Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Endotel hücreleri, nöronlar ve glial hücreler dahil olmak üzere retinadaki çoklu hücre tipleri, hücrelere glikoz alımını sağlamak için glikoz taşıyıcılarını (GLUT'lar) eksprese eder. Ex vivo fare nöral retinası ve floresan glukoz analogu 6-NBDG'yi kullanarak, tüm fare retinasındaki glukoz alımını ölçmek için nispeten hızlı ve ucuz bir yöntem tarif ediyoruz.

Özet

Retina, ATP şeklinde enerji üretmek için glikoz ve türevlerine ihtiyaç duyan çoklu hücre tiplerine sahip oldukça metabolik bir dokudur. Endotel hücreleri, nöronlar, fotoreseptörler ve glial hücreler dahil olmak üzere retina hücreleri, enerji üretimi için glikoz alımını sağlamak için glikoz taşıyıcılarını (GLUT'lar; örneğin, GLUT1-4) eksprese eder. GLUT1, retinada en bol miktarda eksprese edilen glikoz taşıyıcısıdır. Bu protokol, araştırmacıların, floresan glikoz analogu 6-(N-(7-Nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4-il)amino)-6-Deoksiglukoz (6-NBDG) kullanarak ex vivo koşullarda nöral murin retinasındaki glikoz alımını ölçmelerini sağlar. Retina diseksiyonundan sonra, toplam retinal 6-NBDG seviyeleri, bir plaka okuyucu kullanılarak floresan son nokta ölçümü ile kolayca belirlenebilir. Tutarlılık için, sonuçların toplam protein seviyelerine normalleştirilmesini öneririz. 6-NBDG, GLUT1 için oldukça spesifik olmasına rağmen, bu analogun alımı GLUT1 inhibitörü BAY-876 varlığında tespit edilir. Bu nedenle, bu test, kısmen GLUT1'in aracılık ettiği tüm fare nöral retinasında ex vivo glikoz alımını ölçmek için nispeten hızlı ve ucuz bir yöntem sağlar.

Giriş

Glikoz, adenozin trifosfat (ATP) formunda enerji üretmek için yüksek oranda glikoliz ve mitokondriyal solunumu beslemek için kullanıldığı nöral retina için önemli bir metabolittir.1. Glikoz tercih edilen enerji substratı olduğundan, birçok retina hücresi, vaskülatürden ve çevresindeki dokudan glikoz alımını kolaylaştırmak için glikoz taşıyıcılarını (GLUT'lar) eksprese eder2. GLUT'lar, memeli hücrelerine glikoz taşınmasından sorumlu olan bir intrinsik membran glikoprotein ailesini içerir3. GLUT taşıyıcı-1 (GLUT1), retina katmanları4 boyunca ve kan-retina bariyerini (BRB) 5 oluşturan kılcal endotel hücreleri tarafından eksprese edilen retinadaki birincil glikoz taşıyıcısıdır. İlginç bir şekilde, Alzheimer hastalığı da dahil olmak üzere merkezi sinir sisteminin (CNS) nörodejeneratif hastalıklarında, GLUT1 protein seviyelerinde ve glikoz alımında bir azalma, insanlarda beyin atrofisi ve nöronal disfonksiyondan önce gelir 6,7. Bir sıçan oküler hipertansiyon modelinde, kılcal damarlarda daha düşük GLUT1 seviyeleri de gözlenmiştir8. Glikozun dış retinaya daha az taşınması, insan retinitis pigmentosa'nın hayvan modellerinde fotoreseptör kaybında rol oynar ve ayrıca glokomda gözlenen gibi retinal nörodejenerasyonda da rol oynayabilir. Bu nedenle, retinal nörodejenerasyondaki rolünü belirlemek için nöral retinada glikoz taşınmasının anlaşılması gerekmektedir.

Burada, ex vivo murin nöral retinada, yani retina pigmentli epitel ve koroid hariç olmak üzere 6-NBDG tutulumunu ölçmek için yeni, ucuz ve basit bir biyokimyasal yöntem tanımlanmaktadır. 2-NBDG gibi diğer floresan analoglarla karşılaştırıldığında, 6-NBDG, üzerinde bir floresan nitrobenzoksidiazoamino grubunun karbon 6'daki hidroksil grubunun yerini aldığı, hekzokinaz ile fosforilasyonu ve daha fazla metabolik parçalanmayı önleyen bir glikoz parçasından oluşur9. 6-NBDG, glukoz9'dan 300 kat daha yüksek bir bağlanma afinitesi ile GLUT1 için yüksek özgüllüğe sahip olmasına rağmen, bu analogun GLUT1 inhibitörleri10 varlığında tutulumunu tespit ettik. Bu nedenle, bu tahlil, kısmen GLUT1 aracılı olan tüm fare retinasında ex vivo glikoz alımını ölçmek için nispeten hızlı ve ucuz bir yöntem sağlar.

Dokudaki glikoz alımının gerçek zamanlı olarak ölçülmesi zordur ve genellikle radyoizotop etiketleme veya yüksek çözünürlüklü görüntüleme yöntemleri gerektirir. Burada, ex vivo koşullarda birden fazla retina örneğinde 6-NBDG alımını hızlı bir şekilde belirlemek için bir floresan biyokimyasal test kullanıyoruz. Protokol, toplam retinal glukoz alımı hakkında bilgi sağlar; retina hücresine özgü 6-NBDG tutulum seviyeleri hakkında bilgi sağlamaz.

Protokol

Burada açıklanan tüm yöntemler Vanderbilt Üniversitesi Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Test için hazırlık

NOT: Hazırlık, tahlil çalıştırılmadan hemen önce tahlil gününde yapılmalıdır. Bu, protokolün zamana duyarlı doğası nedeniyle gereklidir.

  1. Deney öncesi genel hazırlık
    NOT: 6-NBDG ışığa duyarlıdır ve ışıktan korunmalıdır. Tüm 6-NBDG çözeltilerini alüminyum folyo ile kaplayın.
    1. %50 DMSO/1x PBS'de 5 mM 6-NBDG'lik bir stok çözeltisi, -20 °C'de 6 ay boyunca stabildir. Bir stok çözeltisi hazırlayın ve gelecekteki tahliller için 500 μL'lik alikotları saklayın.
    2. Buzun üzerine 50 mL'lik konik bir Neurobazal-A ortamı tüpü (glikozsuz) yerleştirin.
    3. Su banyosunun 37 °C'ye ayarlandığından emin olun.
    4. Retina başına 4 × 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünü etiketleyin: 1) glikoz açlığı, 2) 6-NBDG inkübasyonu, 3) sonikasyon ve 4) Pierce testi için numune için toplama tüpü (yani, toplamda dört retinanız varsa, 16 mikrosantrifüj tüpüne ihtiyacınız olacaktır). Tüp kurulumunun bir özeti için Şekil 1'e bakın.
    5. Buz üzerindeki 50 mL konik tüpten önceden etiketlenmiş sonikasyon tüplerine 200 μL nörobazal A ortamı ekleyin ve adım 2.5.4 için buz üzerine ayarlayın.
    6. Plaka okuyucuyu açın.
    7. Aşağıdaki parametrelerle floresan son nokta testi özelliğini kullanarak plaka okuyucu yazılımında plaka bilgilerini ayarlayın: uyarma 483 nm, emisyon 550 nm ve kesme 530 nm (6-NBDG için önceden belirlenmiş parametreler).
  2. Deney öncesinde reaktif hazırlama: 6-NBDG
    1. Adım 1.1.1'de yapılan 5 mM stoğunu seyrelterek 500 μM'lik bir nihai konsantrasyonda nörobazal-A ortamında 6-NBDG'lik bir çalışma çözeltisi yapın.
      NOT: Tüm 6-NBDG solüsyonlarını alüminyum folyo ile kaplamayı unutmayın. Tüm tahlil için uygun bir hacimde 500 μM 6-NBDG çalışma çözeltisi yapın (retina başına 200 μL çalışma 6-NBDG çözeltisine ihtiyaç duyar; hata için ekstra hacim ve adım 2.4'te standart çözeltiler oluşturmak için gereken miktarları dahil edin).
    2. 200 μL 6-NBDG çalışma solüsyonunu, 6-NBDG inkübasyon adımı için adım 1.1.4'te yapılan önceden etiketlenmiş tüplere pipetleyin.

2. 6-NBDG alım testinin çalıştırılması

NOT: Adım adım genel bakış için Şekil 2'ye bakın.

  1. Retina dokusu diseksiyonu
    1. Fareyi inhale izofluran anestezisi (% 5 karbondioksit /% 95 oksijen içinde% 2 izofluran) kullanarak sakinleştirin.
      NOT: Ayak pedini her iki arka ayağınıza sıkıştırarak farenin yeterince uyuşturulduğunu onaylayın. Uygun şekilde uyuşturulursa, sarsıntı hareketi olmamalıdır (pedal çekme refleksi.) Bir refleks hareketi varsa, adım 2.1.1'e dönün.
    2. Fareyi servikal çıkık ve ardından dekapitasyon ile ötenazi yapın ve ardından gözleri hızla enüklee edin. Enükleasyonlu gözleri buz üzerinde 5-10 mL buz gibi soğuk nörobazal-A ortamı (glikozsuz) ile doldurulmuş bir Petri kabına yerleştirin.
      NOT: Aşağıda nöral retinal diseksiyon için temel kılavuzlar verilmiştir (retina pigment epiteli ve koroid hariç); Daha ayrıntılı talimat ve rehberlik için, daha önce yayınlanmış bir protokol11'e bakın ve "Fare retina diseksiyonu" bölümünü izleyin.
    3. Petri kabını buz üzerinde diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin.
    4. Tüy bırakmayan bir mendili küçük bir kareye katlayın ve Neurobazal A ortamı ile nemlendirin.
    5. Ucu kesilmiş plastik bir transfer pipeti kullanarak nemli, tüy bırakmayan mendilin üzerine bir göz atın.
      NOT: Tüy bırakmayan mendil, diseksiyon sırasında gözün hareket etmesini önlemek için daha fazla sürtünme sağlar.
    6. 26 G'lık bir iğne alın ve korneanın ön tarafını limbusa kadar delin.
    7. Korneayı çıkarmak için limbusu delinme noktasından kesmek için Vannas makasını kullanın.
    8. Kornea çıkarıldıktan sonra, bir çift forseps ile sklerayı limbus ile optik sinir başı arasında ortasından kavrayın. Diğer elinizde başka bir forseps kullanarak lensi kavrayın ve tek bir hızlı hareketle hızlıca çıkarın.
      NOT: Lens yavaşça çıkarılırsa, retina lense bağlı kalacak ve incelenmesi zorlaşacaktır.
    9. Göz kabını buz üzerinde soğuk Neurobazal A içeren bir Petri kabına aktarın.
    10. Her iki elinizde forseps kullanarak, göz kabını alın ve bardağı ora serrata'da dikkatlice tutun.
      1. Retina kabını skleradan serbest bırakmak için, retina dokusunu sıkıştırmamaya dikkat ederek forseps kullanarak sklerayı sıkıştırın.
      2. Forsepsleri, tüm retina limbustan serbest bırakılana kadar tüm küre boyunca skleral doku ile retina dokusu arasında dikkatlice kaydırın.
    11. Vannas makasını kullanarak, limbusta sklerada küçük bir kesi yapın.
    12. Kesiğin kenarlarını tutmak için forseps alın ve skleral dokuyu optik sinir başı bölgesine kadar soyun. Baskın olmayan eldeki forseps kullanarak sklerayı kavrayın ve baskın eldeki kapalı forseps kullanarak retinayı skleradan nazikçe uzaklaştırın.
    13. Retinayı skleradan ve kalan herhangi bir optik sinirden tamamen ayırmak için optik sinir kafasını makasla kesin.
    14. Retinayı, tüp başına 200 μL nörobazal-A ortamı (glikozsuz) -1 retina içeren 1.1.4. adımdan itibaren glikoz açlığı için önceden hazırlanmış 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne kesilmiş bir transfer pipeti kullanarak aktarın.
  2. Glikoz açlık basamağı
    1. Tüpleri adım 2.1.14'ten itibaren 37 °C'lik bir su banyosuna aktarın ve 37 °C'de 20 dakika inkübe edin.
  3. NBDG inkübasyonu
    1. Her retinayı, adım 1.2.2'den itibaren nörobazal-A ortamında 200 μL 500 μM 6-NBDG içeren adım 1.1.4'ten 6-NBDG inkübasyonu için önceden etiketlenmiş yeni bir tüpe aktarın.
      NOT: Retina, retinayı en az hasarla transfer etmek için ucu büyütmek için kesilmiş bir transfer pipeti kullanılarak aktarılmalıdır. Ek olarak, kişinin retinayı zarar görmeden aktarma yeteneğine güveniyorsa, bu cımbızla yapılabilir.
    2. Tüpleri 37 ° C su banyosuna aktarın ve 37 ° C'de 60 dakika inkübe edin.
  4. 6-NBDG standartlarının hazırlanması (konsantrasyon aralığı 0 μM-40 μM)
    NOT: Standartları 60 dakikalık 6-NBDG inkübasyon süresi boyunca hazırlayın (adım 2.3.2.). Standartlar oda sıcaklığında hazırlanabilir. Çözümleri ışıktan koruyun.
    1. 8 standart için 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerini #1-8 olarak etiketleyin (bkz. Şekil 3).
    2. Standart #1 (40 μM 6-NBDG) için, adım 1.2.1'de yapılan 32 μL 500 μM 6-NBDG stok solüsyonunu pipetleyin.
    3. Mikrosantrifüj tüpüne 368 μL nörobazal-A ortamı ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.
    4. #2-8 standartları için, numuneleri aşağıdaki gibi seri olarak seyreltin:
      1. 200 μL nörobazal-A ortamını #2-8 tüplerine pipetleyin.
      2. Standart tüp #1'den 200 μL alın ve tüp #2'ye pipetleyin, ardından yukarı ve aşağı pipetleyerek pipetle iyice karıştırın.
      3. Standart tüp #2'den 200 μL alın ve standart tüp #3'e pipetleyin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek pipetle iyice karıştırın.
      4. Standart tüp #3'ten 200 μL alın ve tüp #4'e pipetleyin, ardından yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.
      5. Standart tüp #4'ten 200 μL alın ve tüp #5'e pipetleyin, ardından yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.
      6. Standart tüp #5'ten 200 μL alın ve tüp #6'ya pipetleyin, ardından yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.
      7. Standart tüp #6'dan 200 μL alın ve tüp #7'ye pipetleyin, ardından yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.
      8. Tüp #8'e ek bir çözelti eklemeyin (yani, adım 2.4.4.1.'de eklenen sadece 200 μL nörobazal-A ortamı içermelidir).
  5. Numune toplama için yıkama, sonikasyon ve santrifüjleme
    1. 60 dakikalık 6-NBDG inkübasyonu tamamlandıktan sonra tüm tüpleri 37 °C su banyosundan çıkarın.
    2. Her retinayı 500 μL buz gibi soğuk nörobazal-A ortamı ile mümkün olduğunca hızlı ve dikkatli bir şekilde yıkayın.
      1. Yıkamak için, retina dokusuna dokunmamaya veya rahatsız etmemeye dikkat ederek 6-NBDG solüsyonunu bir pipetle çıkarın.
        NOT: Retinayı cımbızla 6-NBDG inkübasyon tüpünden 500 uL nörobazal-A ortamına sahip yeni bir tüpe aktarma seçeneği de vardır. Ardından, sadece 3 ek yıkama yapmanız gerekir. Cımbızla retinaya zarar vermeme yeteneğiniz konusunda rahatsanız bunu yapın.
      2. Ardından, çözeltiyi uygun bir atık kabına atın. Çıkarılan çözeltiyi değiştirmek için hemen 500 μL soğuk nörobazal-A ortamını aynı tüpe pipetleyin. Yıkamalar arasında tüpleri buz üzerinde değiştirin.
    3. Toplam 4 yıkama için 3 kez daha tekrarlayın.
    4. Kesilmiş kenarlı veya cımbızlı bir transfer pipeti kullanarak, retinayı buz üzerinde nörobazal A ortamı içeren sonikasyon tüplerine dikkatlice aktarın (bkz. adım 1.1.4).
    5. Küçük diseksiyon makası kullanarak retinayı küçük parçalar halinde doğrayın.
      NOT: Diğer numuneleri çapraz kontamine etmemek için her bir retinayı doğramak arasında aletleri etanolde yıkadığınızdan emin olun.
    6. Her retinayı 10 genlikte 5-10 saniye boyunca sonikasyon yapın ve hemen tekrar buzun üzerine yerleştirin.
      NOT: Numuneler arasındaki sonikasyon probunu% 100 etanol ve ardından ultra saf H2O ile temizlediğinizden emin olun. Bu noktada, santrifüjü 4 °C'ye önceden soğutun veya varsa 4 °C'lik bir soğuk odada kullanın.
    7. 4 °C'de 15 dakika boyunca 21130 x g veya21130 x g'den düşükse maksimum hızda santrifüjleyin.
      NOT: Adım 2.5.7'deki 15 dakikalık santrifüj sırasında, adım 2.4'te yapılan #1-8 standartlarının 100 μL'sini siyah, şeffaf tabanlı 96 oyuklu bir plakaya pipetleyin.
  6. Plaka okuyucuda numune okuma
    1. 15 dakikalık santrifüj bittikten sonra, 100 μL süpernatan çıkarın ve pipeti 96 oyuklu plakaya pipetleyin.
    2. Plakayı plaka okuyucuya yerleştirin.
      NOT: Plakada her numuneden 100 μL ve her standarttan 100 μL bulunmalıdır.
    3. Plaka okuyucu yazılımında, adım 1.1.7'de seçilen parametrelerle floresan son nokta testini seçin.
    4. Testi çalıştırın ve sonuçları kaydedin.
    5. Pierce testi için 96 oyuklu plakadan numuneleri 1.1.4'ten önceden etiketlenmiş tüplere pipetleyin.
      NOT: Bu noktada, numuneler hemen protein için test edilebilir (aşağıya bakınız) veya -80 °C'de saklanabilir.
  7. Protein normalizasyonu için Pierce testi
    NOT: Pierce testi, daha fazla doğruluk için iki kopya halinde (hem standartlar hem de numuneler) çalıştırılmalıdır.
    1. Pierce testi önceden seyreltilmiş protein testi standartlarını kullanarak, her birinden 10 μL'yi iki kez 96 oyuklu şeffaf bir alt plakaya pipetleyin.
    2. Numunelerin her birinden 10 μL'yi 2.6.5 adımından 96 oyuklu plakaya iki kopya halinde pipetleyin.
    3. Standartlar veya numuneler içeren tüm kuyucuklara 150 μL Pierce reaktifi ekleyin. 96 oyuklu plakayı kapatın ve 1 dakika boyunca orta hızda bir plaka çalkalayıcı üzerinde karıştırın.
    4. Plakayı oda sıcaklığında (RT) 5 dakika inkübe edin.
    5. Plakayı plaka okuyucuya yerleştirin. Absorbans uç noktası testini seçin ve dalga boyunu 660 nm'ye ayarlayın.
    6. Standartların ve numunelerin absorbansını ölçün ve sonuçları kaydedin. Standart bir eğri çizerek her numunedeki toplam mikrogram proteini hesaplayın.
  8. Retinal 6-NBDG alımının hesaplanması.
    NOT: 6-NBDG sonuçlarının, retinanın eşit olmayan boyutları nedeniyle toplam protein içeriğine normalleştirilmesi gerekir.
    1. Adım 2.6'da elde edilen floresan yoğunluğu değerlerini kullanarak, 6-NBDG floresan standart eğrisini çizmek ve her numunede 6-NBDG konsantrasyonunu (μM) ölçmek için önceden belirlenmiş standartlardan floresan okumalarını kullanın.
    2. [6-NBDG] μM/μg proteinini belirlemek için numune sonuçlarını karşılık gelen protein miktarlarına normalleştirin.

Sonuçlar

Şekil 4, farklı süreler boyunca 6-NBDG ile inkübe edilmiş WT fare retinasından temsili glikoz floresan ölçümlerini göstermektedir. 30 dakikalık inkübasyondan sonra, 6-NBDG seviyeleri ortalama 336 ± 27.91 AU iken, 60 dakika sonra 6-NBDG seviyeleri ortalama 616.3 ± 8.38 AU'ya yükseldi. 30 dakikalık başka bir inkübasyon, 6-NBDG (506.4 ± 5.3 AU) seviyesinin düşmesine neden oldu. 60 dakikada, sonuçlardaki değişkenlik minimumdu ve bu nedenl...

Tartışmalar

Özetle, açıklanan yöntem, temel bilim araştırmacılarının floresan glikoz analoğu olan 6-NBDG'nin in ex vivo murin nöral retina alımını ölçmelerini sağlar. Glikoz, nöral retina için önemli bir metabolittir, alımı, adenozin trifosfat (ATP) şeklinde enerji üretmek için gereken yüksek glikoliz ve mitokondriyal solunum oranlarını destekler1. Glikoz tercih edilen enerji substratı olduğundan, birçok retina hücresi, vaskülatürden...

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Lauren K. Wareham'a verilen sınırsız departman fonları ile finanse edildi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
# 5 forcepsKatenaK5-6550Used for retina dissection
1.5 mL microcentrifuge tubesThermo Fisher Scientific05-408-129
26 G x 5/8" needlesol-M112658Used to puncture cornea during dissection
5 mL tubesMTC bioc2540
50 mL tubesAvantor by VWR89039-656
6-NBDGInvitrogenN23106Fluorescent gucose analog
96 well plates black with clear bottomThermo Fisher Scientific265301
Anesthetic Charcoal Filter CannisterReFreshEZ-258Used in anesthesia set up
BAY-876Millipore SigmaSML1774For inhibition of GLUT1.
Centrifuge at 4 °CEppendorfEPP-5424
Compressed gas (5% carbon dioxide, 95% oxygen)AirgasUN3156Used in anesthesia set up
curved forcepsRoboz surgical instrumentRS-5137Used for retina dissection
DDH2OElga LabWaterElga PureLab UltraUsed after ethanol to clean sonicator in between samples
Dissecting microscopeOlympusszX12Used for retina dissection
Ethanol 200 proofDecon laboratories2701To be used to clean sonicator in between samples
Foam floating tube rackThermo Fisher Scientific36-099-2328For tubes during incubation in water bath steps
General scissorsRoboz surgical instrumentRS-680Used for retina dissection
Isoflurane 250 mL bottlePiramal critical careNDC  6679401725Anesthesia
Isoflurane equipmentVetequip sold by VWR89012-492Used to anesthetize prior to euthanasia
Kim wipesVWR82003-820
Microplate readerMolecular devicesSpectraMax M2 microplate readerUsed to read sample
Neurobasal- A mediaGibco12349-015
Nose cone (low profile anesthesia mask)Kent ScientificSOMNO-0801Used to deliver ansethesia
Objective on dissecting microscopeOlympusDF plapo 1x pfUsed for retina dissection
Petri dishVWR25384-088Used during retina dissection
Pierce assay reagentThermo Fisher Scientific1861426
Pipette tips P20Olympus Plastics26-404
Pipette tips P200, P1000, P10 XLVWR76322-150, 76322-154, 76322-132
Pipetteman pipettes P200, P1000, P20, P10VWRF144055M, F144056M, F144058M, F144059M
SoftMax Pro software on computerMolecular devicesSoftMax Pro 7 softwareSoftware used to read sample
Sonic dismembratorThermo Fisher ScientificFB50110Sonicate sample (retina)
Transfer pipettesFisherbrand13-711-9AMUsed to transfer retina from one tube to another
Vannas spring scissorsKatenaK4-5000Used for retina dissection
Water bath set to 37 °CN/AN/AUsed for incubation

Referanslar

  1. Casson, R. J., Chidlow, G., Crowston, J. G., Williams, P. A., Wood, J. P. M. Retinal energy metabolism in health and glaucoma. Prog Retin Eye Res. 81, 100881 (2021).
  2. Daniele, L. L., et al. Glucose uptake by GLUT1 in photoreceptors is essential for outer segment renewal and rod photoreceptor survival. FASEB J. 36 (8), e22428 (2022).
  3. Fernandes, R., Hosoya, K. -. I., Pereira, P. Reactive oxygen species downregulate glucose transport system in retinal endothelial cells. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (4), C927-C936 (2011).
  4. Badr, G. A., Tang, J., Ismail-Beigi, F., Kern, T. S. Diabetes downregulates GLUT1 expression in the retina and its microvessels but not in the cerebral cortex or its microvessels. Diabetes. 49 (6), 1016-1021 (2000).
  5. Kumagai, A. K. Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes. Diabetes Metab Res Rev. 15 (4), 261-273 (1999).
  6. Winkler, E. A., et al. GLUT1 reductions exacerbate Alzheimer's disease vasculo-neuronal dysfunction and degeneration. Nat Neurosci. 18 (4), 521-530 (2015).
  7. Mosconi, L., et al. Hypometabolism exceeds atrophy in presymptomatic early-onset familial Alzheimer's disease. J Nucl Med. 47 (11), 1778-1786 (2006).
  8. Moreno, M., et al. Morphological and morphometric changes in rat optic nerve microvessels in a glaucoma experimental model. Arch Soc Esp Oftalmol. 89 (12), 471-476 (2014).
  9. Barros, L. F., et al. Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes. J Neurochem. 109 (s1), 94-100 (2009).
  10. Hamilton, K. E., Bouwer, M. F., Louters, L. L., Looyenga, B. D. Cellular binding and uptake of fluorescent glucose analogs 2-NBDG and 6-NBDG occurs independent of membrane glucose transporters. Biochimie. 190, 1-11 (2021).
  11. Feigenspan, A., Babai, N. Z. Preparation of horizontal slices of adult mouse retina for electrophysiological studies. J Vis Exp. 119, e55173 (2017).
  12. Lundgaard, I., et al. Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism. Nat Commun. 6 (1), 6807 (2015).
  13. Zou, C., Wang, Y., Shen, Z. 2-NBDG as a fluorescent indicator for direct glucose uptake measurement. J Biochem Biophys Methods. 64 (3), 207-215 (2005).
  14. Wareham, L. K., et al. Solving neurodegeneration: common mechanisms and strategies for new treatments. Mol Neurodegener. 17 (1), 23 (2022).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Glukoz Analogu6 NBDGGlukoz Ta y c larGLUT1Retina H creleriGlukoz Al mEx Vivo DurumlarMurin RetinaFloresan l mTotal Protein NormalizasyonuN ral Doku MetabolizmasGLUT1 nhibit rBAY 876Tahlil Y ntemi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır