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Method Article
* これらの著者は同等に貢献しました
ゲノムワイドなCRISPR/Cas9スクリーニング法の適用により、放射線耐性および感受性遺伝子を選択するために、細心の注意を払った構造化されたアプローチが与えられています。このプロトコルは、臨床投与された化学薬品に対する耐性のメカニズムを調査する他の研究努力のための汎用性の高いフレームワークとしても役立つ可能性を秘めています。
CRISPR-Cas9システムは、強力なゲノム編集ツールとして活用され、再利用されています。この技術を活用することで、研究者は生細胞内のDNA配列を正確に切り取り、貼り付け、さらには書き換えることができます。それにもかかわらず、CRISPRスクリーニング技術の応用は、単なる実験をはるかに超えています。これは、遺伝病との闘いにおける極めて重要なツールとして機能し、複雑な遺伝的ランドスケープを体系的に分析し、研究者が生物学的現象の根底にある分子メカニズムを解明し、科学者ががん、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血などの病気の根本原因を特定して標的にすることを可能にしています。中でも、がんは医療にとって大きな課題であり、撲滅に向けた取り組みに拍車をかけています。放射線療法は、従来の治療法として、結果をもたらしますが、限界があります。がん細胞を根絶するだけでなく、健康な組織に損傷を与え、生活の質を低下させる悪影響を引き起こします。さらに、すべてのがん細胞が放射線療法に反応するわけではなく、一部のがん細胞が耐性を獲得し、状態を悪化させる可能性があります。これに対処するために、放射線感受性および放射線耐性遺伝子の効率的な同定を可能にする包括的な全ゲノムCRISPRスクリーニング技術が導入され、がんの研究と治療の分野が進歩します。記載されたプロトコルに従って照射に曝露された肺腺癌細胞において、ゲノムワイドなCRISPRスクリーニングを実施し、それを通じて放射線抵抗性および放射線感受性関連遺伝子の両方を同定した。
生命現象の解明は、細胞の振る舞いの研究と本質的に絡み合っており、細胞の振る舞いの解明は、そのゲノムの探索と根本的につながっています。現代の技術が進化し続ける中、医学研究者は、さまざまな疾患の治療結果を向上させるために、遺伝子編集による細胞の振る舞いの変化に徐々に注意を向けています。この点で、クラスター化規則的な間隔を空けた短い回文反復(CRISPR)技術は、その比較的単純なアプリケーションにより、ゲノム編集の革新的なツールとして浮上しています1。CRISPR-Cas9システムは、Cas9ヌクレアーゼとシングルガイドRNA(sgRNA)で構成されており、標的DNA配列を特異的に認識して結合し、Cas9ヌクレアーゼをその場所で切断するように誘導し、ゲノムDNA2,3,4の二本鎖切断(DSB)を引き起こします。さらに、他の物質の導入は、ゲノムへの特定の挿入、欠失、または突然変異につながる可能性があり、標的遺伝子編集が可能になります。
機能ゲノミクス研究において、RNA干渉(RNAi)スクリーニングは、かつてがんにおける遺伝子の役割を調査するための大規模な機能喪失実験を行うための方法として広く利用されていました。RNAi技術は、標的遺伝子を特異的にサイレンシングすることにより遺伝子機能を研究し、研究者が重要な発がん因子を特定するのに役立ちます。しかし、オフターゲット効果や遺伝子ノックダウン効率が不完全であることには限界があります。オフターゲット効果は、他の非標的遺伝子のサイレンシングにつながり、それによって実験結果の精度と信頼性を損なう可能性がある1,2。さらに、RNAiは特定の遺伝子に対して低いノックダウン効率を示し、標的遺伝子の発現を完全に抑制できない可能性があります。従来のRNAiスクリーニングとは対照的に、CRISPRスクリーニングはより高い特異性と効率性を示します3。この技術により、特定の遺伝子を精密に編集できるだけでなく、ゲノムワイドな大規模スクリーニングも可能となり、遺伝子機能研究を強力にサポートします。CRISPR-Cas9システムに基づく強力な遺伝子編集ツールであるCRISPRスクリーニング技術は、細胞5、6、7、8の特定の遺伝子の未知の機能を効率的にスクリーニングし、明らかにするために使用されます。研究者は、特定の遺伝子または遺伝子領域に対してsgRNAをバッチで設計し、対応するsgRNAライブラリーを正確かつ厳密に調製し、その完全性と機能性を確保します9。その後、これらのsgRNAライブラリーはレンチウイルス粒子にカプセル化され、宿主細胞に効率的に感染するために使用されます。感染が成功した後、感染した細胞は、個別に定義されたスクリーニング条件下で培養されます。スクリーニング時には、スクリーニングされた細胞のゲノムDNAが抽出され、高水準の純度と量が維持されます。続いて、sgRNAの標的領域をPCR増幅にかけ、核酸の所望のセグメントを正確に複製するプロセス3,9を行う。最後に、増幅されたDNA断片に対してハイスループットシーケンシングが行われ、標的領域の包括的かつ効率的な解析が可能になり、研究対象の遺伝子の機能と挙動に関する貴重な洞察が得られます4。
がんは、複雑な病気として人間の健康にとって手ごわい脅威となっています。世界中の研究者と臨床医が、発がんの分子メカニズムを解明し、新しい治療戦略を開発するために協力して取り組んでいます。基礎研究の成果を臨床応用につなげるための国際協力が確立され、最終的には患者の転帰を改善することを目標としています。Sasmal et al.は、転移性がん細胞の正確な標的化のための合成ホスト-ゲストシステムに基づく生体直交アセンブリ戦略を提案し、数十人の科学者が医療技術を進歩させるのに大きく貢献しました。彼らの優れた研究活動は、高い革新性と独自の洞察力を持ち、科学界に有意義な貢献をしています10。がんは、DNA損傷応答の不規則な制御から生じるゲノム不安定性の激動状態を特徴としています11-14。DNA損傷には、一塩基欠損、一本鎖切断、およびDSBが含まれ、相同組換え(HR)および非相同末端結合(NHEJ)は、異なる段階でDSBの修復に関与する15,16,17。これに基づいて、放射線療法は、高エネルギー光線(X線やγ線など)を利用して腫瘍組織に放射線を照射し、腫瘍細胞にDNA損傷を引き起こし、それによって腫瘍細胞の成長と増殖を妨害する実行可能な治療選択肢として浮上しています18。しかし、放射線療法は、かなりの割合のがん患者において必ずしも望ましい効果をもたらすとは限らず、パラがん組織への損傷や、放射線療法に対する感度の低さなどの腫瘍の固有の特性によって課せられる制限に起因する可能性がある19,20,21。
理論的には、どの細胞タイプでもCRISPRスクリーニングに使用することができます。しかし、変異した集団で十分な代表性を維持するためには、多数の開始細胞が必要です。存在量が少ない細胞種は、ゲノムワイドスクリーニングには特に適していません。ライブラリーの選択に関しては、ほとんどのライブラリーは標的遺伝子ごとに3〜6個のgRNAを含み、集団内の各gRNAの分布を維持することは重要である18。特定のgRNAの濃縮または枯渇による表現の喪失は、結果の分布にばらつきをもたらす可能性があります。この問題に対処するためには、市場でテストされた市販のCRISPRライブラリーを選択することが好ましい選択であり得る20。 インビトロ 均質ながん細胞株を用いたCRISPRスクリーニングでは、 in vivo 腫瘍の遺伝的およびエピジェネティックな不均一性を完全に捉えられない可能性があります。 in vitro スクリーニングにより、DNA損傷修復と放射線誘発性オートクリンシグナル伝達に関与する主要な遺伝子が明らかになりましたが、低酸素誘導性放射線耐性(ROS、代謝適応、オートファジー経由 )、免疫介在性パラクリン効果、ECM依存性サイトカイン調節など、腫瘍微小環境を完全に再現することはできませんでした。放射線感受性または放射線耐性に関連する遺伝子を探索するためにCRISPRスクリーニングを使用する前に、これらの要因を慎重に検討する必要があります。現在の治療状況に照らして、放射線治療の有効性を効果的に高めるためには、放射線抵抗性と放射線感受性に関連する因子を特定し、深く研究することが急務です22。未知の遺伝子の機能を研究する上でのCRISPRスクリーニングの主な利点を考慮して、放射線感受性および放射線耐性遺伝子を効率的に同定するために、体系的に詳細な全ゲノムCRISPRスクリーニング技術が提供されます。
この研究で使用した試薬と機器は、 材料表に記載されています。
1. 適切な放射線量の選定
2. 適切なMOIとピューロマイシン濃度の選択
3. ゲノムワイドCRISPRレンチウイルスライブラリー感染
4. スクリーニング条件としての放射線の適用
5. ゲノムの抽出とシーケンシング
肺がんは、死亡率が最も高く、非常に侵攻性が高く、蔓延している医学的疾患です。肺がん細胞株A549を例に、放射線をスクリーニング条件としてゲノムワイドなCRISPRスクリーニングを実施すると、図 1に概略的なワークフローが示されています。まず、クローン形成とCCK8実験を通じて、さまざまな放射線量に対するA549細胞の感度を調査します(...
最先端の遺伝子編集技術であるCRISPRスクリーニングは、科学研究の分野に大きな変化をもたらしました5。CRISPR-Cas9システムから生まれたこの技術は、その高い効率性と精度9により、遺伝子機能の研究に不可欠なツールとなっています9。CRISPR/Cas9の工学原理は、Cas9ヌクレアーゼが標的DNA配列を正確に特定して切断するように誘導す?...
何一つ。
本研究は、湖北省地域科学技術イノベーションプロジェクト(2024EIA001)および武漢大学中南病院医学科学技術イノベーションプラットフォーム構築支援プロジェクト(PTXM2025001)の支援を受けて行われました。 図 1 は Figdraw を使用して作成されました。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
150 mm cell and tissue culture dish | Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd. | 715011 | Cell culture |
35 mm cell and tissue culture dish | Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd. | 706011 | Cell culture |
A549 cell line | ATCC | - | - |
Cell counting kit-8 | Shanghai Beyotime Biotech Inc | C0041 | For cell viability assay |
CO2-independent medium | PHCbi | MCO-50AIC | Cell culture |
Countess 3 FL automated cell counter | Themo Scientific | AMQAF2001 | For cell counting |
EDTA | Gibco | 25200056 | Cell culture |
Fetal bovine serum | Gibco | 10099141 | Cell culture |
Fluorescence microscopy | LEICA | ebq 100-04 | For fluorescence microscope |
Genome-wide CRISPR lentiviral library | Shanghai OBiO Technology Co., Ltd. | H5070 | For lentiviral infection |
MiniAmp plus PCR | Themo Scientific | C37835 | For PCR amplification |
NEST cell culture plates, 12-well | Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd. | 712002 | Cell culture |
NEST cell culture plates, 6-well | Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd. | 703002 | Cell culture |
NEST cell culture plates, 96-well | Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd. | 701001 | Cell culture |
PBS | Gibco | C10010500BT | Cell culture |
PCR forward primer (AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG) | Beijing AuGCT Biotech Co., Ltd. | - | For PCR amplification |
PCR reverse primer (GATGTGCGCTCTGCCCACTGACGGGCA) | Beijing AuGCT Biotech Co., Ltd. | - | For PCR amplification |
Polybrene | Shanghai Beyotime Biotech Inc | C0351 | For lentiviral infection |
Puromycin | MCE | HY-K1057 | For seletion post lentiviral infection |
RPMI 1640 cell culture medium | Gibco | 23400-021 | Cell culture |
TIANGENamp genomic DNA kit | Beijing TIANGEN Biotech Co.,Ltd. | DP304 | For genomic DNA extraction |
X-ray powder diffractometer | PerkinElmer | For radiotherapy |
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