用于揭示放射敏感和放射抗性基因的全基因组 CRISPR 筛选

摘要

通过应用全基因组 CRISPR/Cas9 筛选方法，给出了一种细致而结构化的方法来选择耐药和敏感的辐射基因。该协议还具有可能作为其他研究工作的多功能框架，以调查对临床给药的化学药物的耐药机制。

摘要

CRISPR-Cas9 系统已被利用并重新用于强大的基因组编辑工具。通过利用这项技术，研究人员可以精确地剪切、粘贴甚至重写活细胞内的 DNA 序列。然而，CRISPR 筛选技术的应用远远超出了单纯的实验。它是对抗遗传疾病的关键工具，系统地剖析复杂的遗传景观，使研究人员能够揭示生物现象背后的分子机制，并使科学家能够识别和定位癌症、囊性纤维化和镰状细胞性贫血等疾病的根本原因。其中，癌症对医学构成了巨大的挑战，刺激了根除工作。放疗作为一种传统治疗方法，效果好，但有局限性。它可以根除癌细胞，但也损害健康组织，造成降低生活质量的不利影响。此外，并非所有癌细胞都对放疗有反应，有些癌细胞可能会产生耐药性，使病情恶化。为了解决这个问题，引入了一种全面的全基因组 CRISPR 筛选技术，因为它能够有效识别放射敏感和放射抗性基因，从而推进癌症研究和治疗领域。按照所述方案对暴露于辐射的肺腺癌细胞进行全基因组 CRISPR 筛选，通过该方案鉴定了放射抗性和放射敏感性相关基因。

引言

对生物现象的研究本质上与对细胞行为的研究交织在一起，反过来，对细胞行为的检查从根本上与其基因组的探索有关。随着现代技术的不断发展，医学研究人员正逐渐将注意力转移到通过基因编辑改变细胞行为上，以提高各种疾病的治疗效果。在这方面，由于其应用相对简单，成簇规则间隔短回文重复序列 （CRISPR） 技术已成为基因组编辑的革命性工具¹。CRISPR-Cas9 系统由 Cas9 核酸酶和单向导 RNA （sgRNA） 组成，可特异性识别并结合靶 DNA 序列，引导 Cas9 核酸酶在该位置切割，导致基因组 DNA 出现双链断裂 （DSB） ^2,3,4。此外，其他物质的引入会导致基因组中的特异性插入、缺失或突变，从而实现靶向基因编辑。

在功能基因组学研究中，RNA 干扰 （RNAi） 筛选曾经是进行大规模功能丧失实验以研究基因在癌症中的作用的广泛使用的方法。RNAi 技术通过特异性沉默靶基因来研究基因功能，帮助研究人员识别关键的致癌因素。然而，它受到脱靶效应和不完全基因敲低效率的限制。脱靶效应可能导致其他非靶基因沉默，从而影响实验结果的准确性和可靠性 ^1,2。此外，RNAi 对某些基因的敲低效率较低，可能无法完全抑制靶基因表达。与传统的 RNAi 筛选相比，CRISPR 筛选表现出更高的特异性和效率³。该技术不仅可以精确编辑特定基因，还可以进行全基因组大规模筛选，为基因功能研究提供有力支持。CRISPR 筛选技术是一种基于 CRISPR-Cas9 系统的强大基因编辑工具，用于高效筛选和揭示细胞中特定基因的未知功能 5,6,7,8。研究人员针对特定基因或基因区域批量设计 sgRNA，并精确、严格地制备相应的 sgRNA 文库，确保其完整性和功能性⁹。然后将这些 sgRNA 文库封装到慢病毒颗粒中，用于有效感染宿主细胞。成功感染后，在个人定义的筛选条件下培养感染的细胞。筛选后，提取筛选细胞的基因组 DNA，保持高标准的纯度和数量。随后，对 sgRNA 目标的靶向区域进行 PCR 扩增，该过程可准确复制所需的核酸片段 ^3,9。最后，对扩增的 DNA 片段进行高通量测序，从而能够对目标区域进行全面高效的分析，从而为研究基因的功能和行为提供有价值的见解⁴。

癌症是一种复杂的疾病，对人类健康构成了巨大的威胁。在全球范围内，研究人员和临床医生正在齐心协力，以揭示致癌作用的分子机制并开发新的治疗策略。已经建立了国际合作，以加速基础研究结果向临床应用的转化，最终目标是改善患者的预后。Sasmal 等人提出了一种基于合成主客体系统的生物正交组装策略，用于精确靶向转移性癌细胞，这极大地帮助了数十名科学家推进医疗技术。他们出色的研究工作具有高度的创新和独特的见解，为科学界做出了有意义的贡献¹⁰.癌症的特征是基因组不稳定的动荡状态，这是由 DNA 损伤反应的不稳定调节引起的^11-14。DNA 损伤包括单核苷酸缺陷、单链断裂和 DSB。同源重组 （HR） 和非同源末端连接 （NHEJ） 参与不同阶段的 DSB 修复 15,16,17。在此基础上，放疗已成为一种可行的治疗选择，它利用高能射线（如 X 射线和 γ 射线）照射肿瘤组织，在肿瘤细胞中造成 DNA 损伤，从而破坏其生长和增殖¹⁸。然而，放疗并不总是在很大一部分癌症患者中产生理想的效果，这可能是由于癌旁组织的损伤和肿瘤固有特征造成的限制，例如对放疗的低敏感性 19,20,21。

理论上，任何细胞类型都可用于 CRISPR 筛选。然而，在突变群体中保持足够的代表性需要大量的起始细胞。丰度低的细胞类型不是特别适合全基因组筛选。至于文库的选择，大多数文库每个靶基因包含 3-6 个 gRNA，维持每个 gRNA 在种群中的分布至关重要¹⁸。由于特异性 gRNA 的富集或耗竭而导致的代表性丧失可能导致结果分布不均匀。为了解决这个问题，选择经过市场测试的市售 CRISPR 文库可能是一个更可取的选择²⁰。 体外 使用同质癌细胞系的 CRISPR 筛选可能无法完全捕获 体内 肿瘤的遗传和表观遗传异质性。虽然 体外 筛选揭示了参与 DNA 损伤修复和辐射诱导的自分泌信号传导的关键基因，但它并没有完全复制肿瘤微环境，包括缺氧诱导的放射抗性（通过 ROS、代谢适应和自噬）、免疫介导的旁分泌效应和 ECM 依赖性细胞因子调节。在使用 CRISPR 筛选探索与辐射敏感性或耐药性相关的基因之前，必须仔细考虑这些因素。鉴于目前的治疗形势，迫切需要确定并深入研究与放射耐药性和放射敏感性相关的因素，以有效提高放射治疗效果²²。鉴于 CRISPR 筛选在研究未知基因功能方面的关键优势，提供了一种系统详细的全基因组 CRISPR 筛选技术，以有效识别放射敏感和放射抗性基因。

研究方案

本研究中使用的试剂和设备列在 材料表中。

1. 选择合适的辐射剂量

1. 贴壁细胞的制备和铺板
   1. 使用含有 10% FBS 的 RPMI 1640 完全细胞培养基，将细胞密度调节至 5 x 10⁵ 个细胞/mL，用于传代和细胞生长。将细胞分配到 3.5 cm 培养皿中，以不同剂量进行辐射。向每个培养皿中加入 2 mL（1 x 10⁶ 个细胞），并在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育过夜。
2. 应用不同的辐射剂量
   1. 将 3.5 厘米的培养皿从 1 到 5 编号。使用组 #1 作为对照组，其余 4 组指定为治疗组。
   2. 用密封膜密封 6 孔板的边缘，用于治疗组，并分别施用 2、4、6 和 8 Gy 的辐射剂量。处理后，将培养皿放回培养箱中。
3. 放疗后细胞系的铺板
   1. 准备 6 孔板和 96 孔板。用 PBS 洗涤 3.5 cm 培养皿中的细胞一次，用 0.25% 胰蛋白酶消化对数生长的细胞，并使用含有 10% FBS 的 RPMI 1640 完全培养基将细胞密度调节至 1 x 10⁵ 个细胞/mL。
   2. 将 10 μL/孔（1,000 个细胞/100 μL）接种到 6 孔板中，每个辐射剂量重复 3 次。向每个孔中加入 2 mL 完全培养基，并在 14 天后计数（当每个克隆组有大约 50 个细胞时）。
   3. 将 30 μL/孔（3,000 个细胞/100 μL）接种到 96 孔板中，每个辐射剂量重复 5 次。向每个孔中加入 70 μL 完全培养基，并在 72 小时后测量细胞活力。
4. 细胞活力测量
   注：克隆形成抑制率 = 1 - （处理组中的克隆数/对照组中的克隆数）x 100%。CCK-8 测定利用水溶性四唑盐 （WST-8），该盐可被细胞脱氢酶还原，生成高度水溶性黄色甲臜产物¹¹。甲臜的产生量与活细胞的数量成正比，其光密度（在 450 nm 波长下测量）准确反映了细胞代谢活性和增殖状态^11,13。基于这一公认的原理，CCK-8 检测已被广泛用于各种应用，包括细胞增殖检测和肿瘤药物敏感性检测。在该方案中，采用 CCK-8 测定法系统评估不同辐射剂量下的细胞活力。
   1. 将 CCK8 试剂与不含 FBS 的 RPMI 1640 培养基以 1：9 的比例混合。丢弃 96 孔板中的培养基，并向每个孔中加入 100 μL 含 CCK8 的培养基。
   2. 在黑暗中孵育 1 小时，并使用酶标仪测量 450 nm 处的 OD 值。
      注：细胞存活率 = [（处理组的 OD 值 - 空白孔的 OD 值） / （对照组的 OD 值 - 空白孔的 OD 值）] x 100%
5. 辐射剂量的选择
   1. 将克隆形成抑制率与细胞存活率相结合，以便根据研究需要选择合适的辐射剂量。选择抑制率为 50% 的辐射剂量，用于筛选放射抗性和放射敏感基因。

2. 选择合适的 MOI 和嘌呤霉素浓度

1. 贴壁细胞的铺板
   1. 将细胞密度调节至 3 x 10⁵ 个细胞/mL，并将每孔 1 mL（3 x 10⁵ 个细胞）接种到 12 孔板中。将板在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育过夜。
2. 慢病毒感染
   1. 使用移液器从 12 孔板中吸出培养基，并用 1 mL 含有 10% FBS 的 RPMI 1640 完全培养基替换。准备经过质量检查的全基因组 CRISPR 慢病毒文库（建议使用市售文库）并设置对数浓度梯度（例如，0-10-50-100-200-400-800）4,5,6,7,8。
   2. 将相应量的慢病毒添加到 2 μL/皿的聚凝胺中，并在室温下平衡 5 分钟。将慢病毒和聚凝胺混合物缓慢滴入每个孔中，充分混合，并在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育过夜。
3. 测定用于细胞杀伤的最低嘌呤霉素浓度
   1. 将亲代细胞密度调节至 3 x 10⁵ 个细胞/mL，并将每孔 1 mL（3 x 10⁵ 个细胞）接种到 12 孔板中。将板在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育过夜。
   2. 将嘌呤霉素以 0-0.1-0.2-0.5-1-2-4-8 μM 的浓度梯度添加到 12 孔板的每个孔中。72 小时后计数细胞。杀死孔中所有细胞的最低浓度是用于细胞杀伤的最低嘌呤霉素浓度，将用于后续病毒感染细胞的筛选。
4. 感染后嘌呤霉素的选择
   1. 感染后的第二天，从每个孔中吸出培养基，并用 1 mL 含有 10% FBS 的 RPMI 1640 完全培养基替换。继续培养 48 小时。
   2. 感染 72 小时后，用含有用于细胞杀伤的最低嘌呤霉素浓度的完全培养基替换现有培养基。在 12 孔板中设置 2 个孔，没有慢病毒感染作为阴性和阳性对照。用嘌呤霉素处理阴性对照，不处理阳性对照。继续培养 72 小时。
   3. 嘌呤霉素选择 72 小时后，阴性对照中的所有亲代细胞都将死亡，而阳性对照中的亲本细胞则显示出最小的死亡。计算每个孔的 MOI。
      注：MOI =（病毒感染组中的细胞数/阳性对照组中的细胞数）x 100%。使用 MOI 为 ~0.3 的病毒浓度进行后续筛选。

3. 全基因组 CRISPR 慢病毒文库感染

1. 贴壁细胞系的接种
   1. 在含有 10% FBS 的 RPMI 1640 完全培养基中，将细胞密度调节至每毫升 1 x 10⁷ 个细胞，用于传代和细胞生长。将 1 mL 细胞（1 x 10⁷ 个细胞）接种到每个 15 cm 培养皿中，在 37 °C 和 5% CO₂ 下接种 8 小时。一旦细胞粘附并达到 70%-80% 的汇合度，它们就准备好进行病毒感染（拷贝数约为 500）。
2. 慢病毒感染
   1. 从 15 cm 培养皿中吸出培养基，并用 15 mL 含有 10% FBS 的 RPMI 1640 完全培养基替换。准备经过质量检查的全基因组 CRISPR 慢病毒文库。
   2. 加入相应量的 MOI = 0.3 至 30 μL/皿聚凝胺慢病毒，并在室温下平衡 5 分钟，将慢病毒和聚凝胺混合物缓慢滴入 15 cm 培养皿中，充分混合，并在 37 °C 下用 5% CO₂ 孵育过夜。同时，准备一个 15 cm 的培养皿，以亲本细胞作为对比。
3. 感染后嘌呤霉素的选择
   1. 在病毒感染后的第二天，从 15 cm 培养皿中吸出培养基，并用 15 mL 含有 10% FBS 的 RPMI 1640 完全培养基替换。继续培养 48 小时。
   2. 感染后 72 小时，用含有最低致死浓度嘌呤霉素的完全培养基替换培养基。以相同的方式将未感染的亲本细胞视为阴性对照，并继续培养 72 小时。嘌呤霉素选择 72 小时后，阴性对照组中的亲本细胞将被全部杀死，慢病毒感染中存活的细胞被认为成功感染。
4. 提取第 0 天的基因组
   1. 使用 0.25% 胰蛋白酶从一个 15 cm 培养皿中消化细胞，重悬于含有 10% FBS 的 RPMI 1640 完全培养基中，并计数细胞数量。将此样本标记为第 0 天。
   2. 以 300 x g 离心 5 分钟（在室温下）并弃去上清液。重悬于 1 mL PBS 中，以 300 x g 离心 5 分钟，然后弃去上清液。提取第 0 天基因组 DNA，使用 nanodrop 紫外分光光度计测量 DNA 浓度和纯度。
   3. 对于 sgRNA 完整性检测，使用琼脂糖凝胶电泳分析扩增的 sgRNA 文库，确保条带清晰且无明显降解，从而保持文库的完整性²³。对于慢病毒文库覆盖率评估，采用深度测序技术对文库内的 sgRNA 进行测序分析^24,25。
   4. 在 CRISPR 筛选中，PCR 扩增可作为 sgRNA 片段完整性和文库质量的初步验证⁶。为了更全面地分析文库覆盖率和 sgRNA 分布模式，并确保在筛选过程中每个靶基因的 sgRNA 充分代表性，请进行 NGS 以深入了解筛选⁹ 的稳健性。
      注：通过检测筛选前后 sgRNA 丰度的变化，并识别潜在的 sgRNA 脱靶整合或文库污染，可以进一步提高 CRISPR 筛选的准确性和可靠性。这些第 0 天样品作为关键的阴性对照，并通过 PCR 扩增和 NGS 进行全面质量评估，以实现 2 个关键目标：（1） 确认必需基因耗竭（表明文库充分表达），以及 （2） 证明非必需基因中稳定表达（建立实验基线条件）⁹。
   5. 确保覆盖率达到预期水平，确保文库的多样性和代表性，避免筛选过程中的偏差。对于感染效率测量，使用荧光成像评估感染效率，确保其满足实验要求。

4. 应用辐射作为筛查条件

1. 分组
   1. 将 CRISPR 感染细胞的密度调节至每毫升 1 x 10⁷ 个细胞，并将 1 mL 接种到每个 15 厘米培养皿中。在 37 °C 下用 5% CO₂ 孵育过夜。
2. 放射治疗
   1. 将细胞随机分为 2 组：处理组和对照组，每组 6 个培养皿。对治疗组的细胞进行适当剂量的放射治疗，而让对照组的细胞不经处理以正常繁殖。照射后，继续在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 7 天。
   2. 在第二周，重复对治疗组细胞进行适当剂量的辐射，让对照组细胞不处理并让它们正常繁殖。放疗后，继续在 37 °C 和 5% CO₂ 下再孵育 7 天。

5. 基因组提取和测序

1. 第 14 天的提取
   1. 处理 14 天后，用 0.25% 胰蛋白酶消化处理组和对照组的细胞，使用含有 10% FBS 的完全 RPMI 1640 培养基重悬它们，并将它们标记为第 14 天-RT 或第 14 天-NC。
   2. 将细胞以 300 x g 离心 5 分钟，然后弃去上清液。重悬于 1 mL PBS 中，以 300 x g 离心 5 分钟，然后再次弃去上清液。提取第 14 天的基因组 DNA，并使用 nanodrop UV 吸光度光谱检测 DNA 的浓度和纯度。
2. PCR 扩增
   1. 准备序列的相应引物（参见 材料表）并将它们稀释至 10 μM.将试剂添加到无菌微量离心管中，建立 20 μL 反应系统，以 300 x g 离心 5 秒，并充分混合。根据扩增条件设置 PCR 仪器参数，得到 PCR 产物。
3. 琼脂糖凝胶电泳检测
   1. 准备凝胶铸板，用琼脂糖密封模具边缘，插入梳子，根据样品 DNA 的长度制备适当浓度的琼脂糖凝胶。
   2. 精密称取一定量的琼脂糖粉，加入适量电泳缓冲液，混匀，置微波炉中加热熔化。稍微冷却后，加入适量的核酸染料，轻轻混匀，缓缓倒入凝胶流延模具中。让凝胶凝固 30 分钟。
   3. 取下电泳梳，向电泳槽中加入适量的电泳缓冲液，直至其覆盖凝胶。向 DNA 样品中加入适量的上样缓冲液，充分混匀，然后用移液管将混合物缓慢加入样品孔中。
   4. 根据 DNA 片段的大小和琼脂糖凝胶的浓度设置适当的电压。电泳后，小心取出凝胶并将其放入凝胶成像仪中，观察结果并检查 PCR 扩增是否成功。
4. Illumina 测序
   1. 从三组（Day 0 组、对照组和治疗组）收集基因组 DNA，并将其发送给一家公司进行文库构建和 Illumina 测序。对测序结果进行生物信息学分析和可视化，以获得放疗敏感和放疗耐药的基因²⁶。
   2. 设置多个重复实验进行数据分析，并对实验结果进行统计分析，确保数据的一致性和重现性^27,28。
5. 测序数据的质量评估
   1. 对原始数据进行严格的过滤和质量控制机制，以保证测序信息的精度⁵.使用指定的转换算法和评估碱基检出期间发生错误可能性的模型，根据测序错误率计算每个核苷酸的 Phred 分数 （Qphred）²⁸。
   2. 将每个碱基位置的测序错误率保持在 1% 以下（相当于 Q30 阈值），并确保至少 80% 的测序数据达到该 Q30 标准，以支持后续分析程序。
6. 数据处理和样品级质量控制
   注：有关详细信息，请参阅以前发布的报告^29,30。
   1. 将测序数据中过滤的读数与 sgRNA 文库序列进行比对。报告统计数据，包括文库中完美比对的 sgRNA 数量、sgRNA 的平均丰度、未检测到的 sgRNA 数量以及成功映射到 sgRNA 文库的单个样品的读数比例。使用较高的映射比率表示覆盖范围更大。
   2. 计算每个样品中每个基因（靶向不同 sgRNA）的读数富集。使用 MAGeCK 的“中位”归一化方法对样品中每个 sgRNA 的支持读数进行归一化。通过评估 sgRNA 读取计数的分布、生成箱线图、进行主成分分析 （PCA） 和构建相关热图来执行样品级质量控制。
   3. 假设 sgRNA 读取计数服从泊松分布。在箱形图中描述来自不同组的标准化 sgRNA 计数，以可视化样品内的整体数据分布并比较组间分布。
   4. 使用 PCA 通过反映主成分之间的差异和每个成分内的变异率来简化数据分析，从而促进对组内和组间变异的观察。使用相关性热图来说明样本之间的关系。
7. 基本分析
   1. 进行组间差异 sgRNA 分析，并在质量控制和初步数据处理后确定必需基因。对相关基因进行功能富集分析³⁰.根据 MAGeCK 或其他统计方法（如 MLE）计算的稳健秩聚合 （RRA） 分数对基本基因进行排名，RRA 分数越低表示重要性越高。
   2. 使用 R 语言或其他编程语言对排名结果进行生物信息学分析，并使用 GO 和 KEGG 分析图³⁰ 可视化结果。通过 ID 映射或序列注释将基因或蛋白质与相应的 GO 术语（分子功能、生物过程和细胞成分）联系起来。
   3. 使用 KEGG 作为数据库来了解高级功能和生物系统，将已识别的基因目录与细胞、物种和生态系统水平的系统功能联系起来。从 GO 和 KEGG 分析中选择前 10 或 20 条通路，以直观地显示通路方向。

结果

肺癌的死亡率最高，是一种高度侵袭性和普遍的医学疾病。以肺癌细胞系 A549 为例，以辐射为筛选条件进行全基因组 CRISPR 筛选，示意图工作流程如图 1 所示。首先，通过克隆形成和 CCK8 实验探索 A549 细胞对不同剂量辐射的敏感性（图 2）。在克隆形成测定中，2 Gy 时菌落计数为 140 ± 5.35，而 0 Gy 时为 303 ± 31.63，而在 CCK-8 测定?...

讨论

CRISPR 筛选作为一项前沿的基因编辑技术，在科研领域引发了深刻的变化⁵.该技术起源于 CRISPR-Cas9 系统，由于其高效和精确性，已成为研究基因功能的重要工具⁹。CRISPR/Cas9 工程原理包括设计和引入具有大约 20 个核苷酸的特异性 sgRNA，以指导 Cas9 核酸酶精确定位和切割靶标 DNA 序列，从而实现基因编辑，如敲除、激活或抑制^6...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
150 mm cell and tissue culture dish	Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.	715011	Cell culture
35 mm cell and tissue culture dish	Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.	706011	Cell culture
A549 cell line	ATCC	-	-
Cell counting kit-8	Shanghai Beyotime Biotech Inc	C0041	For cell viability assay
CO2-independent medium	PHCbi	MCO-50AIC	Cell culture
Countess 3 FL automated cell counter	Themo Scientific	AMQAF2001	For cell counting
EDTA	Gibco	25200056	Cell culture
Fetal bovine serum	Gibco	10099141	Cell culture
Fluorescence microscopy	LEICA	ebq 100-04	For fluorescence microscope
Genome-wide CRISPR lentiviral library	Shanghai OBiO Technology Co., Ltd.	H5070	For lentiviral infection
MiniAmp plus PCR	Themo Scientific	C37835	For PCR amplification
NEST cell culture plates, 12-well	Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.	712002	Cell culture
NEST cell culture plates, 6-well	Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.	703002	Cell culture
NEST cell culture plates, 96-well	Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.	701001	Cell culture
PBS	Gibco	C10010500BT	Cell culture
PCR forward primer (AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG)	Beijing AuGCT Biotech Co., Ltd.	-	For PCR amplification
PCR reverse primer (GATGTGCGCTCTGCCCACTGACGGGCA)	Beijing AuGCT Biotech Co., Ltd.	-	For PCR amplification
Polybrene	Shanghai Beyotime Biotech Inc	C0351	For lentiviral infection
Puromycin	MCE	HY-K1057	For seletion post lentiviral infection
RPMI 1640 cell culture medium	Gibco	23400-021	Cell culture
TIANGENamp genomic DNA kit	Beijing TIANGEN Biotech Co.,Ltd.	DP304	For genomic DNA extraction
X-ray powder diffractometer	PerkinElmer		For radiotherapy