شاشة كريسبر على مستوى الجينوم للكشف عن الجينات الحساسة للإشعاع والمقاومة للإشعاع

Summary

يتم إعطاء نهج دقيق ومنظم لاختيار جينات الإشعاع المقاومة والحساسة من خلال تطبيق طريقة شاشة CRISPR / Cas9 على مستوى الجينوم. هذا البروتوكول لديه أيضا القدرة على العمل كإطار متعدد الاستخدامات للمساعي البحثية الأخرى التي تبحث في آليات مقاومة الأدوية الكيميائية التي يتم تناولها سريريا.

Abstract

تم تسخير نظام CRISPR-Cas9 وإعادة استخدامه في أداة قوية لتحرير الجينوم. من خلال الاستفادة من هذه التكنولوجيا ، يمكن للباحثين قص تسلسل الحمض النووي ولصقه وحتى إعادة كتابته بدقة داخل الخلايا الحية. ومع ذلك ، فإن تطبيق تقنية شاشة كريسبر يتجاوز مجرد التجريب. إنه بمثابة أداة محورية في مكافحة الأمراض الوراثية ، وتشريح المناظر الطبيعية الجينية المعقدة بشكل منهجي ، وتمكين الباحثين من كشف الآليات الجزيئية الكامنة وراء الظواهر البيولوجية ، وتمكين العلماء من تحديد واستهداف الأسباب الجذرية للأمراض مثل السرطان والتليف الكيسي وفقر الدم المنجلي. من بين كل شيء ، يشكل السرطان تحديا هائلا للطب ، مما يحفز جهود الاستئصال. العلاج الإشعاعي ، كعلاج تقليدي ، يحقق نتائج ولكن له قيود. يقضي على الخلايا السرطانية ولكنه يضر أيضا بالأنسجة السليمة ، مما يتسبب في آثار ضارة تقلل من جودة الحياة. بالإضافة إلى ذلك ، لا تستجيب جميع الخلايا السرطانية للعلاج الإشعاعي ، وقد يصاب بعضها بمقاومة ، مما يؤدي إلى تفاقم الحالة. لمعالجة هذا الأمر ، تم تقديم تقنية شاشة كريسبر الشاملة للجينوم الكامل ، لأنها تتيح التعرف الفعال على الجينات الحساسة للإشعاع والمقاومة للإشعاع ، وبالتالي تطوير مجال أبحاث السرطان وعلاجه. تم إجراء فحص كريسبر على مستوى الجينوم في خلايا سرطان الرئة المعرضة للإشعاع باتباع البروتوكول الموصوف ، والذي تم من خلاله تحديد الجينات المرتبطة بالمقاومة الإشعاعية والحساسية للإشعاع.

Introduction

يتشابك التحقيق في الظواهر البيولوجية بطبيعته مع دراسة السلوكيات الخلوية ، وبالتالي يرتبط فحص السلوكيات الخلوية بشكل أساسي باستكشاف جينومها. مع استمرار تطور التكنولوجيا الحديثة ، يعيد الباحثون الطبيون توجيه انتباههم تدريجيا نحو تغيير السلوكيات الخلوية عن طريق تحرير الجينات من أجل تعزيز نتائج علاج الأمراض المختلفة. في هذا الصدد ، ظهرت تقنية التكرارات المتجانسة القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPR) كأداة ثورية لتحرير الجينوم نظرا لتطبيقها البسيط^{نسبيا 1}. يتكون نظام CRISPR-Cas9 من نوكلياز Cas9 والحمض النووي الريبي أحادي التوجيه (sgRNA) ، والذي يتعرف على وجه التحديد على تسلسل الحمض النووي المستهدف ويرتبط به ، ويوجه نوكلياز Cas9 للقطع في هذا الموقع ، مما يؤدي إلى كسر مزدوج الخيط (DSB) في الحمض النووي للجينوم^2،3،4. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي إدخال مواد أخرى إلى عمليات إدخال أو حذف أو طفرات محددة في الجينوم ، مما يتيح تحرير الجينات المستهدف.

في أبحاث الجينوم الوظيفي ، كانت شاشة تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) في يوم من الأيام طريقة مستخدمة على نطاق واسع لإجراء تجارب فقدان الوظيفة على نطاق واسع للتحقيق في أدوار الجينات في السرطان. تدرس تقنية RNAi وظيفة الجينات عن طريق إسكات الجينات المستهدفة على وجه التحديد ، مما يساعد الباحثين على تحديد العوامل السرطانية الحرجة. ومع ذلك ، فهو محدود بالتأثيرات غير المستهدفة وكفاءة الضربة القاضية غير المكتملة للجينات. قد تؤدي التأثيرات غير المستهدفة إلى إسكات الجينات الأخرى غير المستهدفة ، مما يعرض دقة وموثوقية النتائج التجريبية^{للخطر 1،2}. بالإضافة إلى ذلك ، يظهر RNAi كفاءة ضربة قاضية منخفضة لجينات معينة ، مما قد يفشل في قمع التعبير الجيني المستهدف تماما. على عكس شاشات RNAi التقليدية ، تظهر شاشة CRISPR خصوصية وكفاءة^{أعلى 3}. لا تتيح هذه التقنية التحرير الدقيق لجينات معينة فحسب ، بل تسمح أيضا بالفحص على نطاق واسع على مستوى الجينوم ، مما يوفر دعما قويا لأبحاث وظائف الجينات. تستخدم تقنية شاشة كريسبر ، وهي أداة قوية لتحرير الجينات تعتمد على نظام CRISPR-Cas9 ، للفحص الفعال والكشف عن وظائف غير معروفة لجينات معينة في الخلايا^5،6،7،8. يقوم الباحثون بتصميم sgRNAs على دفعات لجينات أو مناطق جينية معينة ، وإعداد مكتبات sgRNA المقابلة بدقة ودقة ، مما يضمن سلامتها^{ووظائفها 9}. ثم يتم تغليف مكتبات sgRNA هذه في جزيئات فيروسات ، والتي تستخدم لإصابة الخلايا المضيفة بكفاءة. بعد العدوى الناجحة ، تتم زراعة الخلايا المصابة في ظل ظروف فحص محددة شخصيا. عند الفحص ، يتم استخراج الحمض النووي الجيني للخلايا التي تم فحصها ، مع الحفاظ على معايير عالية من النقاء والكمية. بعد ذلك ، تخضع المناطق المستهدفة ذات الاهتمام ب sgRNA لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وهي عملية تكرر بدقة الأجزاء المرغوبة من الأحماض النووية^3،9. أخيرا ، يتم إجراء تسلسل عالي الإنتاجية على شظايا الحمض النووي المضخمة ، مما يتيح تحليلا شاملا وفعالا للمناطق المستهدفة ، وبالتالي توفير رؤى قيمة حول وظيفة وسلوك الجينات قيد الدراسة⁴.

يشكل السرطان تهديدا هائلا لصحة الإنسان باعتباره مرضا معقدا. في جميع أنحاء العالم ، يبذل الباحثون والأطباء جهودا متضافرة لكشف الآليات الجزيئية للتسرطن وتطوير استراتيجيات علاجية جديدة. تم إنشاء تعاون دولي لتسريع ترجمة نتائج البحوث الأساسية إلى تطبيقات سريرية ، بهدف نهائي هو تحسين نتائج المرضى. اقترح ساسمال وآخرون استراتيجية تجميع متعامدة حيوية تعتمد على نظام مضيف ضيف اصطناعي للاستهداف الدقيق للخلايا السرطانية النقيلية ، مما ساعد بشكل كبير عشرات العلماء في تطوير التقنيات الطبية. يتمتع عملهم البحثي المتميز بابتكار عال ورؤى فريدة ، مما يقدمون مساهمات ذات مغزى للمجتمع العلمي¹⁰. يتميز السرطان بالحالة المضطربة لعدم الاستقرار الجيني ، الناشئة عن التنظيم غير المنتظم لاستجابات تلف الحمض النووي ^11-14. يشمل تلف الحمض النووي عيوب أحادية النيوكليوتيدات ، وفواصل أحادية الخيط ، و DSBs. يشارك إعادة التركيب المتماثل (HR) والانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) في إصلاح DSBs في مراحل مختلفة^15،16،17. على هذا الأساس ، برز العلاج الإشعاعي كخيار علاجي قابل للتطبيق ، والذي يستخدم أشعة عالية الطاقة (مثل الأشعة السينية والأشعة γ) لإشعاع أنسجة الورم ، مما يتسبب في تلف الحمض النووي في الخلايا السرطانية ، وبالتالي تعطيل نموها^{وتكاثرها 18}. ومع ذلك ، فإن العلاج الإشعاعي لا ينتج عنه دائما الآثار المرجوة في نسبة كبيرة من مرضى السرطان ، مما قد ينتج عن أضرار للأنسجة شبه سرطانية والقيود التي تفرضها الخصائص المتأصلة في الورم ، مثل انخفاض الحساسية للعلاج الإشعاعي^19،20،21.

من الناحية النظرية ، يمكن استخدام أي نوع من الخلايا لشاشة كريسبر. ومع ذلك ، فإن الحفاظ على تمثيل كاف في المجموعات السكانية المتحولة يتطلب عددا كبيرا من خلايا البداية. أنواع الخلايا ذات الوفرة المنخفضة ليست مناسبة بشكل خاص للشاشة على مستوى الجينوم. بالنسبة لاختيار المكتبة ، تحتوي معظم المكتبات على 3-6 gRNAs لكل جين مستهدف ، والحفاظ على توزيع كل gRNA داخل السكان أمر بالغ الأهمية¹⁸. قد يؤدي فقدان التمثيل بسبب تخصيب أو استنفاد gRNAs معينة إلى توزيع غير متساو للنتائج. لمعالجة هذه المشكلة ، قد يكون اختيار مكتبات كريسبر المتاحة تجاريا والتي تم اختبارها في السوق خيارا مفضلا²⁰. في المختبر قد لا تلتقط شاشة كريسبر التي تستخدم خطوط الخلايا السرطانية المتجانسة بشكل كامل عدم التجانس الجيني واللاجيني للأورام في الجسم الحي . بينما كشفت الشاشة في المختبر عن الجينات الرئيسية المشاركة في إصلاح تلف الحمض النووي والإشارات الأوتوكرينية الناجمة عن الإشعاع ، إلا أنها لم تكرر بشكل كامل البيئة المكروية للورم ، بما في ذلك المقاومة الإشعاعية الناجمة عن نقص الأكسجة (عبر ROS ، والتكيف الأيضي ، والالتهام الذاتي) ، وتأثيرات الباراكرين بوساطة المناعة ، وتعديل السيتوكين المعتمد على ECM. قبل استخدام شاشة كريسبر لاستكشاف الجينات المرتبطة بحساسية الإشعاع أو مقاومته ، يجب مراعاة هذه العوامل بعناية. في ضوء المشهد العلاجي الحالي ، من الضروري تحديد العوامل المرتبطة بالمقاومة الإشعاعية والحساسية الإشعاعية ودراستها بعمق لتعزيز فعالية العلاج الإشعاعي^{بشكل فعال 22}. نظرا للميزة الرئيسية لشاشة كريسبر في دراسة وظائف الجينات غير المعروفة ، يتم توفير تقنية شاشة كريسبر كاملة الجينوم المفصلة بشكل منهجي لتحديد الجينات الحساسة للإشعاع والمقاومة للإشعاع بكفاءة.

Protocol

الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. اختيار جرعة مناسبة من الإشعاع

1. تحضير وطلاء الخلايا الملتصقة
   1. اضبط كثافة الخلية على 5 × 10⁵ خلايا لكل مل باستخدام وسط زراعة الخلايا الكامل RPMI 1640 الذي يحتوي على 10٪ FBS للمرور ونمو الخلايا. توزيع الخلايا في أطباق استزراع 3.5 سم للإشعاع بجرعات مختلفة. أضف 2 مل (1 × 10⁶ خلايا) إلى كل طبق واحتضنه طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
2. تطبيق جرعات إشعاعية مختلفة
   1. قم بترقيم أطباق الثقافة مقاس 3.5 سم من 1 إلى 5. استخدم المجموعة #1 كمجموعة تحكم ، مع تعيين المجموعات الأربع المتبقية كمجموعات علاجية.
   2. أغلق حواف الألواح المكونة من 6 آبار بغشاء مانع للتسرب لمجموعات العلاج وقم بإعطاء جرعات إشعاعية من 2 و 4 و 6 و 8 Gy على التوالي. بعد العلاج ، أعد الأطباق إلى الحاضنة.
3. طلاء خطوط الخلايا بعد الإشعاع
   1. تحضير أطباق 6 بئر و 96 بئر. اغسل الخلايا في أطباق الاستزراع مقاس 3.5 سم مرة واحدة باستخدام PBS ، وهضم الخلايا التي تنمو لوغاريتميا بنسبة 0.25٪ تربسين ، واضبط كثافة الخلية على 1 × 10⁵ خلايا لكل مل مع وسط كامل RPMI 1640 يحتوي على 10٪ FBS.
   2. قم بزرع 10 ميكرولتر / بئر (1,000 خلية / 100 ميكرولتر) في الألواح المكونة من 6 آبار بمعدل 3 تكرارات لكل جرعة إشعاعية. أضف 2 مل من الوسط الكامل لكل بئر وعد بعد 14 يوما (عندما تحتوي كل مجموعة استنساخ على ما يقرب من 50 خلية).
   3. قم بزرع 30 ميكرولتر / بئر (3,000 خلية / 100 ميكرولتر) في ألواح 96 بئرا بمعدل 5 تكرارات لكل جرعة إشعاعية. أضف 70 ميكرولتر من الوسط الكامل إلى كل بئر وقم بقياس بقاء الخلية بعد 72 ساعة.
4. قياس صلاحية الخلية
   ملاحظة: معدل تثبيط الاستمغناء = 1 - (عدد المستنسخة في مجموعة العلاج / عدد المستنسخة في المجموعة الضابطة) × 100٪. يستخدم اختبار CCK-8 ملح التيترازوليوم القابل للذوبان في الماء (WST-8) الذي يمكن تقليله عن طريق نازعة الهيدروجين الخلوية لتوليد منتج فورمازان أصفر عالي الذوبان في الماء¹¹. تتناسب كمية الفورمازان المنتجة طرديا مع عدد الخلايا القابلة للحياة ، وكثافته البصرية (المقاسة بطول موجي 450 نانومتر) تعكس بدقة نشاط التمثيل الغذائي الخلوي وحالة التكاثر^11،13. بناء على هذا المبدأ الراسخ ، تم اعتماد اختبار CCK-8 على نطاق واسع لتطبيقات مختلفة ، بما في ذلك فحوصات تكاثر الخلايا واختبارات حساسية الأدوية للورم. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام اختبار CCK-8 لتقييم الجدوى الخلوية بشكل منهجي تحت جرعات إشعاع مختلفة.
   1. امزج كاشف CCK8 مع وسيط RPMI 1640 بدون FBS بنسبة 1: 9. تخلص من الوسط في الألواح المكونة من 96 بئرا وأضف 100 ميكرولتر من الوسط المحتوي على CCK8 إلى كل بئر.
   2. احتضن في الظلام لمدة 1 ساعة وقم بقياس قيمة OD عند 450 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة دقيقة.
      ملاحظة: معدل بقاء الخلية = [(قيمة OD لمجموعة المعالجة - قيمة OD للبئر الفارغ) / (قيمة OD لمجموعة التحكم - قيمة OD للبئر الفارغ)] × 100٪
5. اختيار جرعة الإشعاع
   1. دمج معدل تثبيط الاستمراض مع معدل بقاء الخلية من أجل تحديد جرعة إشعاعية مناسبة بناء على احتياجات البحث. حدد جرعة إشعاعية بمعدل تثبيط 50٪ لفحص كل من الجينات المقاومة للإشعاع والحساسة للإشعاع.

2. اختيار وزارة الداخلية المناسبة وتركيز بورومايسين

1. طلاء الخلايا الملتصقة
   1. اضبط كثافة الخلية على 3 × 10⁵ خلايا لكل مل وتلقيح 1 مل (3 × 10⁵ خلايا) لكل بئر في صفيحة 12 بئر. احتضان اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
2. عدوى العدسات
   1. استخدم ماصة لشفط الوسط من الصفيحة المكونة من 12 بئرا واستبدله ب 1 مل من الوسط الكامل RPMI 1640 الذي يحتوي على 10٪ FBS. قم بإعداد مكتبة CRISPR للفيروسات اللونسية كاملة الجينوم التي تم فحصها بالجودة (يوصى بالمكتبات المتاحة تجاريا) وقم بإعداد تدرج تركيز لوغاريتمي (على سبيل المثال ، 0-10-50-100-200-400-800) ^{4،5،6،7،8}.
   2. أضف الكمية المقابلة من فيروس العدسات إلى 2 ميكرولتر / طبق من البوليبرين وتوازن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. قم بتقطير خليط العدسات والبوليبرين ببطء في كل بئر ، واخلطه جيدا ، واحتضنه طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
3. تحديد الحد الأدنى لتركيز البيرومايسين لقتل الخلايا
   1. اضبط كثافة الخلايا الأبوية على 3 × 10⁵ خلايا / مل وتلقيح 1 مل (3 × 10⁵ خلايا) لكل بئر في صفيحة 12 بئر. احتضان اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
   2. أضف بورومايسين إلى كل بئر من الصفيحة المكونة من 12 بئرا في تدرج تركيز 0-0.1-0.2-0.5-1-2-4-8 ميكرومتر. عد الخلايا بعد 72 ساعة. الحد الأدنى للتركيز الذي يقتل جميع الخلايا في البئر هو الحد الأدنى لتركيز البيرومايسين لقتل الخلايا ، والذي سيتم استخدامه للفحص اللاحق للخلايا المصابة بالفيروس.
4. اختيار بوروميسين بعد الإصابة
   1. في اليوم الثاني بعد الإصابة ، قم بشفط الوسط من كل بئر واستبدله ب 1 مل من وسط RPMI 1640 الكامل الذي يحتوي على 10٪ FBS. استمر في الاستزراع لمدة 48 ساعة.
   2. بعد 72 ساعة من الإصابة ، استبدل الوسط الموجود بوسط كامل يحتوي على الحد الأدنى من تركيز بورومايسين لقتل الخلايا. قم بإعداد 2 بئر في صفيحة 12 بئرا بدون عدوى فيروسية كضوابط سلبية وإيجابية. عالج السيطرة السلبية بالبورومايسين ، واترك السيطرة الإيجابية دون علاج. استمر في الاستزراع لمدة 72 ساعة.
   3. بعد 72 ساعة من اختيار بورومايسين ، ستموت جميع الخلايا الأبوية في التحكم السلبي ، بينما تظهر الخلايا الأبوية في التحكم الإيجابي الحد الأدنى من الموت. احسب سبل التنفيذ لكل بئر.
      ملاحظة: وزارة الداخلية = (عدد الخلايا في المجموعة المصابة بالفيروس / عدد الخلايا في مجموعة التحكم الإيجابية) × 100٪. استخدم تركيز الفيروس مع وزارة الداخلية ~ 0.3 للفحص اللاحق.

3. عدوى مكتبة CRISPR الفيروسية على مستوى الجينوم

1. بذر خطوط الخلايا الملتصقة
   1. اضبط كثافة الخلية على 1 × 10⁷ خلايا لكل مل في وسط RPMI 1640 الكامل الذي يحتوي على 10٪ FBS للمرور ونمو الخلايا. تلقيح 1 مل من الخلايا (1 × 10⁷ خلايا) في كل طبق استزراع 15 سم عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 8 ساعات. بمجرد أن تلتصق الخلايا وتصل إلى التقاء 70٪ -80٪ ، كانت جاهزة للعدوى الفيروسية (مما يجعل رقم النسخة حوالي 500).
2. عدوى العدسات
   1. استنشق الوسط من أطباق الاستزراع مقاس 15 سم واستبدله ب 15 مل من الوسط الكامل RPMI 1640 الذي يحتوي على 10٪ FBS. قم بإعداد مكتبة فيروسات عدسية كاملة الجينوم CRISPR تم فحصها بالجودة.
   2. أضف الكمية المقابلة من فيروس العدسات مع وزارة الداخلية = 0.3 إلى 30 ميكرولتر / طبق من البوليبرين وتوازن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ، وقم بتقطير خليط العدسات والبوليبرين ببطء في أطباق الاستزراع مقاس 15 سم ، واخلطها جيدا ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} بين عشية وضحاها. في نفس الوقت ، قم بإعداد طبق ثقافة بطول 15 سم مع الخلية الأبوية على النقيض من ذلك.
3. اختيار بوروميسين بعد الإصابة
   1. في اليوم الثاني بعد الإصابة الفيروسية ، قم بشفط الوسط من أطباق الاستزراع مقاس 15 سم واستبدله ب 15 مل من الوسط الكامل RPMI 1640 الذي يحتوي على 10٪ FBS. استمر في الاستزراع لمدة 48 ساعة.
   2. بعد 72 ساعة من الإصابة، يستبدل الوسط بوسط كامل يحتوي على الحد الأدنى من تركيز البيرومايسين. تعامل مع الخلايا الأبوية غير المصابة كعنصر تحكم سلبي بنفس الطريقة واستمر في الزراعة لمدة 72 ساعة. بعد 72 ساعة من اختيار بورومايسين ، سيتم قتل جميع الخلايا الأبوية في مجموعة التحكم السلبية ، وتعتبر الخلايا الباقية من عدوى الفيروس الحجري مصابة بنجاح.
4. استخراج جينوم اليوم 0
   1. قم بهضم الخلايا من طبق استزراع واحد مقاس 15 سم باستخدام 0.25٪ تربسين ، وأعد تعليقه في وسط RPMI 1640 الكامل الذي يحتوي على 10٪ FBS ، واحسب رقم الخلية. قم بتسمية هذه العينة على أنها اليوم 0.
   2. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق (في درجة حرارة الغرفة) وتخلص من المادة الطافية. قم بإعادة التعليق في 1 مل من PBS ، وجهاز الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية. استخرج الحمض النووي الجيني لليوم 0 ، وقم بقياس تركيز الحمض النووي ونقاءه باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية النانوية.
   3. للكشف عن سلامة sgRNA ، استخدم الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز لتحليل مكتبة sgRNA المضخمة ، مما يضمن أن النطاقات كانت واضحة ولا يوجد تدهور كبير ، وبالتالي الحفاظ على سلامة المكتبة²³. لتقييم تغطية مكتبة العدسات الفيروسية ، استخدم تقنية التسلسل العميق لإجراء تحليل التسلسل على sgRNAs داخل المكتبة^24،25.
   4. في شاشة CRISPR ، يعمل تضخيم PCR كتحقق أولي لسلامة جزء sgRNA وجودة^{المكتبة 6}. لتحليل تغطية المكتبة وأنماط توزيع sgRNA بشكل أكثر شمولا ، ولضمان التمثيل المناسب ل sgRNAs لكل جين مستهدف أثناء الفحص ، قم بإجراء NGS للحصول على رؤى متعمقة حول متانة الشاشة⁹.
      ملاحظة: من خلال اكتشاف التغييرات في وفرة الحمض النووي الريبي الحمض النووي الريبي قبل وبعد الفحص ، وتحديد تكامل sgRNA المحتمل خارج الهدف أو تلوث المكتبة ، يمكن تحسين دقة وموثوقية شاشة كريسبر بشكل أكبر. تعمل عينات اليوم 0 هذه كضوابط سلبية حاسمة وتخضع لتقييم شامل للجودة من خلال تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل و NGS لتحقيق هدفين رئيسيين: (1) تأكيد استنفاد الجينات الأساسية (مما يشير إلى تمثيل مناسب للمكتبة) ، و (2) إظهار التعبير المستقر في الجينات غير الأساسية (إنشاء ظروف خط الأساس التجريبية) ⁹.
   5. التأكد من وصول التغطية إلى المستوى المتوقع لضمان تنوع المكتبة وتمثيلها وتجنب التحيز في عملية الفرز. لقياس كفاءة العدوى ، استخدم التصوير الفلوري لتقييم كفاءة العدوى ، والتأكد من أنه يلبي متطلبات التجربة.

4. تطبيق الإشعاع كشرط فحص

1. تجميع
   1. اضبط كثافة الخلايا المصابة بكريسبر على 1 × 10⁷ خلايا لكل مل وقم بتلقيح 1 مل في كل طبق بتري مقاس 15 سم. احتضان طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
2. العلاج الإشعاعي
   1. قسم الخلايا بشكل عشوائي إلى مجموعتين: مجموعة علاج ومجموعة ضابطة ، مع 6 أطباق لكل مجموعة. إعطاء جرعة مناسبة من الإشعاع للخلايا في مجموعة العلاج ، مع ترك خلايا المجموعة الضابطة دون معالجة لتتكاثر بشكل طبيعي. بعد الإشعاع ، استمر في الحضانة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 7 أيام.
   2. في الأسبوع الثاني ، كرر إعطاء جرعة مناسبة من الإشعاع لخلايا مجموعة العلاج ، مع ترك خلايا المجموعة الضابطة دون معالجة والسماح لها بالتكاثر بشكل طبيعي. بعد العلاج الإشعاعي ، استمر في الحضانة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 7 أيام أخرى.

5. استخراج الجينوم وتسلسله

1. استخراج اليوم 14
   1. بعد 14 يوما من العلاج ، قم بهضم الخلايا في مجموعات العلاج والضابط بنسبة 0.25٪ تربسين ، وأعد تعليقها باستخدام وسط RPMI 1640 الكامل الذي يحتوي على 10٪ FBS ، وقم بتسميته على أنه اليوم 14-RT أو اليوم 14-NC.
   2. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية. أعد التعليق في 1 مل من PBS ، وجهاز الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية مرة أخرى. استخرج الحمض النووي الجيني لليوم 14 ، واكتشف تركيز ونقاء الحمض النووي باستخدام التحليل الطيفي لامتصاص الأشعة فوق البنفسجية النانوية.
2. تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل
   1. قم بإعداد البادئات المقابلة للتسلسل (انظر جدول المواد) وتخفيفها إلى 10 ميكرومتر ، وقم بإعداد نظام تفاعل 20 ميكرولتر عن طريق إضافة الكواشف إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم ، وجهاز طرد مركزي لمدة 5 ثوان عند 300 × جم ، واخلطه جيدا. قم بتعيين معلمات أداة PCR وفقا لحالة التضخيم للحصول على منتجات PCR.
3. الكشف عن الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز
   1. قم بإعداد لوحة صب هلام ، وأغلق حواف القالب بالأغروز ، وأدخل المشط ، وقم بإعداد هلام الاغاروز بتركيز مناسب وفقا لطول الحمض النووي للعينة.
   2. قم بوزن كمية معينة من مسحوق الاغاروز بدقة ، وأضف كمية مناسبة من محلول الرحلان الكهربائي ، واخلطه جيدا ، وقم بتسخينه في فرن الميكروويف حتى يذوب. بعد التبريد قليلا ، أضف كمية مناسبة من صبغة الحمض النووي ، واخلطها برفق ، واسكبها ببطء في قالب صب الجل. اترك الجل يتماسك لمدة 30 دقيقة.
   3. قم بإزالة المشط وأضف كمية مناسبة من مخزن الرحلان الكهربائي إلى خزان الرحلان الكهربائي حتى يغطي الجل. أضف كمية مناسبة من المخزن المؤقت للتحميل إلى عينة الحمض النووي ، واخلطها جيدا ، واستخدم ماصة لإضافة الخليط ببطء إلى العينة جيدا.
   4. اضبط الجهد المناسب بناء على حجم جزء الحمض النووي وتركيز هلام الاغاروز. بعد الرحلان الكهربائي ، قم بإزالة الجل بعناية وضعه في جهاز تصوير هلام لمراقبة النتائج والتحقق مما إذا كان تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ناجحا.
4. تسلسل Illumina
   1. اجمع الحمض النووي الجيني من المجموعات الثلاث (مجموعة اليوم 0 ، والمجموعة الضابطة ، ومجموعة العلاج) ، وأرسله إلى شركة لبناء المكتبات وتسلسل Illumina. إجراء تحليل المعلوماتية الحيوية وتصور نتائج التسلسل للحصول على جينات حساسة للعلاج الإشعاعي ومقاومة للعلاج^{الإشعاعي 26}.
   2. إعداد تجارب متكررة متعددة لتحليل البيانات ، وإجراء تحليل إحصائي على النتائج التجريبية لضمان اتساق البيانات وقابليتها للتكرار^27،28.
5. تقييم جودة بيانات التسلسل
   1. إخضاع البيانات الأولية لآليات تصفية ومراقبة الجودة الصارمة لضمان دقة معلومات التسلسل⁵. احسب درجة فريد (Qphred) لكل نيوكليوتيد بناء على معدل خطأ التسلسل ، باستخدام خوارزمية تحويل محددة ونموذج يقيم احتمالية حدوث خطأ أثناء استدعاء القاعدة²⁸.
   2. حافظ على معدل خطأ التسلسل لكل موضع أساسي أقل من 1٪ (أي ما يعادل عتبة Q30)، وتأكد من أن 80٪ على الأقل من بيانات التسلسل تحقق معيار Q30 هذا لدعم الإجراءات التحليلية اللاحقة.
6. معالجة البيانات ومراقبة الجودة على مستوى العينة
   ملاحظة: للاطلاع على التفاصيل، يرجى الرجوع إلى التقارير المنشورة ^{سابقا 29،30}.
   1. قم بمحاذاة القراءات التي تمت تصفيتها من بيانات التسلسل مع تسلسلات مكتبة sgRNA. إحصائيات التقرير ، بما في ذلك عدد sgRNAs في المكتبة مع محاذاة مثالية ، ومتوسط وفرة sgRNAs ، وعدد sgRNAs التي لم يتم اكتشافها ، ونسبة القراءات من العينات الفردية التي تم تعيينها بنجاح إلى مكتبة sgRNA. استخدم نسبة تعيين أعلى للإشارة إلى تغطية أكبر.
   2. احسب تخصيب القراءات لكل جين (مستهدفة بواسطة sgRNAs مختلفة) في كل عينة. تطبيع القراءات الداعمة لكل sgRNA عبر العينات باستخدام طريقة التطبيع "المتوسطة" الخاصة ب MAGeCK. قم بإجراء مراقبة الجودة على مستوى العينة من خلال تقييم توزيع عدد قراءة sgRNA ، وإنشاء مخططات صندوقية ، وإجراء تحليل المكونات الرئيسية (PCA) ، وإنشاء خرائط حرارية للارتباط.
   3. افترض أن عدد قراءة sgRNA يتبع توزيع بواسون. قم بتصوير أعداد sgRNA الطبيعية من مجموعات مختلفة في مخططات صندوقية لتصور التوزيع الكلي للبيانات داخل العينات ومقارنة التوزيعات بين المجموعات.
   4. استخدم PCA لتبسيط تحليل البيانات من خلال عكس الاختلافات بين المكونات الرئيسية ومعدل التباين داخل كل مكون ، مما يسهل ملاحظة الاختلافات داخل المجموعات وفيما بينها. استخدم خريطة تمثيلية للارتباط لتوضيح العلاقات بين العينات.
7. التحليل الأساسي
   1. إجراء تحليل sgRNA التفاضلي بين المجموعات وتحديد الجينات الأساسية بعد مراقبة الجودة ومعالجة البيانات الأولية. إجراء تحليل التخصيب الوظيفي للجينات ذات الصلة³⁰. رتب الجينات الأساسية بناء على درجة تجميع الرتبة القوية (RRA) المحسوبة بواسطة MAGeCK أو الطرق الإحصائية الأخرى مثل MLE ، مع درجة RRA أقل تشير إلى أهمية أعلى.
   2. استخدم لغة R أو لغات البرمجة الأخرى لإجراء تحليل المعلوماتية الحيوية على النتائج المصنفة ، وتصور النتائج باستخدام مخططات تحليل GO و KEGG³⁰. اربط الجينات أو البروتينات بمصطلحات GO المقابلة (الوظيفة الجزيئية والعملية البيولوجية والمكون الخلوي) من خلال رسم خرائط الهوية أو التعليق التوضيحي للتسلسل.
   3. استخدم KEGG كقاعدة بيانات لفهم الوظائف عالية المستوى والأنظمة البيولوجية ، وربط كتالوج الجينات المحدد بوظائف النظام على المستويات الخلوية والأنواع والنظام البيئي. حدد أفضل 10 أو 20 مسارا من تحليلات GO و KEGG للحصول على عرض بديهي لاتجاهات المسار.

النتائج

يمثل سرطان الرئة ، مع معدل الوفيات الأكبر ، مرضا طبيا شديد العدوانية وانتشارا. باستخدام خط خلايا سرطان الرئة A549 كمثال لإجراء شاشة كريسبر على مستوى الجينوم مع الإشعاع كحالة فحص ، يظهر سير العمل التخطيطي في الشكل 1. أولا ، استكشف حساسية خلايا A549 لجرعات مختل?...

Discussion

كتقنية متطورة لتحرير الجينات ، أحدثت شاشة كريسبر تغييرات عميقة في مجال البحث العلمي⁵. نشأت هذه التقنية من نظام CRISPR-Cas9 ، وأصبحت أداة أساسية لدراسة وظائف الجينات نظرا لكفاءتها العالية ودقتها⁹. يتضمن المبدأ الهندسي CRISPR / Cas9 تصميم وإدخال sgRNAs محددة م?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
150 mm cell and tissue culture dish	Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.	715011	Cell culture
35 mm cell and tissue culture dish	Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.	706011	Cell culture
A549 cell line	ATCC	-	-
Cell counting kit-8	Shanghai Beyotime Biotech Inc	C0041	For cell viability assay
CO2-independent medium	PHCbi	MCO-50AIC	Cell culture
Countess 3 FL automated cell counter	Themo Scientific	AMQAF2001	For cell counting
EDTA	Gibco	25200056	Cell culture
Fetal bovine serum	Gibco	10099141	Cell culture
Fluorescence microscopy	LEICA	ebq 100-04	For fluorescence microscope
Genome-wide CRISPR lentiviral library	Shanghai OBiO Technology Co., Ltd.	H5070	For lentiviral infection
MiniAmp plus PCR	Themo Scientific	C37835	For PCR amplification
NEST cell culture plates, 12-well	Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.	712002	Cell culture
NEST cell culture plates, 6-well	Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.	703002	Cell culture
NEST cell culture plates, 96-well	Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.	701001	Cell culture
PBS	Gibco	C10010500BT	Cell culture
PCR forward primer (AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG)	Beijing AuGCT Biotech Co., Ltd.	-	For PCR amplification
PCR reverse primer (GATGTGCGCTCTGCCCACTGACGGGCA)	Beijing AuGCT Biotech Co., Ltd.	-	For PCR amplification
Polybrene	Shanghai Beyotime Biotech Inc	C0351	For lentiviral infection
Puromycin	MCE	HY-K1057	For seletion post lentiviral infection
RPMI 1640 cell culture medium	Gibco	23400-021	Cell culture
TIANGENamp genomic DNA kit	Beijing TIANGEN Biotech Co.,Ltd.	DP304	For genomic DNA extraction
X-ray powder diffractometer	PerkinElmer		For radiotherapy