Genomweiter CRISPR-Screen zur Entschlüsselung strahlenempfindlicher und strahlenresistenter Gene

Zusammenfassung

Es wird ein akribischer und strukturierter Ansatz verfolgt, um resistente und empfindliche Strahlengene durch die Anwendung einer genomweiten CRISPR/Cas9-Screening-Methode auszuwählen. Dieses Protokoll hat auch das Potenzial, als vielseitiger Rahmen für andere Forschungsvorhaben zu dienen, die die Mechanismen der Resistenz gegen klinisch verabreichte chemische Arzneimittel untersuchen.

Zusammenfassung

Das CRISPR-Cas9-System wurde nutzbar gemacht und zu einem leistungsstarken Genom-Editing-Tool umfunktioniert. Durch den Einsatz dieser Technologie können Forscher DNA-Sequenzen in lebenden Zellen präzise ausschneiden, einfügen und sogar umschreiben. Dennoch geht die Anwendung der CRISPR-Screen-Technologie weit über das reine Experimentieren hinaus. Es dient als zentrales Instrument im Kampf gegen genetische Krankheiten, indem es komplexe genetische Landschaften systematisch seziert, Forscher in die Lage versetzt, die molekularen Mechanismen zu entschlüsseln, die biologischen Phänomenen zugrunde liegen, und Wissenschaftler in die Lage versetzt, die Ursachen von Krankheiten wie Krebs, Mukoviszidose und Sichelzellenanämie zu identifizieren und zu bekämpfen. Vor allem aber stellt Krebs eine gewaltige Herausforderung für die Medizin dar und spornt die Bemühungen um die Ausrottung an. Die Strahlentherapie als traditionelle Behandlung führt zu Ergebnissen, hat aber Grenzen. Es rottet Krebszellen aus, schädigt aber auch gesundes Gewebe und verursacht Nebenwirkungen, die die Lebensqualität beeinträchtigen. Darüber hinaus sprechen nicht alle Krebszellen auf eine Strahlentherapie an, und einige können Resistenzen entwickeln, die den Zustand verschlimmern. Um dies zu adressieren, wird eine umfassende CRISPR-Screen-Technologie für das gesamte Genom eingeführt, die die effiziente Identifizierung von strahlenempfindlichen und strahlenresistenten Genen ermöglicht und damit das Feld der Krebsforschung und -behandlung voranbringt. Ein genomweites CRISPR-Screening wurde in Lungenadenokarzinomzellen durchgeführt, die nach dem beschriebenen Protokoll bestrahlt wurden, wobei sowohl Strahlenresistenz- als auch Strahlenempfindlichkeits-assoziierte Gene identifiziert wurden.

Einleitung

Die Erforschung biologischer Phänomene ist untrennbar mit der Erforschung zellulärer Verhaltensweisen verflochten, und die Untersuchung zellulärer Verhaltensweisen ist wiederum grundlegend mit der Erforschung ihres Genoms verbunden. Mit der Weiterentwicklung der modernen Technologie richten medizinische Forscher ihre Aufmerksamkeit zunehmend auf die Veränderung zellulärer Verhaltensweisen durch Gen-Editierung aus, um die Behandlungsergebnisse verschiedener Krankheiten zu verbessern. In dieser Hinsicht hat sich die CRISPR-Technologie (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) aufgrund ihrer relativ einfachen Anwendung als revolutionäres Werkzeug für die Genom-Editierung erwiesen¹. Das CRISPR-Cas9-System besteht aus Cas9-Nuklease und Single-Guide-RNA (sgRNA), die spezifisch die Ziel-DNA-Sequenz erkennt und an sie bindet, wodurch die Cas9-Nuklease an dieser Stelle geschnitten wird, was zu einem Doppelstrangbruch (DSB) in der Genom-DNA^{führt 2,3,4}. Darüber hinaus kann die Einführung anderer Substanzen zu spezifischen Insertionen, Deletionen oder Mutationen im Genom führen, die eine gezielte Gen-Editierung ermöglichen.

In der funktionellen Genomforschung war das RNA-Interferenz-Screening (RNAi) einst eine weit verbreitete Methode zur Durchführung groß angelegter Funktionsverlust-Experimente, um die Rolle von Genen bei Krebs zu untersuchen. Die RNAi-Technologie untersucht die Funktion von Genen, indem sie Zielgene spezifisch stummschaltet und den Forschern hilft, kritische onkogene Faktoren zu identifizieren. Sie ist jedoch durch Off-Target-Effekte und eine unvollständige Gen-Knockdown-Effizienz begrenzt. Off-Target-Effekte können zur Stilllegung anderer Nicht-Zielgene führen, wodurch die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Versuchsergebnisse beeinträchtigt^{wird 1,2}. Darüber hinaus weist RNAi für bestimmte Gene eine geringe Knockdown-Effizienz auf, so dass die Expression des Zielgens möglicherweise nicht vollständig unterdrückt werden kann. Im Gegensatz zu herkömmlichen RNAi-Screenings weist der CRISPR-Screen eine höhere Spezifität und Effizienz^{auf 3}. Diese Technologie ermöglicht nicht nur die präzise Editierung spezifischer Gene, sondern auch ein genomweites groß angelegtes Screening, was die Erforschung der Genfunktion robust unterstützt. Die CRISPR-Screen-Technologie, ein leistungsfähiges Gen-Editing-Tool, das auf dem CRISPR-Cas9-System basiert, wird für das effiziente Screening und die Aufdeckung unbekannter Funktionen bestimmter Gene in Zellen eingesetzt 5,6,7,8. Die Forscher entwerfen sgRNAs in Chargen für bestimmte Gene oder Genregionen und bereiten entsprechende sgRNA-Bibliotheken mit Präzision und Genauigkeit vor, um ihre Integrität und Funktionalität sicherzustellen⁹. Diese sgRNA-Bibliotheken werden dann in lentivirale Partikel eingekapselt, die zur effizienten Infektion von Wirtszellen verwendet werden. Nach erfolgreicher Infektion werden die infizierten Zellen unter persönlich definierten Screening-Bedingungen kultiviert. Beim Screening wird die genomische DNA der gescreenten Zellen extrahiert, wobei hohe Reinheits- und Mengenstandards eingehalten werden. Anschließend werden Zielregionen, die für sgRNA von Interesse sind, einer PCR-Amplifikation unterzogen, einem Prozess, der die gewünschten Segmente von Nukleinsäuren genau repliziert ^3,9. Schließlich wird eine Hochdurchsatz-Sequenzierung an den amplifizierten DNA-Fragmenten durchgeführt, die eine umfassende und effiziente Analyse der Zielregionen ermöglicht und somit wertvolle Einblicke in die Funktion und das Verhalten der zu untersuchenden Gene liefert⁴.

Krebs stellt als komplexe Krankheit eine große Bedrohung für die menschliche Gesundheit dar. Weltweit arbeiten Forscher und Kliniker gemeinsam daran, die molekularen Mechanismen der Krebsentstehung zu entschlüsseln und neue therapeutische Strategien zu entwickeln. Es wurden internationale Kooperationen aufgebaut, um die Translation von Erkenntnissen aus der Grundlagenforschung in die klinische Anwendung zu beschleunigen, mit dem Ziel, die Ergebnisse für die Patienten zu verbessern. Sasmal et al. schlugen eine bioorthogonale Assemblierungsstrategie vor, die auf einem synthetischen Wirt-Gast-System für die präzise Ausrichtung auf metastasierende Krebszellen basiert und Dutzenden von Wissenschaftlern bei der Weiterentwicklung medizinischer Technologien erheblich geholfen hat. Ihre herausragende Forschungsarbeit zeichnet sich durch hohe Innovationskraft und einzigartige Erkenntnisse aus und leistet einen bedeutenden Beitrag zur wissenschaftlichen Gemeinschaft¹⁰. Krebs ist gekennzeichnet durch den turbulenten Zustand genomischer Instabilität, der sich aus der unregelmäßigen Regulation der ^{DNA-Schadensantworten ergibt 11-14}. Zu den DNA-Schäden gehören Einzelnukleotiddefekte, Einzelstrangbrüche und DSBs. Homologe Rekombination (HR) und nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) sind an der Reparatur von DSBs in verschiedenen Stadien beteiligt^15,16,17. Auf dieser Grundlage hat sich die Strahlentherapie als praktikable Behandlungsoption herausgestellt, bei der hochenergetische Strahlen (wie Röntgenstrahlen und γ-Strahlen) zur Bestrahlung des Tumorgewebes verwendet werden, wodurch DNA-Schäden in Tumorzellen verursacht werden, wodurch deren Wachstum und Proliferation gestört^{werden 18}. Die Strahlentherapie führt jedoch bei einem signifikanten Teil der Krebspatienten nicht immer zu den gewünschten Effekten, was möglicherweise auf Schädigungen des parakanzerösen Gewebes und Einschränkungen zurückzuführen ist, die durch die inhärenten Eigenschaften des Tumors auferlegt werden, wie z. B. eine geringe Empfindlichkeit gegenüber der Strahlentherapie 19,20,21.

Theoretisch kann jeder Zelltyp für ein CRISPR-Screening verwendet werden. Um jedoch eine ausreichende Repräsentation in mutierten Populationen aufrechtzuerhalten, ist eine große Anzahl von Startzellen erforderlich. Zelltypen mit geringer Abundanz sind nicht besonders geeignet für ein genomweites Screening. Was die Wahl der Bibliothek betrifft, so enthalten die meisten Bibliotheken 3-6 gRNAs pro Zielgen, und die Aufrechterhaltung der Verteilung jeder gRNA innerhalb der Population ist entscheidend¹⁸. Ein Verlust der Repräsentation aufgrund von Anreicherung oder Depletion spezifischer gRNAs kann zu einer ungleichmäßigen Ergebnisverteilung führen. Um dieses Problem anzugehen, kann die Entscheidung für kommerziell erhältliche CRISPR-Bibliotheken, die auf dem Markt getestet wurden, eine bevorzugte Wahl^{sein 20}. In vitro Das CRISPR-Screening mit homogenen Krebszelllinien kann die genetische und epigenetische Heterogenität von in vivo-Tumoren möglicherweise nicht vollständig erfassen. Während das In-vitro-Screening Schlüsselgene aufdeckte, die an der Reparatur von DNA-Schäden und der strahleninduzierten autokrinen Signalgebung beteiligt sind, replizierte es die Mikroumgebung des Tumors nicht vollständig, einschließlich Hypoxie-induzierter Strahlenresistenz (über ROS, metabolische Anpassung und Autophagie), immunvermittelte parakrine Effekte und EZM-abhängige Zytokinmodulation. Bevor der CRISPR-Screen zur Erforschung von Genen eingesetzt wird, die mit Strahlenempfindlichkeit oder -resistenz verbunden sind, müssen diese Faktoren sorgfältig abgewogen werden. Angesichts der aktuellen Behandlungslandschaft ist es dringend erforderlich, Faktoren im Zusammenhang mit Strahlenresistenz und Strahlenempfindlichkeit zu identifizieren und eingehend zu untersuchen, um die Wirksamkeit der Strahlentherapie wirksam zu verbessern²². Angesichts des entscheidenden Vorteils des CRISPR-Screenings bei der Untersuchung der Funktionen unbekannter Gene wird eine systematisch detaillierte CRISPR-Screen-Technologie für das gesamte Genom bereitgestellt, um strahlenempfindliche und strahlenresistente Gene effizient zu identifizieren.

Protokoll

Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Auswahl einer geeigneten Strahlendosis

1. Präparation und Plattierung von adhärenten Zellen
   1. Stellen Sie die Zelldichte auf 5 x 10⁵ Zellen pro ml mit RPMI 1640 vollständigem Zellkulturmedium mit 10 % FBS für die Passage und das Zellwachstum ein. Verteilen Sie die Zellen auf 3,5 cm große Kulturschalen für die Bestrahlung in unterschiedlichen Dosen. 2 ml (1 x 10⁶ Zellen) in jede Schale geben und über Nacht bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubieren.
2. Anwendung unterschiedlicher Strahlendosen
   1. Nummerieren Sie die 3,5 cm großen Kulturschalen von 1 bis 5. Verwenden Sie Gruppe #1 als Kontrollgruppe, wobei die restlichen 4 Gruppen als Behandlungsgruppen bezeichnet werden.
   2. Versiegeln Sie die Ränder der 6-Well-Platten mit einer Dichtungsmembran für Behandlungsgruppen und verabreichen Sie Strahlendosen von 2, 4, 6 bzw. 8 Gy. Stellen Sie die Schalen nach der Behandlung wieder in den Inkubator.
3. Plattierung von Zelllinien nach der Bestrahlung
   1. Bereiten Sie 6-Well- und 96-Well-Platten vor. Waschen Sie die Zellen in den 3,5-cm-Kulturschalen einmal mit PBS, verdauen Sie die logarithmisch wachsenden Zellen mit 0,25 % Trypsin und stellen Sie die Zelldichte auf 1 x 10⁵ Zellen pro ml mit RPMI 1640 Komplettmedium mit 10 % FBS ein.
   2. 10 μl/Well (1.000 Zellen/100 μl) mit 3 Replikaten pro Strahlendosis in die 6-Well-Platten einfüllen. Geben Sie 2 ml vollständiges Medium in jede Vertiefung und zählen Sie nach 14 Tagen (wenn jede Klongruppe etwa 50 Zellen umfasst).
   3. 30 μl/Well (3.000 Zellen/100 μl) mit 5 Replikaten pro Strahlendosis in die 96-Well-Platten einfüllen. Geben Sie 70 μl vollständiges Medium in jede Vertiefung und messen Sie die Zellviabilität nach 72 Stunden.
4. Messung der Zellviabilität
   HINWEIS: Klonogene Hemmrate = 1 - (Anzahl der Klone in der Behandlungsgruppe/Anzahl der Klone in der Kontrollgruppe) x 100%. Der CCK-8-Assay verwendet ein wasserlösliches Tetrazoliumsalz (WST-8), das durch zelluläre Dehydrogenasen reduziert werden kann, um ein hochgradig wasserlösliches gelbes Formazanprodukt^{zu erzeugen 11}. Die Menge an produziertem Formazan ist direkt proportional zur Anzahl lebensfähiger Zellen, und seine optische Dichte (gemessen bei einer Wellenlänge von 450 nm) spiegelt die zelluläre Stoffwechselaktivität und den proliferativen Status genau wider^11,13. Basierend auf diesem etablierten Prinzip wurde der CCK-8-Assay für verschiedene Anwendungen eingesetzt, darunter Zellproliferationsassays und Sensitivitätstests für Tumormedikamente. In diesem Protokoll wird der CCK-8-Assay eingesetzt, um die zelluläre Lebensfähigkeit unter verschiedenen Strahlendosen systematisch zu bewerten.
   1. Mischen Sie das CCK8-Reagenz mit dem RPMI 1640 Medium ohne FBS im Verhältnis 1:9. Verwerfen Sie das Medium in den 96-Well-Platten und geben Sie 100 μl des CCK8-haltigen Mediums in jede Vertiefung.
   2. Inkubieren Sie 1 h im Dunkeln und messen Sie den OD-Wert bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader.
      HINWEIS: Zellüberlebensrate = [(OD-Wert der Behandlungsgruppe - OD-Wert des Blind-Wells) / (OD-Wert der Kontrollgruppe - OD-Wert des Blank-Wells)] x 100%
5. Auswahl der Strahlendosis
   1. Integrieren Sie die klonogene Hemmrate in die Überlebensrate der Zellen, um eine geeignete Strahlendosis basierend auf den Forschungsbedürfnissen auszuwählen. Wählen Sie eine Strahlendosis mit einer Hemmrate von 50 % für das Screening sowohl strahlenresistenter als auch strahlenempfindlicher Gene.

2. Auswahl des geeigneten MOI und der Puromycin-Konzentration

1. Plattierung von adhärenten Zellen
   1. Stellen Sie die Zelldichte auf 3 x 10⁵ Zellen pro ml ein und inokulieren Sie 1 ml (3 x 10⁵ Zellen) pro Vertiefung in eine 12-Well-Platte. Die Platte über Nacht bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubieren.
2. Lentivirale Infektion
   1. Verwenden Sie eine Pipette, um das Medium aus der 12-Well-Platte zu aspirieren, und ersetzen Sie es durch 1 ml RPMI 1640 vollständiges Medium mit 10 % FBS. Bereiten Sie eine qualitätsgeprüfte CRISPR-Lentivirusbibliothek für das gesamte Genom vor (kommerziell erhältliche Bibliotheken werden empfohlen) und richten Sie einen logarithmischen Konzentrationsgradienten ein (z. B. 0-10-50-100-200-400-800)4,5,6,7,8.
   2. Die entsprechende Menge Lentivirus auf 2 μl/Schale Polybren geben und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur äquilibrieren. Die Mischung aus Lentivirus und Polybren langsam in jede Vertiefung tropfen, gut mischen und über Nacht bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubieren.
3. Bestimmung der minimalen Puromycinkonzentration für die Zellabtötung
   1. Stellen Sie die Dichte der elterlichen Zellen auf 3 x 10⁵ Zellen/ml ein und inokulieren Sie 1 ml (3 x 10⁵ Zellen) pro Well in eine 12-Well-Platte. Die Platte über Nacht bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubieren.
   2. Geben Sie Puromycin in jede Vertiefung der 12-Well-Platte in einem Konzentrationsgradienten von 0-0,1-0,2-0,5-1-2-4-8 μM. Zählen Sie die Zellen nach 72 h. Die minimale Konzentration, die alle Zellen in der Vertiefung abtötet, ist die minimale Puromycin-Konzentration für die Zellabtötung, die für das anschließende Screening von viral infizierten Zellen verwendet wird.
4. Puromycin-Selektion nach der Infektion
   1. Am zweiten Tag nach der Infektion aspirieren Sie das Medium aus jeder Vertiefung und ersetzen Sie es durch 1 ml RPMI 1640 vollständiges Medium mit 10 % FBS. Kultivieren Sie 48 Stunden lang.
   2. Nach 72 Stunden der Infektion ist das vorhandene Medium durch ein vollständiges Medium zu ersetzen, das die Mindestkonzentration von Puromycin für die Zellabtötung enthält. Richten Sie 2 Wells in der 12-Well-Platte ohne lentivirale Infektion als Negativ- und Positivkontrollen ein. Behandeln Sie die Negativkontrolle mit Puromycin und lassen Sie die Positivkontrolle unbehandelt. Kultivieren Sie 72 Stunden lang.
   3. Nach 72 Stunden Puromycin-Selektion sind alle Elternzellen in der Negativkontrolle tot, während die Elternzellen in der Positivkontrolle nur minimalen Tod zeigen. Berechnen Sie das Trägheitsmoment für jede Vertiefung.
      HINWEIS: MOI = (Anzahl der Zellen in der virusinfizierten Gruppe / Anzahl der Zellen in der positiven Kontrollgruppe) x 100 %. Verwenden Sie die Viruskonzentration mit einem MOI von ~0,3 für das anschließende Screening.

3. Genomweite Infektion der lentiviralen CRISPR-Bibliothek

1. Aussaat von adhärenten Zelllinien
   1. Stellen Sie die Zelldichte auf 1 x 10⁷ Zellen pro ml in RPMI 1640 Komplettmedium mit 10 % FBS für die Passage und das Zellwachstum ein. 1 ml Zellen (1 x 10⁷ Zellen) in jede 15-cm-Kulturschale bei 37 °C 8 h lang mit 5 % CO₂ inokulieren. Sobald die Zellen anhafteten und eine Konfluenz von 70%-80% erreichten, waren sie bereit für eine Virusinfektion (was eine Kopienzahl von etwa 500 ergibt).
2. Lentivirale Infektion
   1. Aspirieren Sie das Medium aus den 15-cm-Kulturschalen und ersetzen Sie es durch 15 ml RPMI 1640 vollständiges Medium mit 10 % FBS. Bereiten Sie eine qualitätsgeprüfte CRISPR-Lentivirusbibliothek des gesamten Genoms vor.
   2. Die entsprechende Menge Lentivirus mit dem MOI = 0,3 bis 30 μl/Schale Polybren zugeben und 5 min bei Raumtemperatur äquilibrieren, die Mischung aus Lentivirus und Polybren langsam in die 15-cm-Kulturschalen tropfen, gut mischen und bei 37 °C mit 5 % CO₂ über Nacht inkubieren. Bereiten Sie gleichzeitig eine 15 cm große Kulturschale mit der Elternzelle als Kontrast vor.
3. Puromycin-Selektion nach der Infektion
   1. Am zweiten Tag nach der Virusinfektion ist das Medium aus den 15-cm-Kulturschalen zu aspirieren und durch 15 ml RPMI 1640 vollständiges Medium mit 10 % FBS zu ersetzen. Kultivieren Sie 48 Stunden lang.
   2. 72 h nach der Infektion ist das Medium durch ein vollständiges Medium zu ersetzen, das die minimale letale Konzentration von Puromycin enthält. Behandeln Sie die nicht infizierten Elternzellen auf die gleiche Weise als Negativkontrolle und kultivieren Sie 72 Stunden lang. Nach 72 Stunden Puromycin-Selektion werden alle Elternzellen in der negativen Kontrollgruppe abgetötet, und die überlebenden Zellen der lentiviralen Infektion gelten als erfolgreich infiziert.
4. Extraktion des Genoms von Tag 0
   1. Die Zellen aus einer 15-cm-Kulturschale werden mit 0,25 % Trypsin verdaut, in RPMI 1640 Komplettmedium mit 10 % FBS resuspendiert und die Zellzahl gezählt. Beschriften Sie dieses Beispiel als Tag 0.
   2. Bei 300 x g für 5 min (bei Raumtemperatur) zentrifugieren und den Überstand verwerfen. In 1 ml PBS resuspendieren, 5 min bei 300 x g zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Extrahieren Sie die genomische DNA von Tag 0, messen Sie die DNA-Konzentration und -Reinheit mit einem Nanotropfen-UV-Spektralphotometer.
   3. Für den Nachweis der sgRNA-Integrität wird die Agarose-Gelelektrophorese verwendet, um die amplifizierte sgRNA-Bibliothek zu analysieren, wobei sichergestellt wird, dass die Banden klar und ohne signifikante Degradation sind, wodurch die Integrität der Bibliothek^{erhalten bleibt 23}. Für die Bewertung der Abdeckung lentiviraler Bibliotheken ist die Deep-Sequencing-Technologie zu verwenden, um eine Sequenzierungsanalyse an den sgRNAs innerhalb der Bibliothek^{durchzuführen 24,25}.
   4. Im CRISPR-Screen dient die PCR-Amplifikation als vorläufige Überprüfung der Integrität des sgRNA-Fragments und der Bibliotheksqualität⁶. Um die Bibliotheksabdeckung und die sgRNA-Verteilungsmuster umfassender zu analysieren und eine angemessene Repräsentation von sgRNAs für jedes Zielgen während des Screenings sicherzustellen, führen Sie NGS durch, um detaillierte Einblicke in die Robustheit von Screen⁹ zu erhalten.
      HINWEIS: Durch die Erkennung von Veränderungen in der sgRNA-Abundanz vor und nach dem Screening und die Identifizierung einer potenziellen sgRNA-Off-Target-Integration oder Bibliothekskontamination könnte die Genauigkeit und Zuverlässigkeit des CRISPR-Screenings weiter verbessert werden. Diese Tag-0-Proben dienen als wichtige Negativkontrollen und werden einer umfassenden Qualitätsbewertung durch PCR-Amplifikation und NGS unterzogen, um 2 Hauptziele zu erreichen: (1) Bestätigung der Depletion essentieller Gene (was auf eine angemessene Bibliotheksrepräsentation hinweist) und (2) Nachweis einer stabilen Expression in nicht-essentiellen Genen (Etablierung experimenteller Ausgangsbedingungen)⁹.
   5. Stellen Sie sicher, dass die Abdeckung das erwartete Niveau erreicht, um die Vielfalt und Repräsentativität der Bibliothek zu gewährleisten und Verzerrungen im Screening-Prozess zu vermeiden. Verwenden Sie für die Messung der Infektionseffizienz die Fluoreszenzbildgebung, um die Infektionseffizienz zu beurteilen und sicherzustellen, dass sie den Anforderungen des Experiments entspricht.

4. Anwendung von Strahlung als Screening-Bedingung

1. Gruppierung
   1. Stellen Sie die Dichte der CRISPR-infizierten Zellen auf 1 x 10⁷ Zellen pro ml ein und inokulieren Sie 1 ml in jede 15-cm-Petrischale. Über Nacht bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubieren.
2. Strahlenbehandlung
   1. Teilen Sie die Zellen nach dem Zufallsprinzip in 2 Gruppen ein: eine Behandlungsgruppe und eine Kontrollgruppe mit 6 Gerichten pro Gruppe. Verabreichen Sie den Zellen in der Behandlungsgruppe eine angemessene Strahlendosis, während die Zellen der Kontrollgruppe unbehandelt bleiben, um sich normal zu vermehren. Nach der Bestrahlung bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 7 Tage weiter inkubieren.
   2. In der zweiten Woche wiederholen Sie die Verabreichung einer angemessenen Strahlendosis an die Zellen der Behandlungsgruppe, wobei die Zellen der Kontrollgruppe unbehandelt bleiben und sich normal vermehren können. Nach der Strahlentherapie die Inkubation bei 37 °C mit 5 % CO₂ für weitere 7 Tage fortsetzen.

5. Genomextraktion und -sequenzierung

1. Extraktion von Tag 14
   1. Nach 14-tägiger Behandlung verdauen Sie die Zellen in der Behandlungs- und Kontrollgruppe mit 0,25 % Trypsin, resuspendieren Sie sie mit vollständigem RPMI 1640-Medium mit 10 % FBS und markieren Sie sie als Tag 14-RT oder Tag 14-NC.
   2. Die Zellen werden bei 300 x g für 5 min zentrifugiert und der Überstand verworfen. In 1 mL PBS resuspendieren, 5 min bei 300 x g zentrifugieren und den Überstand wieder verwerfen. Extrahieren Sie die genomische DNA von Tag 14 und bestimmen Sie die Konzentration und Reinheit der DNA mithilfe der Nanotropfen-UV-Absorptionsspektroskopie.
2. PCR-Amplifikation
   1. Bereiten Sie die entsprechenden Primer der Sequenz vor (siehe Materialtabelle) und verdünnen Sie sie auf 10 μM. Richten Sie ein 20 μL-Reaktionssystem ein, indem Sie die Reagenzien in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen geben, zentrifugieren Sie 5 s lang bei 300 x g und mischen Sie es gut. Stellen Sie die Parameter des PCR-Geräts entsprechend der Amplifikationsbedingung ein, um PCR-Produkte zu erhalten.
3. Nachweis der Agarose-Gelelektrophorese
   1. Bereiten Sie eine Gelgussplatte vor, versiegeln Sie die Ränder der Form mit Agarose, führen Sie den Kamm ein und bereiten Sie ein Agarosegel in geeigneter Konzentration entsprechend der Länge der Proben-DNA vor.
   2. Wiegen Sie eine bestimmte Menge Agarosepulver genau ab, fügen Sie eine angemessene Menge Elektrophoresepuffer hinzu, mischen Sie es gut und erhitzen Sie es in der Mikrowelle, um es zu schmelzen. Nach dem Abkühlen eine angemessene Menge Nukleinsäurefarbstoff hinzufügen, vorsichtig mischen und langsam in die Gelgussform gießen. Lassen Sie das Gel 30 Minuten lang fest werden.
   3. Entfernen Sie den Kamm und geben Sie eine angemessene Menge Elektrophoresepuffer in den Elektrophoresetank, bis er das Gel bedeckt. Geben Sie eine angemessene Menge Ladepuffer in die DNA-Probe, mischen Sie sie gut und geben Sie die Mischung mit einer Pipette langsam in die Probenvertiefung.
   4. Stellen Sie die geeignete Spannung basierend auf der Größe des DNA-Fragments und der Konzentration des Agarosegels ein. Entfernen Sie das Gel nach der Elektrophorese vorsichtig und legen Sie es in einen Gel-Imager, um die Ergebnisse zu beobachten und zu überprüfen, ob die PCR-Amplifikation erfolgreich war.
4. Illumina-Sequenzierung
   1. Sammeln Sie die genomische DNA aus den drei Gruppen (Tag-0-Gruppe, Kontrollgruppe und Behandlungsgruppe) und senden Sie sie an ein Unternehmen für den Bibliotheksaufbau und die Illumina-Sequenzierung. Durchführung einer bioinformatischen Analyse und Visualisierung der Sequenzierungsergebnisse, um strahlentherapieempfindliche und strahlentherapieresistente Gene zu erhalten²⁶.
   2. Richten Sie mehrere wiederholte Experimente für die Datenanalyse ein und führen Sie statistische Analysen der Versuchsergebnisse durch, um die Konsistenz und Reproduzierbarkeit der Daten sicherzustellen^27,28.
5. Qualitätsbewertung von Sequenzierungsdaten
   1. Unterziehen Sie die Rohdaten strengen Filter- und Qualitätskontrollmechanismen, um die Präzision der Sequenzierungsinformationen zu gewährleisten⁵. Berechnen Sie den Phred-Score (Qphred) für jedes Nukleotid basierend auf der Sequenzierungsfehlerrate unter Verwendung eines angegebenen Konvertierungsalgorithmus und eines Modells, das die Wahrscheinlichkeit eines Fehlers beim Aufrufen der Base^{bewertet 28}.
   2. Halten Sie die Sequenzierungsfehlerrate für jede Basisposition unter 1 % (entspricht einem Q30-Schwellenwert) und stellen Sie sicher, dass mindestens 80 % der Sequenzierungsdaten diesen Q30-Standard erreichen, um nachfolgende Analyseverfahren zu unterstützen.
6. Datenverarbeitung und Qualitätskontrolle auf Probenebene
   HINWEIS: Für Details verweisen wir auf die zuvor veröffentlichten Berichte ^29,30.
   1. Richten Sie die gefilterten Reads aus Sequenzierungsdaten mit den Sequenzen der sgRNA-Bibliothek ab. Melden Sie Statistiken, einschließlich der Anzahl der sgRNAs in der Bibliothek mit perfekter Ausrichtung, der durchschnittlichen Häufigkeit von sgRNAs, der Anzahl der nicht nachgewiesenen sgRNAs und des Anteils der Lesevorgänge aus einzelnen Proben, die erfolgreich der sgRNA-Bibliothek zugeordnet wurden. Verwenden Sie ein höheres Zuordnungsverhältnis, um eine größere Abdeckung anzuzeigen.
   2. Zählen Sie die Anreicherung von Reads für jedes Gen (auf das verschiedene sgRNAs abzielen) in jeder Probe. Normalisieren Sie die unterstützenden Reads für jede sgRNA über Proben hinweg mit der "medianen" Normalisierungsmethode von MAGeCK. Führen Sie eine Qualitätskontrolle auf Stichprobenebene durch, indem Sie die Verteilung der sgRNA-Lesezahlen auswerten, Boxplots erstellen, Hauptkomponentenanalysen (PCA) durchführen und Korrelations-Heatmaps erstellen.
   3. Nehmen wir an, dass die Anzahl der sgRNA-Lesevorgänge einer Poisson-Verteilung folgt. Stellen Sie normalisierte sgRNA-Zahlen aus verschiedenen Gruppen in Boxplots dar, um die Gesamtdatenverteilung innerhalb der Proben zu visualisieren und die Verteilungen zwischen den Gruppen zu vergleichen.
   4. Verwenden Sie PCA, um die Datenanalyse zu vereinfachen, indem Sie Unterschiede zwischen den Hauptkomponenten und die Variationsrate innerhalb jeder Komponente widerspiegeln und so die Beobachtung von Variationen innerhalb und zwischen Gruppen erleichtern. Verwenden Sie eine Korrelations-Heatmap, um die Beziehungen zwischen den Stichproben zu veranschaulichen.
7. Grundlegende Analyse
   1. Führen Sie differentielle sgRNA-Analysen zwischen Gruppen durch und identifizieren Sie essentielle Gene nach Qualitätskontrolle und vorläufiger Datenverarbeitung. Durchführung einer funktionellen Anreicherungsanalyse der relevanten Gene³⁰. Ordnen Sie essentielle Gene basierend auf dem RRA-Wert (Robust Rank Aggregation) ein, der von MAGeCK oder anderen statistischen Methoden wie MLE berechnet wird, wobei ein niedrigerer RRA-Wert auf eine höhere Wichtigkeit hinweist.
   2. Verwenden Sie die Sprache R oder andere Programmiersprachen, um eine bioinformatische Analyse der eingestuften Ergebnisse durchzuführen, und visualisieren Sie die Ergebnisse mithilfe von GO- und KEGG-Analysediagrammen³⁰. Verknüpfen Sie Gene oder Proteine mit entsprechenden GO-Begriffen (molekulare Funktion, biologischer Prozess und zelluläre Komponente) durch ID-Mapping oder Sequenzannotation.
   3. Verwenden Sie KEGG als Datenbank, um High-Level-Funktionen und biologische Systeme zu verstehen und den identifizierten Genkatalog mit Systemfunktionen auf Zell-, Spezies- und Ökosystemebene zu verbinden. Wählen Sie die 10 oder 20 wichtigsten Pfade aus GO- und KEGG-Analysen aus, um eine intuitive Anzeige der Pfadrichtungen zu erhalten.

Ergebnisse

Lungenkrebs mit der führenden Sterblichkeitsrate stellt eine sehr aggressive und weit verbreitete medizinische Erkrankung dar. Am Beispiel der Lungenkrebszelllinie A549 für die Durchführung eines genomweiten CRISPR-Screenings mit Strahlung als Screening-Bedingung ist der schematische Arbeitsablauf in Abbildung 1 dargestellt. Zunächst soll die Empfindlichkeit von A549-Zellen gegenüber unterschiedlichen Strahlendosen durch Klonbildung und CCK8-Experimente...

Diskussion

Als hochmoderne Technologie zur Gen-Editierung hat der CRISPR-Bildschirm tiefgreifende Veränderungen im Bereich der wissenschaftlichen Forschung ausgelöst⁵. Diese Technologie, die aus dem CRISPR-Cas9-System hervorgegangen ist, hat sich aufgrund ihrer hohen Effizienz und Präzision zu einem unverzichtbaren Werkzeug für die Untersuchung von Genfunktionen^{entwickelt 9}. Das CRISPR/Cas9-Engineering-Prinzip umfasst das Design und die Einführun...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
150 mm cell and tissue culture dish	Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.	715011	Cell culture
35 mm cell and tissue culture dish	Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.	706011	Cell culture
A549 cell line	ATCC	-	-
Cell counting kit-8	Shanghai Beyotime Biotech Inc	C0041	For cell viability assay
CO2-independent medium	PHCbi	MCO-50AIC	Cell culture
Countess 3 FL automated cell counter	Themo Scientific	AMQAF2001	For cell counting
EDTA	Gibco	25200056	Cell culture
Fetal bovine serum	Gibco	10099141	Cell culture
Fluorescence microscopy	LEICA	ebq 100-04	For fluorescence microscope
Genome-wide CRISPR lentiviral library	Shanghai OBiO Technology Co., Ltd.	H5070	For lentiviral infection
MiniAmp plus PCR	Themo Scientific	C37835	For PCR amplification
NEST cell culture plates, 12-well	Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.	712002	Cell culture
NEST cell culture plates, 6-well	Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.	703002	Cell culture
NEST cell culture plates, 96-well	Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.	701001	Cell culture
PBS	Gibco	C10010500BT	Cell culture
PCR forward primer (AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG)	Beijing AuGCT Biotech Co., Ltd.	-	For PCR amplification
PCR reverse primer (GATGTGCGCTCTGCCCACTGACGGGCA)	Beijing AuGCT Biotech Co., Ltd.	-	For PCR amplification
Polybrene	Shanghai Beyotime Biotech Inc	C0351	For lentiviral infection
Puromycin	MCE	HY-K1057	For seletion post lentiviral infection
RPMI 1640 cell culture medium	Gibco	23400-021	Cell culture
TIANGENamp genomic DNA kit	Beijing TIANGEN Biotech Co.,Ltd.	DP304	For genomic DNA extraction
X-ray powder diffractometer	PerkinElmer		For radiotherapy