Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

סוגי תאים מרובים ברשתית, כולל תאי אנדותל, נוירונים ותאי גליה, מבטאים מובילי גלוקוז (GLUTs) כדי לאפשר ספיגת גלוקוז לתאים. באמצעות רשתית עצבית של עכבר ex vivo ואנלוגי הגלוקוז הפלואורסצנטי 6-NBDG, אנו מתארים שיטה מהירה וזולה יחסית למדידת ספיגת הגלוקוז בכל רשתית העכבר.

Abstract

הרשתית היא רקמה מטבולית מאוד עם סוגי תאים מרובים הדורשים גלוקוז ונגזרותיו כדי לייצר אנרגיה בצורה של ATP. תאי רשתית, כולל תאי אנדותל, נוירונים, קולטני אור ותאי גליה, מבטאים מובילי גלוקוז (GLUTs; למשל, GLUT1-4) כדי לאפשר ספיגת גלוקוז לייצור אנרגיה. GLUT1 הוא מוביל הגלוקוז המתבטא בשפע ביותר ברשתית. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים למדוד את ספיגת הגלוקוז ברשתית העכברים העצבית בתנאי ex vivo באמצעות אנלוגי הגלוקוז הפלואורסצנטי 6-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-6-Deoxyglucose (6-NBDG). לאחר דיסקציה של הרשתית, ניתן לקבוע בקלות את רמות ה-6-NBDG הכוללות של הרשתית באמצעות מדידת נקודות קצה פלואורסצנטיות באמצעות קורא צלחות. לעקביות, אנו ממליצים לנרמל את התוצאות לרמות החלבון הכוללות. למרות ש-6-NBDG ספציפי מאוד ל-GLUT1, קליטה של אנלוגי זה מזוהה בנוכחות מעכב GLUT1 BAY-876. ככזה, בדיקה זו מספקת שיטה מהירה וזולה יחסית למדידת ספיגת גלוקוז ex vivo ברשתית עצבית שלמה של עכבר, המתווכת חלקית על ידי GLUT1.

Introduction

גלוקוז הוא מטבוליט חיוני לרשתית העצבית, שם הוא משמש לתדלוק שיעורים גבוהים של גליקוליזה ונשימה מיטוכונדריאלית להפקת אנרגיה בצורה של אדנוזין טריפוספט (ATP)1. מכיוון שגלוקוז הוא מצע האנרגיה המועדף, תאי רשתית רבים מבטאים מובילי גלוקוז (GLUTs) כדי להקל על ספיגת הגלוקוז מכלי הדם והרקמות הסובבות2. GLUTs מורכבים ממשפחה של גליקופרוטאינים ממברנה פנימיים האחראים על הובלת גלוקוז לתאי יונקים3. טרנספורטר GLUT-1 (GLUT1) הוא מוביל הגלוקוז העיקרי ברשתית, המתבטא בכל שכבות הרשתית4 ועל ידי תאי אנדותל נימיים המרכיבים את מחסום הדם-רשתית (BRB)5. מעניין לציין כי במחלות ניווניות של מערכת העצבים המרכזית (CNS), כולל מחלת אלצהיימר, ירידה ברמות חלבון GLUT1 וספיגת גלוקוז קודמת לניוון מוחי ותפקוד לקוי של תאי העצב בבני אדם 6,7. במודל חולדה של יתר לחץ דם עיני, רמות נמוכות יותר של GLUT1 נצפו גם בנימים8. הובלה מופחתת של גלוקוז לרשתית החיצונית מעורבת באובדן קולטני אור במודלים של בעלי חיים של רטיניטיס פיגמנטוזה אנושית ועשויה גם למלא תפקיד בניוון עצבי ברשתית, כמו זה שנצפה בגלאוקומה. לכן, נדרשת הבנה של הובלת הגלוקוז ברשתית העצבית כדי לבסס את תפקידה בניוון עצבי ברשתית.

כאן, אנו מתארים שיטה ביוכימית חדשנית, זולה ופשוטה למדידת ספיגת 6-NBDG ברשתית עצבית של עכברים ex vivo , כלומר, למעט אפיתל פיגמנטי ברשתית וכורואיד. בהשוואה לאנלוגים פלואורסצנטיים אחרים כגון 2-NBDG, 6-NBDG מורכב מחלק גלוקוז שעליו קבוצת ניטרובנקסידיאזואמין פלואורסצנטית מחליפה את קבוצת ההידרוקסיל בפחמן 6, ומונעת זרחון על ידי הקסוקינאז ופירוק מטבולי נוסף9. למרות של-6-NBDG יש ספציפיות גבוהה ל-GLUT1, עם זיקה קשירה גבוהה פי 300 מגלוקוז9, אנו מזהים קליטה של אנלוגי זה בנוכחות מעכבי GLUT110. ככזה, בדיקה זו מספקת שיטה מהירה וזולה יחסית למדידת ספיגת גלוקוז ex vivo בכל רשתית העכבר, המתווכת חלקית על ידי GLUT1.

מדידת ספיגת הגלוקוז ברקמות בזמן אמת היא מאתגרת, ולעתים קרובות דורשת תיוג רדיואיזוטופים או שיטות הדמיה ברזולוציה גבוהה. כאן, אנו משתמשים בבדיקה ביוכימית פלואורסצנטית כדי לקבוע במהירות ספיגת 6-NBDG על פני דגימות רשתית מרובות בתנאי ex vivo . הפרוטוקול מספק מידע על ספיגת הגלוקוז הכוללת ברשתית; הוא אינו מספק מידע על רמות ספציפיות לתאי הרשתית של ספיגת 6-NBDG.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של המרכז הרפואי של אוניברסיטת ונדרבילט.

1. הכנה לבדיקה

הערה: ההכנה צריכה להתבצע ביום הבדיקה מיד לפני הפעלת הבדיקה. זה הכרחי בשל האופי הרגיש לזמן של הפרוטוקול.

  1. הכנה כללית לקראת הניסוי
    הערה: 6-NBDG רגיש לאור ויש להגן עליו מפני אור. מכסים את כל פתרונות 6-NBDG בנייר אלומיניום.
    1. פתרון מלאי של 5 מ"מ 6-NBDG ב-50% DMSO/1x PBS יציב ב-20 מעלות צלזיוס למשך 6 חודשים. הכינו פתרון מלאי ואחסנו 500 מיקרוליטר מכסות לבדיקות עתידיות.
    2. הנח צינור חרוטי של 50 מ"ל של מדיה נוירובזלית-A (ללא גלוקוז) על קרח.
    3. ודא שאמבט המים מכוון ל-37 מעלות צלזיוס.
    4. תווית 4 × צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל לרשתית: 1) רעב גלוקוז, 2) דגירה של 6-NBDG, 3) סוניקציה ו-4) צינור איסוף לדגימה לבדיקת פירס (כלומר, אם יש לך ארבע רשתית בסך הכל, תזדקק ל-16 צינורות מיקרו-צנטריפוגה). ראה איור 1 לסיכום של הגדרת הצינור.
    5. הוסף 200 מיקרוליטר של מדיום נוירו-בסיסי A מהצינור החרוטי של 50 מ"ל על קרח לצינורות הסוניקציה המסומנים מראש והניח על קרח לשלב 2.5.4.
    6. הפעל את קורא הצלחות.
    7. הגדר מידע על לוחית בתוכנת קורא לוחות באמצעות תכונת בדיקת נקודת הקצה הקרינה עם הפרמטרים הבאים: עירור 483 ננומטר, פליטה 550 ננומטר וניתוק 530 ננומטר (פרמטרים שנקבעו מראש עבור 6-NBDG).
  2. הכנת ריאגנטים לקראת הניסוי: 6-NBDG
    1. צור פתרון עבודה של 6-NBDG במדיה נוירו-בזאלית-A בריכוז סופי של 500 מיקרומטר על ידי דילול מלאי ה-5 מ"מ שנעשה בשלב 1.1.1.
      הערה: זכור לכסות את כל פתרונות 6-NBDG בנייר אלומיניום. צור נפח מתאים של 500 μM 6-NBDG פתרון עבודה עבור הבדיקה כולה (דרוש 200 μL של תמיסת 6-NBDG עובדת לכל רשתית; כלול נפח נוסף עבור שגיאות וכמויות הדרושות ליצירת פתרונות סטנדרטיים בשלב 2.4.).
    2. פיפטה 200 מיקרוליטר של תמיסת עבודה 6-NBDG לתוך הצינורות המסומנים מראש שנעשו בשלב 1.1.4 לשלב הדגירה של 6-NBDG.

2. הפעלת בדיקת קליטה 6-NBDG

הערה: ראה איור 2 לסקירה כללית שלב אחר שלב.

  1. דיסקציה של רקמת הרשתית
    1. הרדימו את העכבר באמצעות הרדמת איזופלורן בשאיפה (2% איזופלורן ב-5% פחמן דו חמצני/95% חמצן).
      הערה: ודא שהעכבר מורדם כראוי על-ידי צביטה של כרית כף הרגל בשתי כפות הרגליים האחוריות. אם מורדמים כראוי, לא אמורה להיות תנועת טלטול (רפלקס נסיגת דוושה). אם יש תנועת רפלקס, חזור לשלב 2.1.1.
    2. המתת חסד של העכבר על ידי פריקת צוואר הרחם ואחריה עריפת ראש, ולאחר מכן הוצאת העיניים במהירות. הנח את העיניים המנופחות לתוך צלחת פטרי מלאה ב-5-10 מ"ל של מדיה נוירו-בזאלית-A קרה כקרח (ללא גלוקוז) על קרח.
      הערה: להלן הנחיות בסיסיות לדיסקציה עצבית של הרשתית (למעט אפיתל פיגמנט ברשתית וכורואיד); לקבלת הדרכה והדרכה מעמיקה יותר, עיין בפרוטוקול11 שפורסם בעבר ופעל לפי הסעיף "דיסקציה של רשתית העכבר".
    3. מניחים את צלחת הפטרי מתחת למיקרוסקופ דיסקציה על קרח.
    4. קפלו מגבון נטול מוך לריבוע קטן והרטיבו אותו במדיה Neurobasal A.
    5. העבירו עין על המגבון הלח ונטול המוך באמצעות פיפטת העברה מפלסטיק כשהקצה גזוז.
      הערה: המגבון נטול המוך מספק חיכוך מוגבר כדי למנוע מהעין לנוע במהלך הדיסקציה.
    6. קח מחט 26 גרם ונקב את צד הקרנית הקדמי ללימבוס.
    7. השתמש במספריים של Vannas כדי לחתוך לאורך הלימבוס מנקודת הניקוב כדי להסיר את הקרנית.
    8. לאחר הסרת הקרנית, אחוז בסקלרה באמצע הדרך בין הלימבוס לראש עצב הראייה עם זוג מלקחיים. בעזרת זוג מלקחיים נוסף ביד הנגדית, אחוז בעדשה והסר אותה במהירות בתנועה מהירה אחת.
      הערה: אם מסירים את העדשה לאט, הרשתית תישאר מחוברת לעדשה ויהיה קשה לנתח אותה.
    9. העבירו את העיניים לצלחת פטרי עם נוירובזל A קר על קרח.
    10. בעזרת מלקחיים בשתי הידיים, קחו את העיניים והחזיקו בזהירות את הגביעונית באורה סרטה.
      1. כדי לשחרר את גביעונית הרשתית מהסקלרה, יש להדק את הסקלרה באמצעות מלקחיים, תוך הקפדה לא להדק את רקמת הרשתית.
      2. החלק את המלקחיים בזהירות בין רקמת הסקלר לרקמת הרשתית סביב כל הגלובוס עד שכל הרשתית משתחררת מהלימבוס.
    11. בעזרת מספריים של ואנאס, בצע חתך קטן בסקלרה בלימבוס.
    12. קח מלקחיים כדי לתפוס את שולי החתך ולקלף את רקמת הסקלר עד לאזור ראש עצב הראייה. אחוז בסקלרה באמצעות מלקחיים ביד הלא דומיננטית והוביל בעדינות את הרשתית הרחק מהסקלרה באמצעות מלקחיים סגורים ביד הדומיננטית.
    13. חתכו את ראש עצב הראייה במספריים כדי לנתק את הרשתית לחלוטין מהסקלרה ומכל עצב הראייה שנותר.
    14. העבירו את הרשתית באמצעות פיפטת העברה גזומה לתוך צינור המיקרו-צנטריפוגה 1.5 מ"ל שהוכן מראש לרעב גלוקוז משלב 1.1.4, המכיל 200 מיקרוליטר של מדיה נוירו-בזאלית-A (ללא גלוקוז)-1 רשתית לכל צינור.
  2. שלב הרעבת גלוקוז
    1. העבירו את הצינורות משלב 2.1.14 לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  3. דגירה NBDG
    1. העבירו כל רשתית לצינור חדש עם תווית מראש לדגירה של 6-NBDG משלב 1.1.4, המכיל 200 מיקרוליטר של 500 מיקרומטר 6-NBDG במדיום נוירו-בזאלי-A משלב 1.2.2.
      הערה: יש להעביר את הרשתית באמצעות פיפטת העברה שנחתכה כדי להגדיל את הקצה כך שתעביר את הרשתית במינימום נזק. בנוסף, ניתן לעשות זאת עם פינצטה אם אתה בטוח ביכולתו של אדם להעביר רשתית ללא נזק.
    2. מעבירים את הצינורות לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
  4. הכנת תקני 6-NBDG (תחום ריכוזים 0-40 מיקרומטר)
    הערה: הכן את התקנים במהלך תקופת הדגירה של 60 דקות 6-NBDG (שלב 2.3.2). ניתן להכין תקנים בטמפרטורת החדר. הגן על פתרונות מפני אור.
    1. סמן צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל #1-8 עבור 8 התקנים (ראה איור 3).
    2. עבור תקן #1 (40 מיקרומטר 6-NBDG), פיפטה 32 מיקרוליטר של תמיסת מלאי 500 מיקרומטר 6-NBDG המיוצרת בשלב 1.2.1.
    3. הוסף 368 מיקרוליטר של מדיה נוירו-בזאלית-A לתוך צינור המיקרו-צנטריפוגה וערבב היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
    4. עבור תקנים #2-8, יש לדלל דגימות באופן סדרתי כדלקמן:
      1. פיפטה 200 מיקרוליטר של מדיה נוירו-בזאלית-A לתוך צינורות #2-8.
      2. קח 200 מיקרוליטר מהצינור הרגיל #1 והכניס אותו לצינור #2, ואז ערבב היטב עם הפיפטה על ידי פיפטה למעלה ולמטה.
      3. קח 200 מיקרוליטר מצינור רגיל #2 ופיפטה לצינור סטנדרטי #3. מערבבים היטב עם הפיפטה על ידי פיפטה למעלה ולמטה.
      4. קח 200 מיקרוליטר מהצינור הרגיל #3 והכניס אותו לצינור #4, ואז ערבב היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
      5. קח 200 מיקרוליטר מהצינור הסטנדרטי #4 והכניס אותו לצינור #5, ואז ערבב היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
      6. קח 200 מיקרוליטר מהצינור הסטנדרטי #5 והכניס אותו לצינור #6, ואז ערבב אותו היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
      7. קח 200 מיקרוליטר מהצינור הרגיל #6 והכניס אותו לצינור #7, ואז ערבב אותו היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
      8. אל תוסיפו תמיסה נוספת לשפופרת #8 (כלומר, היא צריכה להכיל רק 200 מיקרוליטר של מדיה נוירו-בזאלית-A שנוספה בשלב 2.4.4.1).
  5. כביסה, סוניקציה וצנטריפוגה לאיסוף דגימות
    1. הסר את כל הצינורות מאמבט המים של 37 מעלות צלזיוס לאחר השלמת הדגירה של 60 דקות 6-NBDG.
    2. שטפו כל רשתית עם 500 מיקרוליטר של מדיה נוירו-בזאלית-A קרה כקרח במהירות ובזהירות האפשרית.
      1. כדי לשטוף, הסר את תמיסת 6-NBDG בעזרת פיפטה, והקפד לא לגעת או להפריע לרקמת הרשתית.
        הערה: קיימת גם אפשרות להעביר את הרשתית בפינצטה מצינור הדגירה 6-NBDG לצינור טרי המכיל 500 uL של מדיה נוירו-בזאלית-A. לאחר מכן, עליך לבצע רק 3 כביסות נוספות. עשה זאת אם אתה מרגיש בנוח עם היכולת שלך לא לפגוע ברשתית עם פינצטה.
      2. לאחר מכן, השליכו את התמיסה למכל פסולת מתאים. מיד פיפטה 500 מיקרוליטר של נוירו-בזאלי קר - מדיום לאותו צינור כדי להחליף את התמיסה שהוסרה. החלף את הצינורות על קרח בין השטיפות.
    3. חזור על הפעולה 3 פעמים נוספות בסך הכל 4 כביסות.
    4. בעזרת פיפטת העברה עם קצה גזוז או פינצטה, העבירו בזהירות את הרשתית לצינורות הסוניקציה המכילים מדיום נוירו-בסיסי A על קרח (ראה שלב 1.1.4).
    5. קוצצים את הרשתית לחתיכות קטנות בעזרת מספריים קטנים.
      הערה: הקפד לשטוף כלים באתנול בין קיצוץ כל רשתית כדי לא לזהם דוגמאות אחרות.
    6. סוניקציה של כל רשתית למשך 5-10 שניות על משרעת של 10 ומיד הנח אותה בחזרה על הקרח.
      הערה: הקפד לנקות את בדיקת הסוניקציה בין דגימות עם 100% אתנול ואחריו H2O טהור במיוחד. בשלב זה, יש לקרר מראש את הצנטריפוגה ל-4 מעלות צלזיוס או להשתמש בצנטריפוגה בחדר קירור של 4 מעלות צלזיוס אם זמין.
    7. צנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות במהירות 21130 x g or מהירות מקסימלית אם נמוכה מ-21130 x גרם.
      הערה: במהלך הצנטריפוגה של 15 דקות בשלב 2.5.7, פיפטה 100 מיקרוליטר של תקנים #1-8 נעשתה בשלב 2.4 לצלחת תחתונה שחורה ושקופה של 96 בארות.
  6. דוגמאות קריאה בקורא צלחות
    1. לאחר סיום הצנטריפוגה של 15 דקות, הסר 100 מיקרוליטר של סופרנטנט ופיפטה לתוך צלחת 96 הבארות.
    2. הכנס צלחת לקורא צלחות.
      הערה: הצלחת צריכה להכיל 100 מיקרוליטר מכל דגימה ו-100 מיקרוליטר מכל תקן.
    3. בתוכנת קורא הלוחות, בחר בדיקת נקודת קצה פלואורסצנטית עם פרמטרים שנבחרו בשלב 1.1.7.
    4. הפעל את הבדיקה ושמור את התוצאות.
    5. דגימות פיפטה מצלחת 96 בארות לתוך הצינורות המסומנים מראש מ-1.1.4 לבדיקת פירס.
      הערה: בשלב זה, ניתן לבדוק מיד דגימות לחלבון (ראה להלן) או לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  7. בדיקת פירס לנורמליזציה של חלבון
    הערה: יש להריץ את בדיקת פירס בשכפול (הן תקנים והן דוגמאות) לדיוק מוגבר.
    1. באמצעות תקני בדיקת החלבון המדולל מראש של בדיקת פירס, פיפטה 10 מיקרוליטר מכל אחד משוכפל לתוך צלחת תחתונה שקופה של 96 בארות.
    2. פיפטה 10 מיקרוליטר של כל אחת מהדגימות בשכפול משלב 2.6.5 לתוך צלחת 96 הבארות.
    3. הוסף 150 מיקרוליטר של מגיב פירס לכל הבארות המכילות תקנים או דגימות. מכסים את צלחת 96 הבארות ומערבבים על שייקר צלחת במהירות בינונית למשך דקה.
    4. דגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר (RT) למשך 5 דקות.
    5. הכנס צלחת לקורא צלחות. בחר בדיקת נקודת קצה ספיגה והגדר את אורך הגל ל-660 ננומטר.
    6. למדוד את ספיגת התקנים והדגימות ולשמור את התוצאות. חשב את חלבון המיקרוגרם הכולל בכל דגימה על ידי התוויית עקומה סטנדרטית.
  8. חישוב קליטת 6-NBDG ברשתית.
    הערה: יש לנרמל את תוצאות 6-NBDG לתכולת החלבון הכוללת עקב גדלים לא אחידים של הרשתית.
    1. באמצעות ערכי עוצמת הקרינה שהתקבלו בשלב 2.6, השתמש בקריאות הקרינה מתקנים שנקבעו מראש כדי לשרטט עקומת תקן פלואורסצנטי של 6-NBDG ולכמת ריכוז 6-NBDG (מיקרומטר) בכל דגימה.
    2. נרמל את תוצאות הדגימה לכמויות החלבון המתאימות כדי לקבוע חלבון [6-NBDG] μM/μg.

תוצאות

איור 4 מציג מדידות פלואורסצנטיות מייצגות של גלוקוז מרשתית עכבר WT שהודגרה עם 6-NBDG לפרקי זמן שונים. לאחר 30 דקות דגירה, רמות 6-NBDG היו בממוצע 336 ±-27.91 יחידות אסטרונומיות, בעוד שלאחר 60 דקות, רמות 6-NBDG עלו לממוצע של 616.3 ±-8.38 יחידות אסטרונומיות. דגירה נוספת של 30 דקות הו...

Discussion

לסיכום, השיטה המתוארת מאפשרת לחוקרי מדע בסיסי למדוד את הספיגה של אנלוגי הגלוקוז הפלואורסצנטי, 6-NBDG, ברשתית העצבית של עכברי ex vivo . גלוקוז הוא מטבוליט חיוני לרשתית העצבית, ספיגתו תומכת בשיעורים הגבוהים של גליקוליזה ונשימה מיטוכונדריאלית הדרושים להפקת אנרגיה בצורה של ?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי כספים מחלקתיים בלתי מוגבלים שהוענקו ללורן ק. וורהאם.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
# 5 forcepsKatenaK5-6550Used for retina dissection
1.5 mL microcentrifuge tubesThermo Fisher Scientific05-408-129
26 G x 5/8" needlesol-M112658Used to puncture cornea during dissection
5 mL tubesMTC bioc2540
50 mL tubesAvantor by VWR89039-656
6-NBDGInvitrogenN23106Fluorescent gucose analog
96 well plates black with clear bottomThermo Fisher Scientific265301
Anesthetic Charcoal Filter CannisterReFreshEZ-258Used in anesthesia set up
BAY-876Millipore SigmaSML1774For inhibition of GLUT1.
Centrifuge at 4 °CEppendorfEPP-5424
Compressed gas (5% carbon dioxide, 95% oxygen)AirgasUN3156Used in anesthesia set up
curved forcepsRoboz surgical instrumentRS-5137Used for retina dissection
DDH2OElga LabWaterElga PureLab UltraUsed after ethanol to clean sonicator in between samples
Dissecting microscopeOlympusszX12Used for retina dissection
Ethanol 200 proofDecon laboratories2701To be used to clean sonicator in between samples
Foam floating tube rackThermo Fisher Scientific36-099-2328For tubes during incubation in water bath steps
General scissorsRoboz surgical instrumentRS-680Used for retina dissection
Isoflurane 250 mL bottlePiramal critical careNDC  6679401725Anesthesia
Isoflurane equipmentVetequip sold by VWR89012-492Used to anesthetize prior to euthanasia
Kim wipesVWR82003-820
Microplate readerMolecular devicesSpectraMax M2 microplate readerUsed to read sample
Neurobasal- A mediaGibco12349-015
Nose cone (low profile anesthesia mask)Kent ScientificSOMNO-0801Used to deliver ansethesia
Objective on dissecting microscopeOlympusDF plapo 1x pfUsed for retina dissection
Petri dishVWR25384-088Used during retina dissection
Pierce assay reagentThermo Fisher Scientific1861426
Pipette tips P20Olympus Plastics26-404
Pipette tips P200, P1000, P10 XLVWR76322-150, 76322-154, 76322-132
Pipetteman pipettes P200, P1000, P20, P10VWRF144055M, F144056M, F144058M, F144059M
SoftMax Pro software on computerMolecular devicesSoftMax Pro 7 softwareSoftware used to read sample
Sonic dismembratorThermo Fisher ScientificFB50110Sonicate sample (retina)
Transfer pipettesFisherbrand13-711-9AMUsed to transfer retina from one tube to another
Vannas spring scissorsKatenaK4-5000Used for retina dissection
Water bath set to 37 °CN/AN/AUsed for incubation

References

  1. Casson, R. J., Chidlow, G., Crowston, J. G., Williams, P. A., Wood, J. P. M. Retinal energy metabolism in health and glaucoma. Prog Retin Eye Res. 81, 100881 (2021).
  2. Daniele, L. L., et al. Glucose uptake by GLUT1 in photoreceptors is essential for outer segment renewal and rod photoreceptor survival. FASEB J. 36 (8), e22428 (2022).
  3. Fernandes, R., Hosoya, K. -. I., Pereira, P. Reactive oxygen species downregulate glucose transport system in retinal endothelial cells. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (4), C927-C936 (2011).
  4. Badr, G. A., Tang, J., Ismail-Beigi, F., Kern, T. S. Diabetes downregulates GLUT1 expression in the retina and its microvessels but not in the cerebral cortex or its microvessels. Diabetes. 49 (6), 1016-1021 (2000).
  5. Kumagai, A. K. Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes. Diabetes Metab Res Rev. 15 (4), 261-273 (1999).
  6. Winkler, E. A., et al. GLUT1 reductions exacerbate Alzheimer's disease vasculo-neuronal dysfunction and degeneration. Nat Neurosci. 18 (4), 521-530 (2015).
  7. Mosconi, L., et al. Hypometabolism exceeds atrophy in presymptomatic early-onset familial Alzheimer's disease. J Nucl Med. 47 (11), 1778-1786 (2006).
  8. Moreno, M., et al. Morphological and morphometric changes in rat optic nerve microvessels in a glaucoma experimental model. Arch Soc Esp Oftalmol. 89 (12), 471-476 (2014).
  9. Barros, L. F., et al. Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes. J Neurochem. 109 (s1), 94-100 (2009).
  10. Hamilton, K. E., Bouwer, M. F., Louters, L. L., Looyenga, B. D. Cellular binding and uptake of fluorescent glucose analogs 2-NBDG and 6-NBDG occurs independent of membrane glucose transporters. Biochimie. 190, 1-11 (2021).
  11. Feigenspan, A., Babai, N. Z. Preparation of horizontal slices of adult mouse retina for electrophysiological studies. J Vis Exp. 119, e55173 (2017).
  12. Lundgaard, I., et al. Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism. Nat Commun. 6 (1), 6807 (2015).
  13. Zou, C., Wang, Y., Shen, Z. 2-NBDG as a fluorescent indicator for direct glucose uptake measurement. J Biochem Biophys Methods. 64 (3), 207-215 (2005).
  14. Wareham, L. K., et al. Solving neurodegeneration: common mechanisms and strategies for new treatments. Mol Neurodegener. 17 (1), 23 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

6 NBDGGLUT1ex vivoGLUT1BAY 876

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved