تحقيقات متعددة النطاقات للمعالجة القشرية من خلال دمج البوليترودات الصفيحية وعلم البصريات مع القشرة الكهربائية الدقيقة في القوارض

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولين لتسجيل القشرة الكهربائية الدقيقة عالية الكثافة (μEcoG) في الفئران والفئران ، بما في ذلك طرق الجراحة والزرع والتسجيل. يتم إجراء تسجيلات μECoG بالاشتراك مع تسجيل polytrode الرقائقي في القشرة السمعية للفئران أو مع التلاعب البصري الوراثي للنشاط العصبي في القشرة الحسية الجسدية للفأر.

Abstract

الكورتيجورافيا الكهربية (ECoG) هو جسر منهجي بين علم الأعصاب الأساسي وفهم وظائف الدماغ البشري في الصحة والمرض. يسجل ECoG إشارات الفيزيولوجيا العصبية مباشرة من السطح القشري بدقة زمنية بالمللي ثانية ودقة مكانية عمودية على مناطق كبيرة من الأنسجة القشرية في وقت واحد ، مما يجعلها في وضع فريد لدراسة كل من الحسابات القشرية المحلية والموزعة. هنا ، نصف تصميم أجهزة micro-ECoG (μECoG) المخصصة وعالية الكثافة واستخدامها في إجراءين. تحتوي هذه الشبكات على 128 قطبا كهربائيا منخفض المقاومة مع تباعد 200 ميكرومتر ملفقة على ركيزة بوليمر شفافة مع ثقوب بين الأقطاب الكهربائية. تتيح هذه الميزات تسجيل μECoG المتزامن مع تسجيلات polytrode الصفيحية والتلاعب البصري الوراثي. أولا ، نقدم بروتوكولا لتسجيل μECoG فوق الجافية المشترك على القشرة الحسية الجسدية للفئران مع التلاعب البصري الوراثي لأنواع محددة من الخلايا القشرية المحددة وراثيا. يسمح هذا بالتشريح السببي للمساهمات المميزة لمجموعات الخلايا العصبية المختلفة في المعالجة الحسية مع مراقبة توقيعاتها المحددة في إشارات μECoG. ثانيا ، نقدم بروتوكولا للتجارب الحادة لتسجيل النشاط العصبي من القشرة السمعية للفئران باستخدام شبكات μECoG وpolytrodes الصفيحية. يسمح ذلك برسم خرائط طبوغرافية مفصلة للاستجابات العصبية الحسية عبر السطح القشري في وقت واحد مع تسجيلات من وحدات عصبية متعددة موزعة عبر العمق القشري. تتيح هذه البروتوكولات إجراء التجارب التي تميز النشاط القشري الموزع وقد تساهم في فهم الاضطرابات العصبية المتنوعة والتدخلات النهائية لها.

Introduction

يتم تنظيم وظائف الدماغ الكامنة وراء الإحساس والإدراك والعمل وتوزيعها عبر المقاييس المكانية والزمانية الواسعة ، بدءا من طفرات الخلايا العصبية المفردة إلى المجالات الكهربائية الناتجة عن مجموعات الخلايا العصبية في العمود القشري إلى التنظيم الطبوغرافي للأعمدة عبر مناطق الدماغ (على سبيل المثال ، الجسد في القشرة الحسية الجسدية ، توتر العين في القشرة السمعية الأولية). يتطلب فهم وظائف المخ استشعار الإشارات الكهربائية عبر هذه المقاييس المكانية¹. لدى علم الأعصاب حاليا العديد من الطرق المستخدمة على نطاق واسع لمراقبة نشاط الدماغ. من الناحية الفيزيولوجية الكهربية ، تتيح polytrodes الصفيحية (مثل Neuropixels) مراقبة عدد متواضع (~ 300) من الخلايا العصبية المفردة ، عادة داخل حفنة من الأعمدة المتباعدة ، بدقة زمنية عالية (≥1 كيلو هرتز). يتيح تصوير Ca^{2 +} مراقبة أعداد متواضعة إلى كبيرة من الخلايا العصبية المفردة المحددة وراثيا وتشريحيا ضمن نطاق مكاني ~ 1-2 مم بدقة زمنية أقل (~ 10 هرتز^{) 2}. يتيح الرنين المغناطيسي الوظيفي مراقبة الحالة الأيضية لأعداد كبيرة من الخلايا العصبية (~ 1 M الخلايا العصبية في حجم 36 مم³ ) عبر الدماغ بأكمله بدقة زمنية منخفضة جدا (~ 0.2 هرتز). يتيح مخطط كهربية الدماغ / MEG مراقبة النشاط الكهربائي من السطح القشري / الدماغ بالكامل بدقة زمنية متواضعة (<100 هرتز) ودقة مكانية منخفضة جدا (سنتيمترات)³. في حين أن كل من هذه المنهجيات قد قدمت رؤى أساسية وتآزرية في وظائف الدماغ ، فإن الطرق التي تتيح الاستشعار المباشر للإشارات الفيزيولوجية الكهربية بدقة زمنية عالية من مواقع تشريحية دقيقة عبر مناطق مكانية واسعة من القشرة هي ناشئة. يتم التأكيد على الحاجة إلى تغطية مكانية واسعة من خلال حقيقة أنه في الدماغ ، تتغير وظيفة الخلايا العصبية بشكل أكثر دراماتيكية عبر السطح مقارنة بالعمق⁴.

القشرة الكهربائية (ECoG) هي طريقة يتم فيها زرع شبكات من الأقطاب الكهربائية منخفضة المقاومة على سطح الدماغ وتسمح بتسجيل أو تحفيز القشرة^1،5. عادة ما يتم نشر ECoG في إعدادات جراحة الأعصاب البشرية كجزء من العمل السريري لعلاج الصرع المستعصي دوائيا. ومع ذلك ، فإنه يوفر أيضا رؤى فريدة حول المعالجة القشرية الموزعة في البشر ، مثل رسم الخرائط الطبوغرافية للكلام^{والحسية 6،7}. حفزت هذه القدرات استخدامها في النماذج الحيوانية ، بما في ذلك والجرذان والفئران^{5،8،9،10،11}. في القوارض ، ثبت مؤخرا أن micro-ECoG (μECoG) يتيح الدقة الزمنية العالية (~ 100 هرتز) المراقبة الكهربائية المباشرة لمجموعات الخلايا العصبية بدقة مكانية عمودية (~ 200 ميكرومتر) وتغطية مكانية واسعة (عدة ملليمترات). تمكن μECoG الباحثين من التحقيق في الديناميكيات العصبية الموزعة المرتبطة بالمعالجة الحسية المعقدة والوظائف المعرفية والسلوكيات الحركية في النماذج الحيوانية^12،13. أدت التطورات الحديثة إلى دمج μECoG مع البصريات الوراثية وتسجيلات polytrode الصفيحية^{14،15،16،17،18،19،20} ، مما يسمح بإجراء تحقيقات متعددة النطاقات للشبكات القشرية وسد الفجوة بين النشاط العصبي الدقيق والديناميكيات القشرية على نطاق كبير^21،22. بشكل حاسم ، نظرا لأن إشارة μECoG متشابهة جدا في النماذج البشرية والحيوانية غير البشرية ، فإن استخدام μECoG يجعل ترجمة النتائج والنتائج من النماذج الحيوانية إلى البشر أكثر مباشرة²³. على هذا النحو ، تعتبر الأساليب التكاملية ضرورية لتعزيز فهمنا للدوائر العصبية وتحمل وعدا بتطوير تدخلات علاجية جديدة للاضطرابات العصبية^5،24،25.

وبالتالي ، هناك حاجة ناشئة للبروتوكولات التي تدمج مصفوفات μECoG عالية الكثافة مع التسجيلات الصفيحية والأدوات البصرية الوراثية لتمكين التحقيقات الشاملة متعددة النطاقات للمعالجة القشرية^8،26. لمعالجة هذه الفجوة ، قمنا بتطوير أجهزة μECoG مصممة خصيصا تتميز ب 128 قطبا كهربائيا منخفض المقاومة بقطر قطب كهربائي يبلغ 40 ميكرومتر وتباعد بين الأقطاب الكهربائية 20 ميكرومتر على ركيزة بوليمر مرنة وشفافة (باريلين-سي وبوليميد) مع ثقوب بين الأقطاب الكهربائية ، مما يتيح تسجيلات μECoG ومتعددة الطبقات المتزامنة مع التلاعب البصري^{الوراثي 13،22}. تشمل الجوانب الرئيسية لهذا البروتوكول التجريبي ما يلي: (1) الدقة المكانية العمودية والتغطية واسعة النطاق للنشاط القشري من خلال مصفوفات μECoG عالية الكثافة. (2) القدرة على التسجيل من طبقات قشرية متعددة باستخدام polytrodes الصفيحية التي يتم إدخالها من خلال شبكة μECoG ؛ و (ثالثا) دمج تقنيات البصريات الوراثية لتنشيط أو تثبيط مجموعات عصبية معينة بشكل انتقائي ، وبالتالي تمكين التشريح السببي للدوائر العصبية^27،28،29. يسمح التكوين عالي الكثافة بتسجيلات عالية الدقة المكانية ، مما يوفر بشكل فعال "رؤية عمودية" للنشاط القشري ، حيث أظهرت الدراسات السابقة أن إشارات μECoG يمكن أن تحل النشاط على نطاق مكاني يمكن مقارنته بقطر العمود القشري للقوارض (~ 20 ميكرومتر)¹¹. تسمح هذه المنهجية المتكاملة بالمراقبة المتزامنة متعددة النطاقات ومعالجة النشاط العصبي ، مما قد يتيح التجارب السببية لتحديد المصادر العصبية لإشارات μECoG بالإضافة إلى المعالجة القشرية الموزعة. لتحقيق هذه الأهداف ، توفر هذه المخطوطة بروتوكولات مفصلة لاستخدام مصفوفات μECoG عالية الكثافة في مجموعتين.

أولا ، نصف μECoG جنبا إلى جنب مع التلاعب بالخلايا الهرمية من الطبقة 5 (L5) في القشرة الحسية الجسدية الأولية للفأر (S1). في الفأر ، يتم وضع مصفوفة μECoG على طول البشرة (بسبب المستعصية الجراحية لبضع التحمل في الفئران). يتم وضع الألياف الضوئية فوق الشبكة أو دمجها مع عدسة لتركيز الضوء البصري الوراثي على منطقة مستهدفة صغيرة من السطح القشري. تم وصف استراتيجية البصريات الوراثية هنا لتثبيط الخلايا العصبية المثيرة من الطبقة 5 ولكن يمكن تكييفها بسهولة مع أي مجموعة من الخلايا العصبية المزودة بخط الفأر المقابل الخاص بالسكان والتعبير عن Cre. ثانيا ، نصف الاستخدام المشترك ل μECoG مع polytrodes الصفيحية المصنوعة من السيليكون لتسجيل الإمكانات الكهربائية السطحية القشرية (CSEPs) في وقت واحد ونشاط ارتفاع وحدة واحدة من خلايا عصبية متعددة عبر الطبقات القشرية من القشرة السمعية للفئران (A1). تحتوي المصفوفة على ثقوب بين الأقطاب الكهربائية ، مما يتيح إدخال polytrodes الصفيحية متعددة القنوات عبر الشبكة لتسجيل النشاط العصبي عبر طبقات قشرية مختلفة. أثناء إجراء حج القحف ، يتم وضع مصفوفة μECoG تحت القشرة السمعية ، ويتم إدخال البوليترود الرقائقي من خلال الثقوب. يتم تسجيل الإشارات العصبية من μECoG والمسبار الرقائقي في وقت واحد ، ويتم أخذ عينات عند 6 كيلو هرتز و 24 كيلو هرتز ، على التوالي ، باستخدام نظام مكبر للصوت متصل بصريا بمعالج إشارة رقمية.

Protocol

يتبع كلا البروتوكولين نفس الخطوات الرئيسية (التخدير ، التثبيت ، بضع القحف ، تسجيل μECoG) ولكن لهما اختلافات ملحوظة. في الوصف التالي، يتم دمج الخطوات المشتركة، بينما يتم التعليق على خصوصيات كل بروتوكول. تتوافق هذه الخطوات أدناه مع تسجيل μECoG مع البصريات الوراثية (الماوس) أو تسجيل μECoG باستخدام مسبار رقائقي (Rat). تم تنفيذ جميع الإجراءات المبينة هنا وفقا للسلطات الأخلاقية أو القانونية المحلية (IACUC أو لجان الأخلاقيات). قد تختلف الأدوية المستخدمة وفقا للبروتوكول الأخلاقي المعتمد.

1. التحضير والبروتوكول لإجراءات الفئران والجرذان

1. الاختلافات الملحوظة بين بروتوكولات الفأر والجرذان
   1. إعدادات الجراحة مقابل التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية
      1. بالنسبة للفئران ، استخدم نفس الإعداد أثناء كل من الجراحة والتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية.
      2. بالنسبة للماوس ، قم بإجراء الجراحة في الإعداد الأول والتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية في الإعداد الثاني.
   2. تثبيت الرأس
      1. بالنسبة للفأر ، استخدم نفس مشبك الخطم للجراحة والتسجيل الفيزيولوجي الكهربي.
      2. بالنسبة للماوس ، استخدم مشبك الخطم للجراحة وقضيب رأس معدني خارجي في إعداد الفيزيولوجيا الكهربية للسماح بالتثبيت تحت تخدير الأيزوفلوران الخفيف. زرع قضيب الرأس بأسمنت الأسنان على الجمجمة.
   3. إعداد التسجيل: استخدم إلكترونيات اكتساب مميزة وبرامج تسجيل وبرامج تحفيز حسي للنوعين.
      1. بالنسبة لبروتوكول الماوس ، استخدم نظام SpikeGadgets (https://spikegadgets.com) وبرنامج Trodes مفتوح المصدر (https://spikegadgets.com/trodes/) للحصول على البيانات.
      2. بالنسبة لبروتوكول الفئران ، استخدم برنامج التسجيل Synapse - Neurophysiology Suite (https://www.tdt.com/component/synapse-software/) للحصول على البيانات.
   4. تحفيز التخدير عن طريق الحقن (الجرذ) أو الاستنشاق (الفأر).
   5. موقع التسجيل
      1. قم بإجراء التسجيلات في القشرة الحسية الجسدية (S1) للفأر.
      2. إجراء التسجيلات في القشرة السمعية الأولية (A1) للفئران.
         ملاحظة: يتطلب هذا الاختلاف في التوطين التشريحي مواقع مختلفة لبضع القحف لكل نوع.
2. إعداد واختبار الشبكة
   1. انقع الشبكة (باستثناء لوحة الموصل) في منظف إنزيمي مخفف (50٪ منظف ، 50٪ ماء مقطر) لمدة 1 ساعة على الأقل.
   2. انقله إلى حمام من الماء المقطر النقي واتركه يجف في الهواء في مكان آمن ونظيف.
   3. قم بإجراء الترسيب الكهربائي الأسود البلاتيني كجزء من الإعداد الأولي لجهاز μECoG ، وليس قبل كل جلسة تسجيل.
      ملاحظة: بمجرد الإيداع ، يشكل الطلاء الأسود البلاتيني طبقة مستقرة تظل فعالة للتسجيلات المتعددة ، على الرغم من أنه يجب مراقبة أدائها من خلال اختبار المعاوقة المنتظم. يقلل الترسيب الكهربائي الأسود البلاتيني (النطاق المستهدف من 10-20 كيلو أوم عند 1 كيلو هرتز) من مقاومة القطب الكهربائي ويحسن نسبة الإشارة إلى الضوضاء في التسجيلات العصبية.
   4. لإجراء الترسيب الكهربائي ، قم بإعداد محلول حمض الكلوروبلاتينيك (عادة 1-3٪ حمض الكلوروبلاتينيك [H2PtCl6]) يحتوي على كمية صغيرة من أسيتات الرصاص (حوالي 0.005٪) كمعدل للترسيب. قم بتوصيل أقطاب μECoG لتكون بمثابة قطب كهربائي يعمل في خلية كهروكيميائية ثلاثية الأقطاب الكهربائية ، مع قطب مضاد من البلاتين وقطب مرجعي Ag / AgCl.
   5. قم بتطبيق كثافة تيار ثابتة تبلغ حوالي -0.5-2 مللي أمبير/سم² لمدة 10-30 ثانية أثناء مراقبة قيم المقاومة.
   6. اختبار وتسجيل مقاومة أقطاب الشبكة (على سبيل المثال ، باستخدام Nano-Z).
   7. افحص الشبكة فوق مصدر الضوء وقم بإعداد الشبكة لاستخدامها في تسجيل ما بعد الجراحة.
3. لحام الكابلات المرجعية
   1. بالنسبة للماوس ، قم بلحام نهاية السلك الفضي (بطول 10 مم ، 30 جم) بدبوس ذهبي للاتصال بالرصاص المرجعي لنظام التسجيل.

2. الجراحة

1. إعداد المواد والمراقبة العامة (رعاية وتسجيله)
   1. طريقة التحضير: نظف وتطهير المنطقة الجراحية جيدا بمطهر مناسب. تأكد من تعقيم جميع الأدوات الجراحية ، عادة باستخدام الأوتوكلاف.
   2. وضع الأدوات الجراحية: رتب الأدوات الجراحية على الوسادة الجراحية المعقمة. قم بتخزين المنطقة الجراحية بأدوات تطبيق ذات طرف قطني ومثلثات جراحية قطنية ماصة. تخلص من أي نفايات خطرة بيولوجيا في كيس مخصص للتخلص منها.
   3. تنظيم درجة الحرارة: قم بتشغيل وسادة التسخين داخل موقع التسجيل الجراحي والفيزيولوجي الكهربية. تحكم في درجة حرارة وسادة التسخين طوال الجراحة والتسجيل.
   4. الوسادة الجراحية: ضع وسادة جراحية زرقاء أو بطانية فوق سرير تنظيم درجة الحرارة.
      ملاحظة: يجب أن تتميز هذه الوسادة بقاع قطني أبيض ناعم ، والذي يجب أن يكون متجها لأعلى.
   5. تحديد المواقع بالمجهر: قم بإعداد المجهر والإضاءة المرفقة (على سبيل المثال ، حلقة LED) على جانب واحد من منطقة الجراحة. تأكد من أنها تعمل بشكل صحيح.
   6. الحفر الجراحي: تحضير المثقاب الجراحي لإجراء حج القحف.
   7. إمداد الأكسجين: اضبط معدل تدفق خزان الأكسجين على 1.0 لتر / دقيقة (جرأ) أو 0.5 لتر / دقيقة (الماوس) وضع قناع الأكسجين بالقرب من وسادة التنظيم. سيحتاج إلى أكسجين مستمر بعد التخدير.
   8. استبدال السوائل: طوال الجراحة ، استبدل أي فقدان للسوائل بهدف استبدال ما لا يقل عن 1.5٪ من وزن جسم (الفأر) أو 1 مل في الساعة (الفئران). تحضير المحاليل متساوية التوتر وفقا لذلك.
   9. : إحضار من منشأة إلى غرفة العمليات وفقا للإجراءات المعتمدة. استخدم الفئران التي تتراوح أعمارها بين 8 إلى 16 أسبوعا ، سواء ذكرا أو إناثا ، من خلفية C57Bl6 ؛ وبالمثل ، استخدم الفئران التي يبلغ عمرها 7 أسابيع ، الذكور ، من سلالة Sprague Dawley.
   10. تحضير الأدوية: قم بوزن باستخدام ميزان بدقة 0.1 جرام. تحضير كميات الدواء الكافية للجراحة باستخدام المحاليل المخففة مسبقا إذا لزم الأمر.
2. تحريض التخدير
   1. تحريض التخدير للفأر
      1. ضع في غرفة تحريض الأيزوفلوران (3-5٪ إيزوفلوران في 0.5 لتر / دقيقة_{O 2}).
      2. بمجرد تأكيد التخدير العميق (عدم وجود رد فعل في قرص الذيل / إصبع القدم) ، ضع على وسادة تسخين الجراحة وقم بتثبيته.
      3. حقن الأدوية تحت الجلد لعلاج التسكين العام: ميلوكسيكام: 5 ملغ/كغ، وبوبرينورفين: 0.1 ملغ/كغ.
      4. قم بإصلاح الماوس باتباع الخطوات 2.2.1.5-2.2.1.6.
      5. ضع الخطم في قناع التخدير والرأس بشكل غير محكم في حامل الرأس. لوضع الماوس في شريط اللدغة ، تأكد أولا من أن اللسان أسفل القضيب وليس بين القضيب وسقف الفم. استخدم الملقط لتحريك اللسان إذا لزم الأمر.
      6. أدخل قواطع في الفتحة الموجودة على قضيب قضيب اللدغة. قم بتأمين قناع تخدير الفأر (1.5-2٪ إيزوفلوران في 0.5 لتر / دقيقة_{O 2}) عن طريق شد برغي التثبيت برفق. يتم ضمان تثبيت الرأس أثناء الجراحة فقط من خلال شريط العض.
      7. احم عيون بمرهم أو مواد تشحيم بترولية لمنع الجفاف أثناء الجراحة.
      8. حافظ على التخدير طوال العملية مع التدفق المستمر للأيزوفلوران عبر القناع.
   2. تحريض التخدير للفئران
      1. استخدم الأيزوفلوران في البداية لتخدير لتسهيل حقن التخدير التعريفي.
      2. إعطاء أدوية التخدير والتسكين:
         ميلوكسيكام: جرعة 5 مجم / كجم ، تركيز 10 مجم / مل ، 0.4 مل / كجم
         الكيتامين: جرعة 90 مجم / كجم ، تركيز 100 مجم / مل ، 0.9 مل / كجم
         زيلازين: جرعة 10 مجم / كجم ، تركيز 100 مجم / مل ، 0.1 مل / كجم
      3. اسمح للحيوان بالوصول إلى التخدير العميق في غضون 15-30 دقيقة ، حسب الوزن والعمر.
   3. مراقبة التخدير
      1. راقب باستمرار العناصر الحيوية للحيوان (معدل التنفس) طوال العملية. تحقق من معدل التنفس كعلامة مفيدة بشكل خاص للتغيرات المبكرة في حالة التخدير ، واضبط مستوى التخدير إذا تغير معدل التنفس.
      2. منعكس انسحاب المخلب هو علامة حرجة على حالة التخدير. اختبر هذا المنعكس بشكل دوري ، حيث يضمن غيابه التام مستويات كافية من التخدير للجراحة.
3. تثبيت الرأس ومراقبة العلامات الحيوية
   1. مراقبة العناصر الحيوية للحيوان
      1. تحقق من العلامات الحيوية للحيوان وسجلها على ورقة تجريبية. إذا لم يتم إطفاء ردود أفعال (على سبيل المثال ، انسحاب المخلب) تماما ، فقم بإعطاء نصف جرعة إضافية من الكيتامين التكميلي (الجرذ) أو زيادة تركيز الأيزوفلوران بزيادات قدرها 0.5٪ (الفأر).
   2. تثبيت الرأس للفئران
      1. بمجرد تخدير الجرذ بالكامل (لا توجد ردود أفعال مخلب أو ذيل) ، أدخل قواطع في الفتحة الموجودة على قضيب حامل الرأس.
      2. أدخل نقاط أذرع التثبيت بعناية في حافة الأنف لإصلاح الرأس أثناء الجراحة ، مع التأكد من عدم ملامسته للعينين.
      3. اضبط زاوية الذراعين حتى يتم الضغط بقوة على سقف فم على القضيب. تأكد من بقاء الجمجمة ثابتة تحت الضغط.
      4. قم بتأمين ذراعي الحامل عن طريق شد البراغي بمفتاح ربط سداسي.
   3. إعداد الأكسجين للفئران
      1. قم بتأمين الأنبوب البلاستيكي من خزان الأكسجين فوق كمامة وأنفه ، واربطه بشريط جراحي. تجنب التجاعيد في الأنبوب التي قد تعيق تدفق الهواء. اضبط خزان الأكسجين على معدل تدفق 1 لتر / دقيقة.
         ملاحظة: يجب فحص العناصر الحيوية للحيوان ، بما في ذلك معدل ضربات القلب ومعدل التنفس ، على فترات تتراوح بين 15 و 30 دقيقة طوال العملية.
4. شق فروة الرأس
   1. الحلاقة والتحضير
      1. احلق المنطقة من الخطم العلوي إلى مؤخرة الرأس ، وتمتد من عين إلى أخرى وحول الأذنين. قم بإزالة الجزء الأكبر من الفراء بمقص أو مقص كهربائي ، ثم ضع كريم إزالة الشعر.
   2. تطهير
      1. قم بتطهير المنطقة باستخدام قطعة قطن مبللة بالبيتادين ، ثم اشطفها بقطعة قطن مبللة ب 70٪ من الإيثانول. كرر هذه العملية ثلاث مرات وانتهي بتطبيق البيتادين النهائي للتأكد من أن المنطقة معقمة.
   3. حقن التخدير الموضعي
      1. حقن المخدر الموضعي ليدوكائين (1٪ ، 0.1 مل للفأر / 0.4 مل لكل كيلوغرام للفئران) تحت الجلد في خط الوسط لفروة رأس. قم بتدليك فروة الرأس برفق لنشر الليدوكائين ، وانتظر لمدة 5 دقائق للسماح للمخدر بالعمل.
   4. شق
      1. بالنسبة للفأر ، ارفع نقطة على الجلد بالملاقط واستقط جزءا صغيرا من الجلد (قطره حوالي 1 سم) باستخدام مقص جراحي.
      2. بالنسبة للفأر ، قم بعمل شق دقيق على الجانب الأمامي من فروة الرأس ، فوق الأنف مباشرة ، عند خط الوسط باستخدام المشرط. اسحب الجلد برفق للخلف ، مما يؤدي إلى عمل شق مستقيم من بين العينين إلى قاعدة الجمجمة. ارفع فروة الرأس بعناية ، واقطع النسيج الضام ، وكشف الجمجمة بالكامل.
      3. كشف موقع حج القحف باتباع الخطوات 2.4.4.4-2.4.4.5.
      4. باستخدام مكشطة ، قم بإزالة النسيج الضام والسمحاق في الجزء العلوي من الجمجمة. اغسل المحلول الملحي واستخدم الشفط أو الإسفنجة الجراحية لتنظيف الموقع.
      5. استخدم المشابك الجراحية على هوامش الجلد لتسهيل التعرض الواضح لمنطقة الجمجمة حيث سيتم إجراء بضع القحف.
5. حج القحف
   1. إجراءات الحفر العامة
      1. اضبط سرعة الحفر الجراحي على إعداد منخفض يبلغ 5000 دورة في الدقيقة أو 7000 دورة في الدقيقة للجراحين ذوي الخبرة. قم بإجراء جميع عمليات الحفر أثناء التصور من خلال المجهر.
      2. امسك المثقاب بالتوازي مع سطح الجمجمة واستريح برفق على السطح.
      3. مع الضغط الخفيف على الدواسة ، ابدأ الحفر في مكان واحد. قم بإجراء الحفر على فترات قصيرة (5-10 ثوان) مع فحوصات متكررة للتغيرات في لون العظام.
         ملاحظة: سيبدأ العظم باللون الأبيض المعتم ، وعندما يصبح الثقب أعمق ، سيصبح أكثر شفافية ، ويكشف عن لون وردي.
      4. عندما يقترب الحفر من الدماغ ، تبطئ وابحث عن علامات تسرب الرطوبة إلى الحفرة. عندما يكون لون الحفرة ورديا داكنا وله لمعان طفيف ، توقف عن الحفر. باستخدام إبرة قصيرة 30 جم ، قم بثقب الطبقة المتبقية من العظام برفق. يجب أن يخرج السائل الصافي جيدا من الحفرة الجديدة.
   2. إجراء الحفر للفأر
      1. لوضع قطب مرجعي للتسجيلات الفسيولوجية ، قم بحفر ثقب نتوء في الجزء الأمامي من نصف الكرة الأرضية متماثلا للمنطقة المسجلة.
      2. حدد محيط حج القحف عن طريق حفر خندق ضحل على محيطه. في المحور الوسطي الجانبي ، ابدأ من حافة العظام الجانبية كمرجع ، وتتبع نافذة 4 مم.
      3. في المحور الأمامي الخلفي ، قم بحفر نافذة مقاس 3 مم تبدأ ~ 1 مم الأمامية من حافة العظام الخلفية. يبلغ حجم حج القحف المفتوح النهائي حوالي نافذة 4 × 3 مم.
   3. إجراء الحفر للفئران
      1. حفر ثقبين: أحدهما في الربع الخلفي الأيسر ، والآخر في الربع الأمامي الأيمن.
      2. حقن عضلة المضغ بجرعة ثانية من الليدوكائين (0.4 مل / كجم عند 10 مجم / مل) ، ووزع بالتساوي في المكان المراد إجراء القطع.
      3. استئصال الحد الأدنى من العضلات اللازمة فقط لكشف منطقة حج القحف.
      4. باستخدام شفرة مشرط جديدة # 10 ، قم بإنشاء قطع عرضي ظهري بطني في حزمة العضلات فوق فك (الجانب الأيمن). امسك الحافة الخلفية للقطع بملقط مساك وقشره بعيدا عن الجمجمة أثناء القطع على طول التلال العظمية لعظم الوجنة. بهذه الطريقة ، يمكن فصل العضلات عن العظام بأقل قدر من النزيف.
      5. استئصال العضلة الأمامية بطريقة مماثلة حتى يتم الكشف عن خط شق في الجمجمة. سيكون هذا الخط هو الحد الأمامي لنافذة حج القحف.
      6. قم بمسح العضلات من حول التلال الخلفية باستخدام المشرط والملقط ، باستخدام مصدر ضوء قوي لتجنب التقطيع إلى مناطق الأوعية الدموية العالية.
      7. قم بطحن التلال الخلفية باستخدام المثقاب حتى لا يتم رفعها فوق سطح الجمجمة.
         ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لوضع شبكة μECoG لإجراء اتصال مباشر بالسطح القشري.
      8. حفر الحافة الظهرية للنافذة فوق التلال مباشرة حيث تم ربط العضلة المقطوعة. ضع الحافة الخلفية الأمامية للحافة الخلفية المحفورة. ضع الحافة الأمامية الخلفية لخط الشق الممتد لأسفل بالقرب من محجر العين.
         ملاحظة: عند تنظيف العضلات الأمامية ، يجب توخي الحذر لتجنب العين.
6. حفر نافذة حج القحف
   1. حفر نافذة حج القحف (نصائح)
      1. عند الحفر ، تأكد من أن مثقاب الحفر موازيا لسطح الجمجمة. استخدم أقل قدر ممكن من القوة ، باستخدام المثقاب مثل الفرشاة عن طريق السماح للمثقاب بالاتصال الخفيف بالجمجمة أثناء استخدام حركات قصيرة ومتكررة على طول خط حج القحف المقصود.
         ملاحظة: في الفئران ، تحتوي الحافة الخلفية للنافذة على العظم السميك. إذا كان الحفر بعيدا جدا ، فقد يظهر العظم جودة قشرية و "مقرمشة" تعقد قياس تقدم الحفر. إذا تم وضعها بشكل غير صحيح ، فقد تكشف هذه المنطقة العظمية عن لون أحمر وريدي يعطي انطباعا خاطئا عن قربها من الدماغ.
      2. حفر كل جانب من نافذة حج القحف حتى يظهر العظم باللون الوردي الباهت مع وجود شق أبيض رفيع أو صدع يمتد على طوله. تطبيق ضغط خفيف يجب أن ينتج العظم "تذبذبا" مميزا عند الحفر بالكامل. إذا بدا الكراك مفككا ، فاستمر في الحفر برفق حتى يحقق خطا مستمرا.
   2. إزالة الجمجمة الرقيقة داخل نافذة حج القحف
      1. عندما تكون الجمجمة ضعيفة بدرجة كافية بحيث يتسبب الضغط الخفيف للغاية في اهتزاز النافذة بأكملها بشكل واضح ، قم بإزالة الجمجمة الرقيقة.
      2. اغسل موقع حج القحف بقطرة من المحلول الملحي وانتظر 1 دقيقة على الأقل. هذا يضعف العظم الرقيق ويساعد العظام على الانفصال عن الجافية. صفي المحلول الملحي الزائد بمثلث قطني ماص أو فراغ.
      3. ارفع الجمجمة الرقيقة بعناية باستخدام الملقط ، وتجنب تلف الأنسجة الأساسية.
      4. استخدم إسفنجة مرقئ للحفاظ على رطوبة الدماغ.
      5. أمسك النافذة بإحكام على الجانبين الظهري والبطني بملقط مسنن واسحب بعيدا مباشرة عن الجمجمة. إذا كانت هناك أي صعوبة في سحب النافذة من الموقع ، فتوقف واستأنف الحفر الخفيف حتى يضعف العظم بدرجة كافية.
      6. بالنسبة لتسجيلات الماوس μECoG ، اترك الجافية سليمة.
7. زرع الأسمنت وعمود الرأس للفأر
   1. أدخل السلك المرجعي وقم بتثبيته.
      1. أدخل طرف السلك الفضي ~ 1 مم في فتحة الأزيز ، وهو ما يكفي للاتصال بسطح الدماغ ولكن لا يسبب نزيفا.
      2. ضع أسمنت الأسنان في مكانه أثناء تطبيق الطبقة الأولى.
   2. تحضير الأسمنت للأسنان
      1. استخدم طبق خلط السيراميك المبرد لتحضير خليط الأسمنت للأسنان. يثخن هذا الأسمنت بسرعة ويتطلب التحضير المنتظم لخليط جديد. امسح طبق الخلط قبل تحضير خليط جديد.
         ملاحظة: يجب ألا يكون الأسمنت على اتصال مباشر بالدماغ.
   3. تطبيق الطبقة الأولى
      1. ضع الطبقة الأولى من الأسمنت حول حج القحف وعبر الجمجمة بأكملها باستخدام أدوات تطبيق دقيقة. تعمل هذه الطبقة كعزل كهربائي بين الجمجمة وقضيب الرأس المعدني.
      2. قم بإحاطة حج القحف بالكامل بالأسمنت ، بما في ذلك التغطية الجانبية ، لتوفير الحماية الكافية لبضع القحف المفتوح وشبكة μECoG.
   4. وضع القضيب الأمامي المعدني
      1. قم بتوصيل الجزء الكبير من القضيب الأمامي بحامله دون إحكام ربطه بالكامل.
      2. ضع القضيب الأمامي حسب الرغبة ، مع وضع الجزء الرفيع على طول خط وسط الجمجمة عند ملامسة سطح الأسمنت.
   5. تأمين الغرسة
      1. قم بتغطية قضيب الرأس بالأسمنت للأسنان وقم بتوصيله بسطح الأسمنت.
   6. إزالة الحامل
      1. اترك بضع دقائق حتى يقوي أسمنت الأسنان.
      2. بمجرد تثبيت قضيب الرأس بالكامل ، قم بإزالته عن طريق إزالة المسمار أولا من الحامل. بعد ذلك ، اسحب الحامل للخلف ، مع التأكد من عدم تطبيق أي قوة على شريط الرأس.
8. بضع التحمل لجراحة الفئران
   ملاحظة: هذه خطوة جراحية صعبة.
   1. رفع الجافية
      1. باستخدام الملقط رقم 5 ، الذي يتم تثبيته بالتوازي مع سطح الدماغ قدر الإمكان ، ارفع جزءا صغيرا من الجافية بعيدا عن الدماغ.
      2. استخدم إبرة جديدة 30 جم (أقصر ما يمكن) لتمزيق الجافية المرفوعة بعناية.
         ملاحظة: الأم الجافية عبارة عن طبقة رقيقة وشفافة من الأنسجة تقع مباشرة فوق الدماغ. تتم إزالته لتسجيلات μECoG في الفئران. من الأهمية بمكان إجراء بضع التحمل دون إزعاج الأوعية الدموية على سطح الدماغ. تشمل الطرق الموصى بها لإجراء بضع التجافي استخدام ملقط وإبرة حقنة لثقب الجافية قبل سحبها للخلف أو استخدام أداة دوراتوم مثبتة بالقرب من الجمجمة لسحب الجافية بعناية.
   2. استئصال الجافية
      1. استمر في إمساك الجافية بالملقط ورفعها بعيدا عن الدماغ. قم بإنشاء تمزق قطري بالإبرة أثناء الرفع.
      2. استخدم الملقط لتقشير الجافية بعناية باتجاه جانبي نافذة حج القحف ، مما يضمن بقاء سطح الدماغ دون إزعاج.
9. نقل الماوس إلى الإعداد للتسجيل الفيزيولوجي الكهربي
   1. قم بإزالة من إعداد الجراحة عن طريق رفع الخطم والقواطع برفق من قضيب القاطع ثم سحب للخلف. حقن الكلوربروتكسين (1 ملغم/كغ، داخل الصفاق [IP])، وهو مهدئ يتيح الحفاظ على التخدير المستمر باستخدام تركيز أقل من الأيزوفلوران.
   2. ضع الماوس في إعداد التسجيل الفيزيولوجي الكهربي.
      1. تأكد من أن وسادة التدفئة في مكانها وتعمل بشكل صحيح.
      2. قم بإصلاح باستخدام شريط الرأس الموجود على الحامل في الإعداد الفيزيولوجي الكهربية.
      3. اجعل قناع الأيزوفلوران قريبا لتغطية خطم بالكامل.
   3. تعديل التخدير
      1. خفض مستويات التخدير تدريجيا إلى 0.7-1٪ إيزوفلوران (بزيادات قدرها 0.5٪ كحد أقصى كل 5 دقائق).
      2. راقب معدل تنفس وتحركاته.
         ملاحظة: يجب أن يزيد معدل التنفس قليلا مقارنة بالحالة الجراحية ، لكن لا ينبغي أن يتحرك.
      3. إذا كان يتحرك ، فقم بزيادة تركيز الأيزوفلوران على الفور إلى 2٪ قبل إعادته ببطء إلى مستوى أقل بزيادات قدرها 0.5٪.
   4. إدخال شعيرات للتحفيز الحسي
      1. قم بتوصيل اهتزاز الماوس بجهاز تحفيز الشعيرات. في هذا البروتوكول، أدخل تسعة اهتزازات في أطراف ماصة قصيرة سعة 10 ميكرولتر، متصلة بالمشغلات الكهروإجهادية التي توفر انحرافات سريعة للاهتزازات.

3. التسجيل

1. تركيب الشبكة
   1. الخطوات الأولية
      1. قم بتشغيل نظام التسجيل ومكبر الصوت.
      2. تحقق من العلامات الحيوية للحيوان.
   2. إجراء
      1. لتحديد موضع والأدوات، اتبع الخطوات 3.1.2.2-3.1.2.4.
      2. ضع في إعداد التسجيل ، وتأكد من بقاء حج القحف رطبا عن طريق تطبيق محلول ملحي بانتظام.
      3. بالنسبة للفأر ، ضع المعالج الدقيق على درابزين الحفارة ، الموجود خلف موقع حج القحف ، لتجنب التداخل.
      4. بالنسبة للماوس ، ضع المعالج الدقيق بشكل جانبي في موقع حج القحف بجانب.
      5. لتوصيل الشبكة ووضعها على الماوس، اتبع الخطوات 3.1.2.6-3.1.2.12.
      6. قم بتوصيل شبكة μECoG بمنصة الرأس باستخدام موصلات مشبك ZIF (موصل الرأس). أمسك اللوحة الإلكترونية لمنصة الرأس في مكانها عبر قضيب ميكانيكي مثبت بمعالج دقيق.
      7. اخفض شبكة μECoG أفقيا لمحاذاة مسطحة فوق حج القحف على طول المحور الأمامي الخلفي.
         ملاحظة: على طول المحور الجانبي الإنسي ، يجب أن تكون حافة الشبكة بالقرب من الحدود الإنسية لبضع القحف.
      8. بمجرد وضع الشبكة بالقرب من الدماغ ولكن ليس على اتصال بها ، قم بتوصيل السلك المرجعي للشبكة بدبوس الذهب الفضي المزروع. إذا لزم الأمر ، قم بتوصيل السلك الأرضي بالحيوان (على سبيل المثال ، بعضلة مكشوفة) لتقليل الضوضاء الكهربائية.
      9. علاوة على ذلك ، قم بخفض الشبكة للاتصال بالدماغ.
      10. حرك الشبكة بشكل جانبي "للانزلاق" فوق سطح الجافية الرطب. استمر في الضبط حتى تتمركز الشبكة على طول المحور الوسطي الجانبي.
      11. استخدم الشفط أو الإسفنجة الجراحية حول حواف حج القحف لإزالة أي محلول ملحي زائد.
      12. بمجرد أن يصبح المستحضر أكثر جفافا قليلا ، تأكد من أن الشبكة تلتصق بقوة أكبر بالجافية ولا تنزلق على سطحها. عندما يكون أكثر جفافا ، قم بتطبيق حركة جانبية إلى إنسية على الشبكة المرنة ، مما يضمن ملامسة معظم الأقطاب الكهربائية الجانبية. سوف ينحني الكبل المرن للشبكة بشكل طبيعي ليتناسب مع محيط الدماغ.
      13. لوضع الشبكة على فأر ، اتبع الخطوات 3.1.2.14-3.1.2.18.
      14. قم بتأمين جذع شوكة التثبيت في المعالج الدقيق ، مع التأكد من أن لوحة الموصل الخاصة بالشبكة ستحوم على الجانب الخلفي من نافذة حج القحف عند خفضها.
      15. اضبط موضع المعالج الدقيق على الدرابزين بحيث تكون الشبكة فوق موقع حج القحف تقريبا. اخفض الشبكة حتى تحوم بالقرب من سطح الدماغ. بلل سطح الدماغ بقطرة صغيرة من المحلول الملحي.
      16. قم بإجراء هذه الخطوات باستخدام المجهر. باستخدام أقراص المعالج الدقيق ، اضبط موضع الشبكة حتى يصبح مسطحا على سطح الدماغ في وسط حج القحف.
      17. تخلص من الرطوبة بعناية باستخدام مثلث قطني ماص دون لمس الشبكة نفسها. تأكد من أن كل صف من الشبكة على اتصال بسطح الدماغ.
          ملاحظة: تمنع إزالة الرطوبة الانتشار السلبي للإشارة الكهربائية عبر السائل بين السطح القشري والشبكة ، مما يؤدي إلى نشر الإشارة المستشعرة مكانيا عند القطب.
      18. باستخدام الملقط رقم 2 أو رقم 5 ، أدخل سلك التأريض الشبكي في نفس فتحة الأزيز أو أدخل السلك المرجعي في فتحة لدغ والسلك الأرضي في الأنسجة العضلية القريبة.
          ملاحظة: يجب إدخال الأسلاك ~ 1 مم فقط ، وهو ما يكفي للاتصال بالدماغ ولكن لا يسبب نزيفا أو صدمة في الدماغ.
2. التحقق من وضع الشبكة
   1. مراقبة النشاط الفيزيولوجي الكهربي
      1. راقب النشاط الفيزيولوجي الكهربي باستخدام برنامج التسجيل. تحت التخدير الخفيف ، تكون إشارات الدماغ متغيرة ويمكن أن تظهر مجموعة متنوعة من الأنماط.
      2. يجب أن ينتج عن التوصيل الصحيح للشبكة والأسلاك المرجعية والأسلاك الأرضية نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية ، مع سعة إشارة في نطاق مللي فولت. راقب الضوضاء في نطاق التردد العالي باستخدام ترشيح ممر النطاق باستخدام Trodes (على سبيل المثال ، 100-6000 هرتز) وتأكد من أنها لا تتجاوز بضع عشرات من الميكروفولت (μV).
   2. تقييم الاستجابة الحسية باستخدام الضوضاء (على سبيل المثال ، التصفيق أو الطقطقة بالأصابع) للحث على إمكانات كهربائية مرئية للسطح القشري مرتبط بالحدث (CSEPs).
      ملاحظة: يجب أن يستحضر تحفيز شعيرات واحدة CSEP واضحا وحادا مرتبطا بالحدث في عدد قليل من القنوات (الماوس).
   3. التحقق من موقع الشبكة
      1. بالنسبة للفأر ، تأكد من وضع الشبكة بشكل صحيح فوق القشرة السمعية. يجب أن تكون الكتلة الأولى المسجلة عادة عبارة عن محفز ضوضاء بيضاء لمدة 60 ثانية للتحقق من أن الشبكة تسجل استجابة مناسبة من الدماغ. قم بإجراء تسجيلات تشخيصية للضوضاء البيضاء والنغمة مع الشبكة فقط قبل إدخال polytrode للمساعدة في تحديد ما إذا كانت الشبكة قد تم وضعها بشكل صحيح وما إذا كانت هناك استجابة للإشارة.
      2. بالنسبة للماوس ، للتحقق من تحديد موقع الشبكة ، قم بإجراء جلسة رسم خرائط سريعة مع انحراف شعيرات من 20 إلى 30 متباعدة بمقدار 350 مللي ثانية. سجل النشاط في نطاق إمكانات المجال المحلي (LFP) باستخدام Trodes وقم بتحليله في وضع عدم الاتصال باستخدام كود MATLAB مخصص لتصور المدى المكاني للنشاط الذي يستحثه الشعيرات.
   4. إعادة التموضع
      1. إذا كانت الشبكة تتطلب تعديلا ، فقم بترطيب السطح القشري بقطرات من المحلول الملحي فوق الشبكة.
      2. اترك المحلول الملحي لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة قبل محاولة رفع الشبكة.
      3. ارفع الشبكة بعناية وببطء.
      4. قم بتغيير موضعه باستخدام الخطوات الموضحة في الخطوة 3.1.
3. polytrodes رقائقي للفئران
   1. إعداد Polytrode
      1. أولا ، قم بتوصيل محول الرأس بالجانب الخلفي من polytrode. قم بقص الموصل بالمجموعة الثالثة من القنوات على لوحة المحول. تأكد من أن العلامة السوداء الموجودة على المشبك تواجه الجانب الأيمن من نهاية العمل من polytrode.
   2. إدخال Polytrode
      1. أدخل البوليترود في الدماغ حتى تظهر الأقطاب الكهربائية الأخيرة (العلوية) فوق سطح القشرة. يؤدي الهبوط البطيء (حتى 1 ميكرومتر / ثانية) إلى تحسين جودة الإشارة. انتظر لمدة 15 دقيقة ، مما يسمح للدماغ بالتكيف مع وجود polytrode.
      2. بعد 15 دقيقة ، تحقق مما إذا كانت الأقطاب الكهربائية الأخيرة قد دخلت السطح القشري. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بخفض polytrode أكثر قليلا وانتظر 10 دقائق إضافية قبل المتابعة.
4. وضع مصدر الضوء البصري الوراثي على الفأر
   1. استخدم إما نظاما لولبيا دقيقا للضبط بثلاثة أبعاد ، مثبتا على ذراع مفصلي ، أو معالجا دقيقا لتركيب حامل الألياف الضوئية.
   2. لتوجيه مصدر الضوء والمساعدة في وضع الألياف ، قم بتشغيل الضوء البصري الوراثي بكثافة منخفضة. استخدم الذراع المفصلية لوضع الضوء البصري الوراثي بشكل خشن باتجاه المنطقة المستهدفة.
   3. قم بتركيز موضع الألياف وضبطه باستخدام أداة معالجة دقيقة أو براغي ضبط دقيقة.
5. تسجيل الإشارات
   1. اعداد
      1. افصل جميع الأضواء غير الضرورية وأسلاك التمديد وواقيات زيادة التيار في الجهاز الجراحي لتقليل التداخل الكهربائي. أطفئ الأضواء العلوية في الحفارة.
      2. أغلق باب مساحة التسجيل المعزولة وباب غرفة الجراحة قبل بدء التجربة.
   2. بدء الاستحواذ
      1. بالنسبة للفأر ، ابدأ Synapse على منصة التسجيل / الكمبيوتر وتأكد من أن الاستحواذ يعمل عن طريق معاينة الإشارات والتحقق منها. اصنع عابرات كبيرة وحادة للجهد في إشارة μECoG من خلال تقديم محفزات بالقرب من ، أي التصفيق.
      2. بالنسبة للماوس، ابدأ جلسة التسجيل في Trodes.
   3. الترطيب
      1. حقن الجرذ أو الفأر تحت الجلد ب 1 مل أو 0.1 مل من المحلول الملحي على التوالي كل 1-2 ساعة أثناء التسجيل لمنع الجفاف. بالنسبة للفأر ، انتظر من 5 إلى 10 دقائق بعد إعطاء المحلول الملحي قبل تشغيل كتلة تسجيل جديدة.
   4. مجموعات التحفيز
      1. بالنسبة للفئران ، بمجرد تأكيد موقع التسجيل ، تابع تسجيل مجموعات التحفيز المطلوبة. قد تتضمن مجموعة الأمثلة
         ضوضاء بيضاء (60 ثانية)
         تشخيص النغمة (5 دقائق)
         نغمة نقية (23 دقيقة)
         تموج متحرك ديناميكي
         نغمة 150 (15 دقيقة)
         تيميت (38 دقيقة)
      2. بالنسبة للفئران ، أعد تقديم تشخيصات الضوضاء البيضاء والنغمة في أي وقت يتم فيه إعادة وضع الشبكة.
      3. المحفزات اللمسية للفأر: توفير محفزات اللمس في هيكل تجريبي ، حيث تحتوي كل تجربة على مجموعة من الانحرافات العشوائية لكل 350 مللي ثانية. في المثال المقدم، تتضمن كل تجربة 14 انحرافا معروضا على مدى 4500 مللي ثانية.
      4. المحفزات البصرية الوراثية للفأر: في بعض التجارب ، قم بتطبيق نبضة مربعة من الضوء البصري الوراثي طوال مدة التجربة بأكملها (5 ثوان). تحديد مستوى الضوء المطلوب بناء على opsin المستخدم وعلى عمق الأنسجة المراد الوصول إليها باستخدام تقديرات اختراق الضوء (https://web.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php)
6. تنظيف
   1. رفع وتنظيف الشبكة
      1. بمجرد انتهاء التسجيل ، أغلق برنامج التسجيل وأعد توصيل مصادر الإضاءة في الحفارة.
      2. إذا كان الدماغ جافا ، ضع قطرة صغيرة من المحلول الملحي على سطح الدماغ باستخدام حقنة. اترك المحلول الملحي لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة قبل محاولة رفع الشبكة.
      3. من خلال العمل تحت المجهر ، ارفع الشبكة برفق من سطح الدماغ باستخدام أجهزة المعالجة الدقيقة.
      4. إذا كانت هناك حاجة إلى قوة إضافية أثناء رفع الشبكة ، فاستخدم ملقطا ذو رأس كربوني (مغلق) لرفع الشبكة برفق من الدماغ. تأكد من أن حركة المعالج الدقيق أمامية قليلا لتقشير الشبكة برفق بعيدا عن سطح الدماغ.
      5. بمجرد إزالة الشبكة بالكامل ، افصلها عن شوكة الإمساك وتنظيفها باتباع الخطوات 3.6.1.6-3.6.1.7.
      6. انقع الشبكة (باستثناء لوحة الموصل) في منظف إنزيمي مخفف (50٪ إنزول ، 50٪ ماء مقطر) لمدة ساعة واحدة على الأقل. بعد ذلك ، انقله إلى حمام ثان من الماء المقطر النقي واتركه يجف في الهواء في مكان آمن ونظيف.
      7. إذا كانت مناطق الشبكة قد ترسبت دما أو أنسجة ، فاستخدم مثلثا قطنيا مبللا بمحلول إنزيمي لمسحه برفق.
      8. بمجرد أن تجف ، أعد الشبكة إلى صندوقها.
   2. القتل الرحيم للحيوان
      1. بالنسبة للفأر ، قم بإزالة من تثبيت الرأس وضعه في غرفة القتل الرحيم. أضف شاشا يحتوي على 5 مل من الأيزوفلوران وانتظر 60 ثانية بعد التوقف عن التنفس. تحقق من عدم وجود منعكس انسحابي وقطع الرأس باستخدام مقص حاد.
      2. بالنسبة للفئران ، قم بحقن 0.2 مل من البنتوباربيتال IP. انتظر لمدة 60 ثانية بعد التوقف عن التنفس ، واستلق على ظهره ، واستخدم شفرة # 11 لإجراء بضع الصدر المزدوج.
   3. تنظيف المعدات
      1. خذ جميع الأدوات الجراحية إلى حوض المختبر وضعها على منشفة جراحية. رش الأدوات بمحلول مبيض 10٪ واغسلها جيدا في الحوض. بالنسبة للأدوات المتسخة ، اتركها تنقع في محلول التبييض قبل الغسيل.
      2. بدلا من ذلك ، استخدم مسحوق التنظيف (على سبيل المثال ، Contrex AP) بالماء عن طريق فرك الأدوات بفرشاة في الحوض.
      3. بمجرد تنظيف الأدوات وشطفها ، امسحها بمناديل كحولية وأعيدها إلى مساحة التخزين الخاصة بها.
   4. تعقيم مساحة العمل
      1. تخلص من جميع الإبر والشفرات المستخدمة في حاوية الأدوات الحادة.
      2. تخلص من مسحات القطن الملوثة والمثلثات ومناديل الكحول المبللة في كيس الخطر البيولوجي.
      3. امسح جميع أسطح العمل في غرفة الحفارة بالكحول ونظف جميع الأدوات قبل إغلاق مساحة العمل.

النتائج

لقد وصفنا بروتوكولات تسجيل الإشارات الكهربية القشرية جنبا إلى جنب مع طرق البصريات الوراثية والتسجيلات الصفحية. هنا ، يتم تقديم الإشارات النموذجية التي تم الحصول عليها من القشرة الحسية الجسدية للفأر (الشكل 1 والشكل 2 والشكل 3

Discussion

تتيح البروتوكولات الموضحة هنا دمج مصفوفات القشرة الكهربائية الدقيقة عالية الكثافة (μECoG) مع المجسات الصفيحية وتقنيات الوراثة البصرية. سهولة استخدام هذا البروتوكول في نماذج القوارض تجعله أداة قوية للتحقيق في ديناميكيات القشرة ، ويمكن زيادة عدد الموضوعات بسهولة. تسمح شب?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 disposable #11 blade	Swann Morton	303	For surgical procedures
2 disposable #10 blades	Swann Morton	3901	For surgical procedures
30 mm cage bars	Thorlabs	ER	cage components
30 mm cage plate	Thorlabs	CP33T	holding the lenses
70% ethanol	Decon Labs	V1016	Cleaning / Disinfectant (diluted to 70%)
Amalgambond PLUS Adjustable Precision Applicator Brush Teal 200/Bx	Henry Schein	1869563	precision applicator for the cement
Amalgambond PLUS Catalyst 0.7 mL Syringe Ea	Henry Schein	1861119	cement component
Amplifier (Tucker-Davis Technologies)	Tucker-Davis Technologies	PZ5M-512	Used for auditory stimulus and recording software.
Articulated arm	Noga	DG60103	for holding the fine adjustment screw system
Aspheric lenses for light collection (and one for focusing the light)	Thorlabs	ACL25416U-B	for collecting LED light
Auditory equipment	Tucker-Davis Technologies, Sony, Cortera	RP2.1 Enhanced Real-Time Processor/HB7 Headphone Drive	Used for auditory stimulus and recording software.
Buprenorphine	Sterile Products LLC	#42023017905	General analgesia
C&B Metabond Base Cement Ea	Henry Schein	1864477	cement component
C&B Metabond L-Powder Cement Clear 3 g	Henry Schein	1861068	cement component
Chlorprothixene hydrochloride (mouse)	Sigma Aldrich	Cat. No. C1671	For sedation, must be prepared the same day and kept at 4
Custom-designed 128-channel micro-electrocorticography (μECoG) grids	Neuronexus	E128-200-8-40-HZ64	For neurophysiology recordings. Placed onto the cortex.
Dengofoam gelatin sponges	Dengen dental	600034 (SKU)	can be used dry or wet, saturated with sterile sodium chloride solution
Drill bit, size 5 to 9 (Mouse)	Fine Science Tools	19007-XX	XX is the size of the drill bit e.g. 05 or 09. For mouse procedures
Drill bitSteel Round Bur (5.5 mm/7.5 mm)	LZQ Tools	Dental Bar Drill Bit Stainless Steel Bur	For rat procedures
Dumont No. 5 forceps	Fine Science Tools	11251-10	For surgical procedures
Dumont tweezers #5 bent 45°	World precision instruments	14101	for removing craniotomy window
DVD Player (Sony)	Sony	CDP-C345	System used to accept and play back stimulus sets
Electrostatic Speaker	Sony	XS-162ES	Used for auditory stimulus and recording software. Located within the rig, plays sound to the sedated rodent
Enzymatic detergent (Enzol)	Advanced sterilization products	2252	Cleaning/Disinfectant
EverEdge 2.0 Scaler Sickle Double End H6/H7 #9	Henry Schein	6011862	for scrubing the skull
Fine adjustment screw system in 3 dimension	Narishige	U-3C	for precise positioning of the optical fiber end
Gold pin	Harwin Inc	G125-1020005	Used for contact reference in mouse Soldered to the silver wire
Gripping forceps	Fine Science Tools	00632-11	For surgical procedures
Isoflurane	Covetrus	11695067772	require a vaporizer
Ketamine (Hydrochloride Injection) (Rat)	Dechra	17033-101-10	Anesthesia/Analgesic
LED	New Energy	LED XLAMP XPE2 BLUE STARBOARD	Blue LED light source
LED driver	Thorlabs	LEDD1B	LED driver
Lidocaine	Covetrus	VINB-0024-6800	to be diluted to 1% in saline
Meloxicam	Covetrus	6451603845	Anti-inflammatory used for general analgesia
Micromanipulator	Narishige (Stereotaxic Rig)	SR-6R + SR-10R-HT components	Used to manipulate ECoG and rodent with fine movements
No. 2 forceps	Fine Science Tools	91117-10	For surgical procedures
No. 55 forceps	Fine Science Tools	1129551	For surgical procedures
Ophtalmic lubricant (Artificial tears)	Akorn	17478-062-35	Used to protect eyes from dessication during surgical procedures
Optical fiber 200µm Core diameter	Thorlabs	M133L02	FC/PC connector 2 m long
Pentobarbital (Rat)	Covetrus / Dechra	VINV-C0II-0008	Anesthesia/Analgesic
Platinum Black	Sigma	205915-250MG	For neurophysiology recordings (Used for electroplating the contacts on the μECoG grids).
Povidone Iodine 10%	Betadine	https://betadine.com/medical-professionals/betadine-solution/	no catalog number ( not retail )
Powder detergent (Contrex AP)	Decon Labs	5204	Cleaning / Disinfectant
Pre-cut tape for oxygen tube	ULINE (Various Providers)	S-14726	Used to attach oxygen tube to the nose-cone of the rodent stereotaxic rig
Scalpel handle # 3	World precision instruments	500236-G	for blades # 10, #11 and #15
Scraper	Fine Science Tools	1007516	For surgical procedures
Short 30 G needles	ExelInt	26437	For surgical procedures and injections
Silver Wire	Warner Instruments	63-1319	For neurophysiology recordings (Used for grounding and as a reference electrode).
Sterilized saline (0.9% sodium chloride for injection)	Hospira	00409-7101-67 (NDC)	For dilution of injectable, and replacement of body fluids
Stoelting Hopkins Bulldog	Fine Science Tools	10-000-481	For surgical procedures
Surface disinfectant (Coverage Plus NDP Disinfectant)	Steris life science	638708	Cleaning/Disinfectant
TDT ZIF-clip connectors for acquisition.	Tucker-Davis Technologies	ZIF-Clip Analog Headstages	Connects ECoG with outside acquisition equipement
Two-pronged holding fork	Tucker-Davis Technologies	Z-ROD128	Used to connect the TDT-clips with the micromanipulator
Xylazine (Rat)	Covetrus	1XYL006	Anesthesia/Analgesic