الخطوة 1.2.2.
      ملاحظة: يجب نقل شبكية العين باستخدام ماصة نقل تم قطعها لتكبير الطرف لنقل شبكية العين بأقل قدر من الضرر. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن القيام بذلك باستخدام ملاقط إذا كنت واثقا من قدرة المرء على نقل شبكية العين دون ضرر.
    2. انقل الأنابيب إلى حمام مائي 37 درجة مئوية واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
  4. إعداد معايير 6-NBDG (نطاق التركيز 0 ميكرومتر -40 ميكرومتر)
    ملاحظة: إعداد المعايير خلال فترة حضانة 6 دقائق لمجموعة الدفاع الوطني (الخطوة 2.3.2). يمكن إعداد المعايير في درجة حرارة الغرفة. حماية المحاليل من الضوء.
    1. قم بتسمية أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل # 1-8 للمعايير الثمانية (انظر الشكل 3).
    2. بالنسبة للمعيار #1 (40 ميكرومتر 6-NBDG)، الماصة 32 ميكرولتر من محلول مخزون 500 ميكرومتر 6-NBDG المصنوع في الخطوة 1.2.1.
    3. أضف 368 ميكرولتر من الوسائط العصبية القاعدية A إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق واخلطه جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.
    4. بالنسبة للمعايير # 2-8 ، قم بتخفيف العينات بشكل متسلسل على النحو التالي:
      1. ماصة 200 ميكرولتر من الوسائط العصبية القاعدية في أنابيب # 2-8.
      2. خذ 200 ميكرولتر من الأنبوب القياسي #1 وقم بوضعه في الأنبوب #2، ثم امزجه جيدا مع الماصة عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.
      3. خذ 200 ميكرولتر من الأنبوب القياسي # 2 والماصة في الأنبوب القياسي # 3. تخلط جيدا مع الماصة عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.
      4. خذ 200 ميكرولتر من الأنبوب القياسي #3 وقم بتثبيته في الأنبوب #4، ثم امزجه جيدا عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل.
      5. خذ 200 ميكرولتر من الأنبوب القياسي #4 وقم بتثبيته في الأنبوب #5، ثم اخلطه جيدا عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل.
      6. خذ 200 ميكرولتر من الأنبوب القياسي #5 وقم بتثبيته في الأنبوب #6، ثم امزجه جيدا عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل.
      7. خذ 200 ميكرولتر من الأنبوب القياسي #6 وقم بتثبيته في الأنبوب #7، ثم امزجه جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.
      8. لا تضاف أي محلول إضافي إلى الأنبوب # 8 (على سبيل المثال ، يجب أن يحتوي على 200 ميكرولتر فقط من الوسائط العصبية القاعدية المضافة في الخطوة 2.4.4.1.).
  5. الغسيل والصوتنة والطرد المركزي لجمع العينات
    1. قم بإزالة جميع الأنابيب من الحمام المائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية بمجرد اكتمال حضانة 6-NBDG لمدة 60 دقيقة.
    2. اغسل كل شبكية ب 500 ميكرولتر من الوسائط العصبية القاعدية المثلجة في أسرع وقت ممكن وبعناية.
      1. للغسيل ، قم بإزالة محلول 6-NBDG بماصة ، مع التأكد من عدم لمس أنسجة الشبكية أو إزعاجها.
        ملاحظة: هناك أيضا خيار لنقل شبكية العين بالملاقط من أنبوب حضانة 6-NBDG إلى أنبوب جديد يحتوي على 500 ميكرولتر من الوسائط العصبية القاعدية A. بعد ذلك ، ما عليك سوى القيام ب 3 غسلات إضافية. افعل ذلك إذا كنت مرتاحا لقدرتك على عدم إتلاف شبكية العين بالملاقط.
      2. ثم تخلص من المحلول في وعاء نفايات مناسب. ماصة على الفور 500 ميكرولتر من العصبي القاعدي البارد - وسيط في نفس الأنبوب لاستبدال المحلول الذي تمت إزالته. استبدل الأنابيب الموجودة على الثلج بين الغسل.
    3. كرر 3 مرات أخرى ليصبح المجموع 4 غسلات.
    4. باستخدام ماصة نقل ذات حافة أو ملاقط مشذبة ، انقل شبكية العين بعناية إلى أنابيب الصوتنة التي تحتوي على وسط عصبي قاعدي A على الجليد (انظر الخطوة 1.1.4).
    5. قطعي شبكية العين إلى قطع صغيرة باستخدام مقص تشريح صغير.
      ملاحظة: تأكد من غسل الأدوات في الإيثانول بين تقطيع كل شبكية حتى لا تلوث العينات الأخرى.
    6. قم بتقطيع كل شبكية العين لمدة 5-10 ثوان على سعة 10 وضعها على الفور مرة أخرى على الجليد.
      ملاحظة: تأكد من تنظيف مسبار الصوتنة بين العينات مع الإيثانول 100٪ متبوعا ب H2O عالي النقاء. في هذه المرحلة ، إما أن تبرد جهاز الطرد المركزي مسبقا إلى 4 درجات مئوية أو استخدم جهاز الطرد المركزي في غرفة باردة 4 درجات مئوية إذا كان ذلك متاحا.
    7. جهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة عند السرعة القصوى 21130 × go r إذا كانت أقل من 21130 × جم.
      ملاحظة: أثناء جهاز الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في الخطوة 2.5.7، تم إدخال الماصة سعة 100 ميكرولتر من المعايير #1-8 في الخطوة 2.4 في صفيحة سوداء وشفافة ذات 96 بئرا قاعية.
  6. قراءة العينات على قارئ اللوحة
    1. بعد انتهاء جهاز الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة، قم بإزالة 100 ميكرولتر من المادة الطافية والماصة في اللوحة المكونة من 96 بئرا.
    2. أدخل اللوحة في قارئ الألواح.
      ملاحظة: يجب أن تحتوي اللوحة على 100 ميكرولتر من كل عينة و 100 ميكرولتر من كل معيار.
    3. في برنامج قارئ اللوحة، حدد مقايسة نقطة نهاية التألق مع تحديد المعلمات المحددة في الخطوة 1.1.7.
    4. قم بتشغيل الفحص واحفظ النتائج.
    5. عينات من الماصة من صفيحة 96 بئرا في الأنابيب المسماة مسبقا من 1.1.4 لمقايسة بيرس.
      ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن فحص العينات على الفور بحثا عن البروتين (انظر أدناه) أو تخزينها عند -80 درجة مئوية.
  7. اختبار بيرس لتطبيع البروتين
    ملاحظة: يجب تشغيل مقايسة بيرس بشكل مكرر (كل من المعايير والعينات) لزيادة الدقة.
    1. باستخدام معايير فحص البروتين المخفف مسبقا لمقايسة بيرس، قم بتعبئة 10 ميكرولتر من كل منها في صفيحة سفلية شفافة سعة 96 بئرا.
    2. الماصة 10 ميكرولتر من كل عينة مكررة من الخطوة 2.6.5 في الصفيحة المكونة من 96 بئرا.
    3. أضف 150 ميكرولتر من كاشف بيرس إلى جميع الآبار التي تحتوي على معايير أو عينات. غطي الطبق المكون من 96 بئرا واخلطيهم على شاكر طبق بسرعة متوسطة لمدة 1 دقيقة.
    4. احتضن اللوحة في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق.
    5. أدخل اللوحة في قارئ الألواح. حدد مقايسة نقطة نهاية الامتصاص واضبط الطول الموجي على 660 نانومتر.
    6. قياس امتصاص المعايير والعينات وحفظ النتائج. احسب إجمالي بروتين الميكروغرام في كل عينة عن طريق رسم منحنى قياسي.
  8. حساب امتصاص الشبكية 6-NBDG.
    ملاحظة: يجب تطبيع نتائج 6-NBDG إلى محتوى البروتين الكلي بسبب الأحجام غير المتكافئة لشبكية العين.
    1. باستخدام قيم شدة التألق التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.6 ، استخدم قراءات التألق من المعايير المحددة مسبقا لرسم منحنى قياسي مضان 6-NBDG وتحديد تركيز 6-NBDG (ميكرومتر) في كل عينة.
    2. تطبيع نتائج العينة إلى كميات البروتين المقابلة لتحديد [6-NBDG] ميكرومتر / ميكروغرام بروتين.

النتائج

يوضح الشكل 4 قياسات مضان الجلوكوز التمثيلية من شبكية الفأر WT المحتضنة ب 6-NBDG لفترات زمنية مختلفة. بعد 30 دقيقة من الحضانة ، كانت مستويات 6-NBDG في المتوسط 336 ± 27.91 وحدة فلكية ، بينما بعد 60 دقيقة ، زادت مستويات 6-NBDG إلى متوسط 616.3 ± 8.38 AU. أدى الحضانة الأخرى لمدة 30 دقي?...

Discussion

باختصار ، تمكن الطريقة الموصوفة باحثي العلوم الأساسية من قياس امتصاص نظير الجلوكوز الفلوري ، 6-NBDG ، في شبكية العين العصبية الفئران خارج الجسم الحي . الجلوكوز هو مستقلب أساسي للشبكية العصبية ، ويدعم امتصاصه المعدلات العالية لتحلل السكر وتنفس الميتوكوندريا اللازمين ...

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من خلال أموال الإدارات غير المقيدة الممنوحة إلى Lauren K. Wareham.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
# 5 forcepsKatenaK5-6550Used for retina dissection
1.5 mL microcentrifuge tubesThermo Fisher Scientific05-408-129
26 G x 5/8" needlesol-M112658Used to puncture cornea during dissection
5 mL tubesMTC bioc2540
50 mL tubesAvantor by VWR89039-656
6-NBDGInvitrogenN23106Fluorescent gucose analog
96 well plates black with clear bottomThermo Fisher Scientific265301
Anesthetic Charcoal Filter CannisterReFreshEZ-258Used in anesthesia set up
BAY-876Millipore SigmaSML1774For inhibition of GLUT1.
Centrifuge at 4 °CEppendorfEPP-5424
Compressed gas (5% carbon dioxide, 95% oxygen)AirgasUN3156Used in anesthesia set up
curved forcepsRoboz surgical instrumentRS-5137Used for retina dissection
DDH2OElga LabWaterElga PureLab UltraUsed after ethanol to clean sonicator in between samples
Dissecting microscopeOlympusszX12Used for retina dissection
Ethanol 200 proofDecon laboratories2701To be used to clean sonicator in between samples
Foam floating tube rackThermo Fisher Scientific36-099-2328For tubes during incubation in water bath steps
General scissorsRoboz surgical instrumentRS-680Used for retina dissection
Isoflurane 250 mL bottlePiramal critical careNDC  6679401725Anesthesia
Isoflurane equipmentVetequip sold by VWR89012-492Used to anesthetize prior to euthanasia
Kim wipesVWR82003-820
Microplate readerMolecular devicesSpectraMax M2 microplate readerUsed to read sample
Neurobasal- A mediaGibco12349-015
Nose cone (low profile anesthesia mask)Kent ScientificSOMNO-0801Used to deliver ansethesia
Objective on dissecting microscopeOlympusDF plapo 1x pfUsed for retina dissection
Petri dishVWR25384-088Used during retina dissection
Pierce assay reagentThermo Fisher Scientific1861426
Pipette tips P20Olympus Plastics26-404
Pipette tips P200, P1000, P10 XLVWR76322-150, 76322-154, 76322-132
Pipetteman pipettes P200, P1000, P20, P10VWRF144055M, F144056M, F144058M, F144059M
SoftMax Pro software on computerMolecular devicesSoftMax Pro 7 softwareSoftware used to read sample
Sonic dismembratorThermo Fisher ScientificFB50110Sonicate sample (retina)
Transfer pipettesFisherbrand13-711-9AMUsed to transfer retina from one tube to another
Vannas spring scissorsKatenaK4-5000Used for retina dissection
Water bath set to 37 °CN/AN/AUsed for incubation

References

  1. Casson, R. J., Chidlow, G., Crowston, J. G., Williams, P. A., Wood, J. P. M. Retinal energy metabolism in health and glaucoma. Prog Retin Eye Res. 81, 100881 (2021).
  2. Daniele, L. L., et al. Glucose uptake by GLUT1 in photoreceptors is essential for outer segment renewal and rod photoreceptor survival. FASEB J. 36 (8), e22428 (2022).
  3. Fernandes, R., Hosoya, K. -. I., Pereira, P. Reactive oxygen species downregulate glucose transport system in retinal endothelial cells. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (4), C927-C936 (2011).
  4. Badr, G. A., Tang, J., Ismail-Beigi, F., Kern, T. S. Diabetes downregulates GLUT1 expression in the retina and its microvessels but not in the cerebral cortex or its microvessels. Diabetes. 49 (6), 1016-1021 (2000).
  5. Kumagai, A. K. Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes. Diabetes Metab Res Rev. 15 (4), 261-273 (1999).
  6. Winkler, E. A., et al. GLUT1 reductions exacerbate Alzheimer's disease vasculo-neuronal dysfunction and degeneration. Nat Neurosci. 18 (4), 521-530 (2015).
  7. Mosconi, L., et al. Hypometabolism exceeds atrophy in presymptomatic early-onset familial Alzheimer's disease. J Nucl Med. 47 (11), 1778-1786 (2006).
  8. Moreno, M., et al. Morphological and morphometric changes in rat optic nerve microvessels in a glaucoma experimental model. Arch Soc Esp Oftalmol. 89 (12), 471-476 (2014).
  9. Barros, L. F., et al. Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes. J Neurochem. 109 (s1), 94-100 (2009).
  10. Hamilton, K. E., Bouwer, M. F., Louters, L. L., Looyenga, B. D. Cellular binding and uptake of fluorescent glucose analogs 2-NBDG and 6-NBDG occurs independent of membrane glucose transporters. Biochimie. 190, 1-11 (2021).
  11. Feigenspan, A., Babai, N. Z. Preparation of horizontal slices of adult mouse retina for electrophysiological studies. J Vis Exp. 119, e55173 (2017).
  12. Lundgaard, I., et al. Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism. Nat Commun. 6 (1), 6807 (2015).
  13. Zou, C., Wang, Y., Shen, Z. 2-NBDG as a fluorescent indicator for direct glucose uptake measurement. J Biochem Biophys Methods. 64 (3), 207-215 (2005).
  14. Wareham, L. K., et al. Solving neurodegeneration: common mechanisms and strategies for new treatments. Mol Neurodegener. 17 (1), 23 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

6 NBDG GLUT1 GLUT1 BAY 876

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved