Misurazione dell'assorbimento dell'analogo del glucosio, 6-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)ammino)-6-desossiglucosio, nella retina neurale murina intatta

Riepilogo

Diversi tipi di cellule nella retina, tra cui cellule endoteliali, neuroni e cellule gliali, esprimono trasportatori di glucosio (GLUT) per consentire l'assorbimento del glucosio nelle cellule. Utilizzando la retina neurale di topo ex vivo e l'analogo fluorescente del glucosio 6-NBDG, descriviamo un metodo relativamente rapido ed economico per misurare l'assorbimento del glucosio nell'intera retina di topo.

Abstract

La retina è un tessuto altamente metabolico con più tipi di cellule che richiedono glucosio e suoi derivati per produrre energia sotto forma di ATP. Le cellule retiniche, comprese le cellule endoteliali, i neuroni, i fotorecettori e le cellule gliali, esprimono trasportatori di glucosio (GLUT; ad esempio, GLUT1-4) per consentire l'assorbimento del glucosio per la produzione di energia. GLUT1 è il trasportatore di glucosio più abbondantemente espresso nella retina. Questo protocollo consente ai ricercatori di misurare l'assorbimento di glucosio nella retina neurale murina in condizioni ex vivo utilizzando l'analogo fluorescente del glucosio 6-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)ammino)-6-Deossiglucosio (6-NBDG). Dopo la dissezione retinica, i livelli totali di 6-NBDG retinico possono essere facilmente determinati tramite la misurazione del punto finale di fluorescenza utilizzando un lettore di piastre. Per coerenza, si consiglia di normalizzare i risultati ai livelli proteici totali. Sebbene il 6-NBDG sia altamente specifico per GLUT1, l'assorbimento di questo analogo è rilevato in presenza dell'inibitore di GLUT1 BAY-876. Pertanto, questo test fornisce un metodo relativamente rapido ed economico per misurare l'assorbimento del glucosio ex vivo nell'intera retina neurale del topo, che è parzialmente mediato da GLUT1.

Introduzione

Il glucosio è un metabolita essenziale per la retina neurale, dove viene utilizzato per alimentare alti tassi di glicolisi e respirazione mitocondriale per produrre energia sotto forma di adenosina trifosfato (ATP)¹. Poiché il glucosio è il substrato energetico preferito, molte cellule retiniche esprimono trasportatori di glucosio (GLUT) per facilitare l'assorbimento del glucosio dal sistema vascolare e dal tessuto circostante². I GLUT comprendono una famiglia di glicoproteine intrinseche di membrana che sono responsabili del trasporto del glucosio nelle cellule di mammifero³. Il trasportatore GLUT-1 (GLUT1) è il principale trasportatore di glucosio nella retina, espresso in tutti gli strati retinici⁴ e dalle cellule endoteliali capillari che compongono la barriera emato-retinica (BRB)⁵. È interessante notare che nelle malattie neurodegenerative del sistema nervoso centrale (SNC), incluso il morbo di Alzheimer, una riduzione dei livelli di proteina GLUT1 e dell'assorbimento del glucosio precede l'atrofia cerebrale e la disfunzione neuronale nell'uomo ^6,7. In un modello di ratto di ipertensione oculare, livelli più bassi di GLUT1 sono stati osservati anche nei capillari⁸. Il ridotto trasporto di glucosio nella retina esterna è implicato nella perdita di fotorecettori in modelli animali di retinite pigmentosa umana e può anche svolgere un ruolo nella neurodegenerazione retinica, come quella osservata nel glaucoma. Pertanto, è necessaria una comprensione del trasporto del glucosio nella retina neurale per stabilire il suo ruolo nella neurodegenerazione retinica.

Qui, descriviamo un metodo biochimico nuovo, economico e semplice per misurare l'assorbimento di 6-NBDG nella retina neurale murina ex vivo , cioè escludendo l'epitelio pigmentato retinico e la coroide. Rispetto ad altri analoghi fluorescenti come il 2-NBDG, il 6-NBDG è composto da una porzione di glucosio su cui un gruppo nitrobenzossidiazoamminico fluorescente sostituisce il gruppo ossidrile al carbonio 6, prevenendo la fosforilazione da parte dell'esochinasi e un'ulteriore degradazione metabolica⁹. Sebbene il 6-NBDG abbia un'elevata specificità per GLUT1, con un'affinità di legame 300 volte superiore a quella del glucosio⁹, rileviamo l'assorbimento di questo analogo in presenza di inibitori di GLUT1¹⁰. Pertanto, questo test fornisce un metodo relativamente rapido ed economico per misurare l'assorbimento del glucosio ex vivo nell'intera retina del topo, che è parzialmente mediato da GLUT1.

La misurazione dell'assorbimento di glucosio nei tessuti in tempo reale è impegnativa e spesso richiede la marcatura di radioisotopi o metodi di imaging ad alta risoluzione. Qui, impieghiamo un saggio biochimico fluorescente per determinare rapidamente l'assorbimento di 6-NBDG su più campioni retinici in condizioni ex vivo . Il protocollo fornisce informazioni sull'assorbimento totale del glucosio retinico; non fornisce informazioni sui livelli specifici delle cellule retiniche di captazione del 6-NBDG.

Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Vanderbilt University Medical Center.

1. Preparazione per il saggio

NOTA: La preparazione deve essere eseguita il giorno del test immediatamente prima di eseguire il test. Ciò è necessario a causa della natura sensibile al fattore tempo del protocollo.

1. Preparazione generale prima dell'esperimento
   NOTA: Il 6-NBDG è sensibile alla luce e deve essere protetto dalla luce. Coprire tutte le soluzioni 6-NBDG con un foglio di alluminio.
   1. Una soluzione madre di 5 mM di 6-NBDG in DMSO al 50%/1x PBS è stabile a -20 °C per 6 mesi. Preparare una soluzione madre e conservare aliquote da 500 μl per saggi futuri.
   2. Mettere una provetta conica da 50 ml di terreno Neurobasal-A (senza glucosio) sul ghiaccio.
   3. Assicurarsi che il bagnomaria sia impostato a 37 °C.
   4. Etichettare 4 provette per microcentrifuga da × 1,5 mL per retina: 1) carenza di glucosio, 2) incubazione con 6-NBDG, 3) sonicazione e 4) provetta di raccolta per il campione per il test Pierce (ad esempio, se si hanno quattro retina in totale, saranno necessarie 16 provette per microcentrifuga). Vedere la Figura 1 per un riepilogo della configurazione del tubo.
   5. Aggiungere 200 μl di terreno neurobasale A dalla provetta conica da 50 mL su ghiaccio alle provette di sonicazione pre-marcate e mettere su ghiaccio per il passaggio 2.5.4.
   6. Accendere il lettore di piastre.
   7. Impostazione delle informazioni sulla piastra nel software del lettore di piastre utilizzando la funzione del saggio del punto finale di fluorescenza con i seguenti parametri: eccitazione 483 nm, emissione 550 nm e cut-off 530 nm (parametri predeterminati per 6-NBDG).
2. Preparazione del reagente prima dell'esperimento: 6-NBDG
   1. Realizzare una soluzione di lavoro di 6-NBDG in mezzi neurobasali-A a una concentrazione finale di 500 μM diluendo il materiale da 5 mM prodotto al punto 1.1.1.
      NOTA: Ricordarsi di coprire tutte le soluzioni 6-NBDG con un foglio di alluminio. Produrre un volume appropriato di 500 μM di soluzione di lavoro 6-NBDG per l'intero saggio (sono necessari 200 μL di soluzione di 6-NBDG di lavoro per retina; includere il volume extra per l'errore e le quantità necessarie per la creazione di soluzioni standard nella fase 2.4.).
   2. Pipettare 200 μl di soluzione di lavoro 6-NBDG nelle provette pre-marcate realizzate al punto 1.1.4 per la fase di incubazione 6-NBDG.

2. Esecuzione del saggio di captazione del 6-NBDG

NOTA: Vedere la Figura 2 per una panoramica dettagliata.

1. Dissezione del tessuto retinico
   1. Sedare il topo utilizzando l'anestesia con isoflurano per via inalatoria (isoflurano al 2% in anidride carbonica al 5% / ossigeno al 95%).
      NOTA: Verificare che il mouse sia adeguatamente anestetizzato pizzicando il poggiapiedi su entrambe le zampe posteriori. Se adeguatamente anestetizzato, non dovrebbero esserci movimenti a scatti (riflesso di ritiro del pedale). Se c'è un movimento riflesso, torna al passaggio 2.1.1.
   2. Eutanasia del topo mediante lussazione cervicale seguita da decapitazione e quindi enucleare rapidamente gli occhi. Posizionare gli occhi enucleati in una capsula di Petri riempita con 5-10 ml di terreno neurobasale-A ghiacciato (senza glucosio) su ghiaccio.
      NOTA: Di seguito sono riportate le linee guida di base per la dissezione neurale della retina (esclusi l'epitelio pigmentato retinico e la coroide); Per istruzioni e indicazioni più approfondite, fare riferimento a un protocollo¹¹ pubblicato in precedenza e seguire la sezione "Dissezione retinica del topo".
   3. Posizionare la capsula di Petri sotto un microscopio da dissezione sul ghiaccio.
   4. Piegare una salvietta priva di lanugine in un quadratino e inumidirlo con Neurobasal A media.
   5. Trasferire un occhiello sulla salvietta umida e priva di lanugine utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica con l'estremità tagliata.
      NOTA: La salvietta priva di lanugine fornisce un maggiore attrito per evitare che l'occhio si muova durante la dissezione.
   6. Prendi un ago da 26 G e perfora il lato della cornea anteriore al limbus.
   7. Usa le forbici Vannas per tagliare lungo il limbus dal punto di puntura per rimuovere la cornea.
   8. Una volta rimossa la cornea, afferrare la sclera a metà strada tra il limbus e la testa del nervo ottico con un paio di pinze. Usando un altro paio di pinze nella mano opposta, afferra la lente e rimuovila rapidamente con un movimento rapido.
      NOTA: Se la lente viene rimossa lentamente, la retina rimarrà attaccata alla lente e diventerà difficile da sezionare.
   9. Trasferire la conchiglia oculare in una capsula di Petri con Neurobasal A freddo su ghiaccio.
   10. Usando il forcipe in entrambe le mani, prendi la conchiglia oculare e tienila con cura all'ora serrata.
       1. Per rilasciare la coppetta retinica dalla sclera, bloccare la sclera con una pinza, facendo attenzione a non bloccare il tessuto retinico.
       2. Far scorrere con cautela la pinza tra il tessuto sclerale e il tessuto retinico in tutto il globo fino a quando l'intera retina non viene rilasciata dal limbus.
   11. Usando le forbici di Vannas, praticare una piccola incisione nella sclera al limbus.
   12. Prendi una pinza per afferrare i bordi dell'incisione e staccare il tessuto sclerale fino alla regione della testa del nervo ottico. Afferrare la sclera usando il forcipe nella mano non dominante e guidare delicatamente la retina lontano dalla sclera usando il forcipe chiuso nella mano dominante.
   13. Taglia la testa del nervo ottico con le forbici per staccare completamente la retina dalla sclera e dall'eventuale nervo ottico rimasto.
   14. Trasferire la retina utilizzando una pipetta di trasferimento tagliata nella provetta da microcentrifuga da 1,5 ml pre-preparata per la carenza di glucosio dal passaggio 1.1.4, che contiene 200 μl di terreno neurobasale-A (senza glucosio)-1 retina per provetta.
2. Fase di carenza di glucosio
   1. Trasferire le provette del passaggio 2.1.14 in un bagnomaria a 37 °C e incubare a 37 °C per 20 minuti.
3. Incubazione di NBDG
   1. Trasferire ciascuna retina in una nuova provetta pre-marcata per l'incubazione del 6-NBDG dal passaggio 1.1.4, che contiene 200 μL di 500 μM di 6-NBDG in terreno neurobasale-A dal passaggio 1.2.2.
      NOTA: La retina deve essere trasferita utilizzando una pipetta di trasferimento che è stata tagliata per allargare la punta in modo da trasferire la retina con il minimo danno. Inoltre, questo può essere fatto con una pinzetta se si è sicuri della propria capacità di trasferire la retina senza danni.
   2. Trasferire le provette a bagnomaria a 37 °C e incubare a 37 °C per 60 min.
4. Preparazione di standard 6-NBDG (intervallo di concentrazione 0 μM-40 μM)
   NOTA: Preparare gli standard durante il periodo di incubazione di 60 minuti a 6 NBDG (passaggio 2.3.2.). Gli standard possono essere preparati a temperatura ambiente. Proteggere le soluzioni dalla luce.
   1. Etichettare le provette per microcentrifuga da 1,5 ml #1-8 per gli 8 standard (vedere la Figura 3).
   2. Per lo standard #1 (40 μM 6-NBDG), pipettare 32 μL di soluzione madre 500 μM 6-NBDG realizzata al punto 1.2.1.
   3. Aggiungere 368 μl di terreno neurobasal-A nella provetta per microcentrifuga e mescolare accuratamente pipettando su e giù.
   4. Per gli standard #2-8, diluire in serie i campioni come segue:
      1. Pipettare 200 μL di terreno neurobasal-A nelle provette #2-8.
      2. Prelevare 200 μl dalla provetta standard #1 e pipettarla nella provetta #2, quindi miscelare accuratamente con la pipetta pipettando su e giù.
      3. Prelevare 200 μl dalla provetta standard #2 e pipettare nella provetta standard #3. Miscelare accuratamente con la pipetta pipettando su e giù.
      4. Prelevare 200 μl dalla provetta standard #3 e pipettarla nella provetta #4, quindi miscelare accuratamente pipettandola su e giù.
      5. Prelevare 200 μl dalla provetta standard #4 e pipettarla nella provetta #5, quindi miscelare accuratamente pipettandola su e giù.
      6. Prelevare 200 μl dalla provetta standard #5 e pipettarli nella provetta #6, quindi mescolarli accuratamente pipettandoli su e giù.
      7. Prelevare 200 μl dalla provetta standard #6 e pipettarla nella provetta #7, quindi mescolarla accuratamente pipettandola su e giù.
      8. Non aggiungere alcuna soluzione aggiuntiva alla provetta #8 (cioè, dovrebbe contenere solo 200 μL di terreno neurobasale-A aggiunto nel passaggio 2.4.4.1.).
5. Lavaggio, sonicazione e centrifugazione per la raccolta dei campioni
   1. Al termine dell'incubazione di 60 minuti con 60 minuti di incubazione al 6-NBDG, rimuovere tutte le provette dal bagnomaria a 37 °C.
   2. Lavare ogni retina con 500 μL di terreno neurobasale-A ghiacciato il più rapidamente e accuratamente possibile.
      1. Per il lavaggio, rimuovere la soluzione di 6-NBDG con una pipetta, facendo attenzione a non toccare o disturbare il tessuto retinico.
         NOTA: C'è anche la possibilità di trasferire la retina con una pinzetta dal tubo di incubazione 6-NBDG a un tubo nuovo che contiene 500 uL di terreno neurobasale-A. Quindi, devi solo fare 3 lavaggi aggiuntivi. Fallo se ti senti a tuo agio con la tua capacità di non danneggiare la retina con le pinzette.
      2. Quindi, gettare la soluzione in un apposito contenitore per rifiuti. Pipettare immediatamente 500 μl di mezzo freddo neurobasal-A nella stessa provetta per sostituire la soluzione che è stata rimossa. Sostituire i tubi con ghiaccio tra un lavaggio e l'altro.
   3. Ripetere altre 3 volte per un totale di 4 lavaggi.
   4. Utilizzando una pipetta di trasferimento con bordo tagliato o una pinzetta, trasferire con cautela la retina nelle provette di sonicazione contenenti il terreno neurobasale A su ghiaccio (vedere il passaggio 1.1.4).
   5. Taglia la retina in piccoli pezzi usando piccole forbici da dissezione.
      NOTA: Assicurarsi di lavare gli strumenti in etanolo tra un taglio e l'altro di ciascuna retina in modo da non contaminare in modo incrociato altri campioni.
   6. Sonicare ogni retina per 5-10 s su un'ampiezza di 10 e riposizionarla immediatamente sul ghiaccio.
      NOTA: Assicurarsi di pulire la sonda di sonicazione tra i campioni con etanolo al 100% seguito da H₂O ultrapuro. A questo punto, preraffreddare la centrifuga a 4 °C o utilizzare la centrifuga in una cella frigorifera walk-in a 4 °C, se disponibile.
   7. Centrifugare a 4 °C per 15 minuti a 21130 x g ovelocità massima se inferiore a 21130 x g.
      NOTA: Durante la centrifuga di 15 minuti al punto 2.5.7, pipettare 100 μL degli standard #1-8 realizzati al passaggio 2.4 in una piastra nera a 96 pozzetti con fondo trasparente.
6. Lettura di campioni su un lettore di lastre
   1. Al termine della centrifuga di 15 minuti, rimuovere 100 μl di surnatante e pipettare nella piastra a 96 pozzetti.
   2. Inserire la piastra nel lettore di piastre.
      NOTA: La piastra deve contenere 100 μl di ciascun campione e 100 μl di ogni standard.
   3. Nel software del lettore di piastre, selezionare il saggio del punto finale di fluorescenza con i parametri selezionati al passaggio 1.1.7.
   4. Esegui il test e salva i risultati.
   5. Pipettare i campioni dalla piastra a 96 pozzetti nelle provette pre-marcate da 1.1.4 per il test Pierce.
      NOTA: A questo punto, i campioni possono essere immediatamente analizzati per le proteine (vedi sotto) o conservati a -80 °C.
7. Saggio di Pierce per la normalizzazione delle proteine
   NOTA: Il test Pierce deve essere eseguito in duplicato (sia standard che campioni) per una maggiore precisione.
   1. Utilizzando gli standard del saggio delle proteine pre-diluite del saggio Pierce, pipettare 10 μl di ciascuno in duplicato in una piastra di fondo trasparente a 96 pozzetti.
   2. Pipettare 10 μl di ciascuno dei campioni in duplicato dal passaggio 2.6.5 nella piastra a 96 pozzetti.
   3. Aggiungere 150 μl di reagente Pierce a tutti i pozzetti contenenti standard o campioni. Coprire la piastra a 96 pozzetti e mescolare su uno shaker a media velocità per 1 minuto.
   4. Incubare la piastra a temperatura ambiente (RT) per 5 minuti.
   5. Inserire la piastra nel lettore di piastre. Selezionare il saggio dell'endpoint di assorbanza e impostare la lunghezza d'onda su 660 nm.
   6. Misura l'assorbanza di standard e campioni e salva i risultati. Calcola il microgrammo totale di proteine in ciascun campione tracciando una curva standard.
8. Calcolo dell'assorbimento retinico di 6-NBDG.
   NOTA: I risultati del 6-NBDG devono essere normalizzati al contenuto proteico totale a causa delle dimensioni irregolari della retina.
   1. Utilizzando i valori di intensità della fluorescenza ottenuti nel passaggio 2.6, utilizzare le letture della fluorescenza degli standard predeterminati per tracciare una curva standard di fluorescenza a 6 NBDG e quantificare la concentrazione di 6 NBDG (μM) in ciascun campione.
   2. Normalizzare i risultati del campione in base alle quantità proteiche corrispondenti per determinare la proteina [6-NBDG] μM/μg.

Risultati

La Figura 4 mostra le misurazioni rappresentative della fluorescenza del glucosio da retina di topo WT incubata con 6-NBDG per diversi periodi di tempo. Dopo 30 minuti di incubazione, i livelli di 6-NBDG erano in media di 336 ± 27,91 UA, mentre dopo 60 minuti, i livelli di 6-NBDG sono aumentati a una media di 616,3 ± 8,38 UA. Un'ulteriore incubazione di 30 minuti ha portato a una riduzione del livello di 6-NBDG (506,4 ± 5,3 UA). A 60 minuti, la variabilit...

Discussione

In sintesi, il metodo descritto consente ai ricercatori delle scienze di base di misurare l'assorbimento dell'analogo fluorescente del glucosio, 6-NBDG, nella retina neurale murina ex vivo . Il glucosio è un metabolita essenziale per la retina neurale, il suo assorbimento supporta gli alti tassi di glicolisi e respirazione mitocondriale necessari per produrre energia sotto forma di adenosina trifosfato (ATP)¹. Poiché il glucosio è il substrato energeti...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
# 5 forceps	Katena	K5-6550	Used for retina dissection
1.5 mL microcentrifuge tubes	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
26 G x 5/8" needle	sol-M	112658	Used to puncture cornea during dissection
5 mL tubes	MTC bio	c2540
50 mL tubes	Avantor by VWR	89039-656
6-NBDG	Invitrogen	N23106	Fluorescent gucose analog
96 well plates black with clear bottom	Thermo Fisher Scientific	265301
Anesthetic Charcoal Filter Cannister	ReFresh	EZ-258	Used in anesthesia set up
BAY-876	Millipore Sigma	SML1774	For inhibition of GLUT1.
Centrifuge at 4 °C	Eppendorf	EPP-5424
Compressed gas (5% carbon dioxide, 95% oxygen)	Airgas	UN3156	Used in anesthesia set up
curved forceps	Roboz surgical instrument	RS-5137	Used for retina dissection
DDH2O	Elga LabWater	Elga PureLab Ultra	Used after ethanol to clean sonicator in between samples
Dissecting microscope	Olympus	szX12	Used for retina dissection
Ethanol 200 proof	Decon laboratories	2701	To be used to clean sonicator in between samples
Foam floating tube rack	Thermo Fisher Scientific	36-099-2328	For tubes during incubation in water bath steps
General scissors	Roboz surgical instrument	RS-680	Used for retina dissection
Isoflurane 250 mL bottle	Piramal critical care	NDC  6679401725	Anesthesia
Isoflurane equipment	Vetequip sold by VWR	89012-492	Used to anesthetize prior to euthanasia
Kim wipes	VWR	82003-820
Microplate reader	Molecular devices	SpectraMax M2 microplate reader	Used to read sample
Neurobasal- A media	Gibco	12349-015
Nose cone (low profile anesthesia mask)	Kent Scientific	SOMNO-0801	Used to deliver ansethesia
Objective on dissecting microscope	Olympus	DF plapo 1x pf	Used for retina dissection
Petri dish	VWR	25384-088	Used during retina dissection
Pierce assay reagent	Thermo Fisher Scientific	1861426
Pipette tips P20	Olympus Plastics	26-404
Pipette tips P200, P1000, P10 XL	VWR	76322-150, 76322-154, 76322-132
Pipetteman pipettes P200, P1000, P20, P10	VWR	F144055M, F144056M, F144058M, F144059M
SoftMax Pro software on computer	Molecular devices	SoftMax Pro 7 software	Software used to read sample
Sonic dismembrator	Thermo Fisher Scientific	FB50110	Sonicate sample (retina)
Transfer pipettes	Fisherbrand	13-711-9AM	Used to transfer retina from one tube to another
Vannas spring scissors	Katena	K4-5000	Used for retina dissection
Water bath set to 37 °C	N/A	N/A	Used for incubation