Multiskalige Untersuchungen der kortikalen Prozessierung durch Integration laminarer Polytroden und Optogenetik mit Mikroelektrokortikographie bei Nagetieren

Zusammenfassung

Hier stellen wir zwei Protokolle für die Aufzeichnung von Mikro-Elektrokortikographie (μEcoG) mit hoher Dichte bei Ratten und Mäusen vor, einschließlich chirurgischer, Implantations- und Aufzeichnungsmethoden. μECoG-Aufzeichnungen werden entweder in Kombination mit laminarer Polytrodenaufzeichnung im auditorischen Kortex der Ratte oder mit optogenetischer Manipulation der neuronalen Aktivität im somatosensorischen Kortex der Maus durchgeführt.

Zusammenfassung

Die Elektrokortikographie (ECoG) ist eine methodische Brücke zwischen den grundlegenden Neurowissenschaften und dem Verständnis der menschlichen Gehirnfunktion bei Gesundheit und Krankheit. ECoG zeichnet neurophysiologische Signale direkt von der kortikalen Oberfläche mit zeitlicher Auflösung im Millisekundenbereich und spaltenförmiger räumlicher Auflösung über große Regionen des kortikalen Gewebes gleichzeitig auf, wodurch es einzigartig positioniert ist, um sowohl lokale als auch verteilte kortikale Berechnungen zu untersuchen. Hier beschreiben wir das Design von kundenspezifischen High-Density-Micro-ECoG-Bauelementen (μECoG) und deren Einsatz in zwei Verfahren. Diese Gitter weisen 128 niederohmige Elektroden mit einem Abstand von 200 μm auf, die auf einem durchsichtigen Polymersubstrat mit Perforationen zwischen den Elektroden hergestellt sind; Diese Eigenschaften ermöglichen die gleichzeitige μECoG-Aufzeichnung mit laminaren Polytroden-Aufzeichnungen und optogenetischen Manipulationen. Zunächst stellen wir ein Protokoll für die kombinierte epidurale μECoG-Aufzeichnung über den somatosensorischen Kortex von Mäusen mit optogenetischer Manipulation spezifischer genetisch definierter kortikaler Zelltypen vor. Dies ermöglicht eine kausale Aufschlüsselung der unterschiedlichen Beiträge verschiedener neuronaler Populationen zur sensorischen Verarbeitung und gleichzeitig die Überwachung ihrer spezifischen Signaturen in μECoG-Signalen. Zweitens stellen wir ein Protokoll für akute Experimente vor, um die neuronale Aktivität des auditorischen Kortex von Ratten mit μECoG-Gittern und laminaren Polytroden aufzuzeichnen. Dies ermöglicht eine detaillierte topographische Kartierung von sensorisch evozierten neuronalen Reaktionen über die kortikale Oberfläche gleichzeitig, mit Aufzeichnungen von mehreren neuronalen Einheiten, die über die kortikale Tiefe verteilt sind. Diese Protokolle ermöglichen Experimente, die verteilte kortikale Aktivität charakterisieren und können zum Verständnis und eventuellen Interventionen bei verschiedenen neurologischen Erkrankungen beitragen.

Einleitung

Die Gehirnfunktionen, die der Empfindung, der Kognition und der Handlung zugrunde liegen, sind organisiert und über weite räumliche und zeitliche Skalen verteilt, die von den Spitzen einzelner Neuronen über die elektrischen Felder reichen, die von Populationen von Neuronen in einer kortikalen Säule erzeugt werden, bis hin zur topographischen Organisation von Säulen in Gehirnbereichen (z. B. Somatotopie im somatosensorischen Kortex, Tonotopie im primären auditorischen Kortex). Um die Gehirnfunktion zu verstehen, müssen elektrische Signale über diese räumlichen Skalen hinweg wahrgenommen^{werden 1}. Die Neurowissenschaften verfügen derzeit über viele weit verbreitete Methoden, um die Aktivität des Gehirns zu überwachen. Elektrophysiologisch ermöglichen laminare Polytroden (wie Neuropixel) die Überwachung einer bescheidenen Anzahl (~300) einzelner Neuronen, typischerweise innerhalb einer Handvoll weit voneinander entfernter Spalten, mit hoher zeitlicher Auflösung (≥1 kHz). Die Ca2⁺ -Bildgebung ermöglicht die Überwachung einer geringen bis großen Anzahl genetisch und anatomisch identifizierter einzelner Neuronen innerhalb von ~1-2 mm räumlicher Ausdehnung bei einer niedrigeren (~10 Hz) zeitlichen Auflösung². Die fMRT ermöglicht die Überwachung des Stoffwechselzustands einer großen Anzahl von Neuronen (~1 Mio. Neuronen in einem Volumen von 36 mm³ ) über das gesamte Gehirn bei sehr geringer zeitlicher Auflösung (~0,2 Hz). EEG/MEG ermöglicht die Überwachung der elektrischen Aktivität der gesamten kortikalen Oberfläche/des Gehirns bei bescheidener zeitlicher Auflösung (<100 Hz) und sehr geringer räumlicher Auflösung (Zentimeter)³. Während jede dieser Methoden grundlegende, synergistische Einblicke in die Gehirnfunktion geliefert hat, sind Methoden, die die direkte Erfassung elektrophysiologischer Signale mit hoher zeitlicher Auflösung von präzisen anatomischen Orten über weite räumliche Regionen des Kortex ermöglichen, im Entstehen. Die Notwendigkeit einer breiten räumlichen Abdeckung wird durch die Tatsache unterstrichen, dass sich die neuronale Funktion im Gehirn auf der Oberfläche im Vergleich zur Tiefe viel dramatischer ändert⁴.

Die Elektrokortikographie (ECoG) ist eine Methode, bei der Gitter aus niederohmigen Elektroden auf die Oberfläche des Gehirns implantiert werden und die Aufzeichnung oder Stimulation des Kortex^{ermöglichen 1,5}. ECoG wird typischerweise in der Neurochirurgie des Menschen als Teil der klinischen Aufarbeitung zur Behandlung pharmakologisch hartnäckiger Epilepsie eingesetzt. Es bietet jedoch auch einzigartige Einblicke in die verteilte kortikale Verarbeitung beim Menschen, wie z.B. sprachliche und sensorische topographische Kartierung ^6,7. Diese Fähigkeiten haben zu seiner Verwendung in Tiermodellen motiviert, darunter Affen, Ratten und Mäuse 5,8,9,10,11. Bei Nagetieren konnte kürzlich gezeigt werden, dass micro-ECoG (μECoG) eine hohe zeitliche Auflösung (~100 Hz) direkte elektrische Überwachung von neuronalen Populationen mit säulenbezogener räumlicher Auflösung (~200 μm) und breiter räumlicher Abdeckung (viele Millimeter) ermöglicht. μECoG ermöglicht es Forschern, verteilte neuronale Dynamiken zu untersuchen, die mit komplexer sensorischer Verarbeitung, kognitiven Funktionen und motorischem Verhalten in Tiermodellen verbunden sind^12,13. Jüngste Fortschritte haben μECoG mit Optogenetik und laminaren Polytrodenaufzeichnungen integriert 14,15,16,17,18,19,20, was multiskalige Untersuchungen kortikaler Netzwerke ermöglicht und die Lücke zwischen mikroskaliger neuronaler Aktivität und makroskaliger kortikaler Dynamik schließt ^21,22. Entscheidend ist, dass die Verwendung von μECoG die Translation von Ergebnissen und Erkenntnissen aus Tiermodellen auf den Menschen viel direkter macht, da das μECoG-Signal in menschlichen und nicht-menschlichen Tiermodellen sehr ähnlich ist²³. Daher sind integrative Ansätze entscheidend für ein besseres Verständnis neuronaler Schaltkreise und vielversprechend für die Entwicklung neuartiger therapeutischer Interventionen für neurologische Erkrankungen ^5,24,25.

Folglich besteht ein wachsender Bedarf an Protokollen, die μECoG-Arrays mit hoher Dichte mit laminaren Aufzeichnungen und optogenetischen Werkzeugen integrieren, um umfassende Multiskalenuntersuchungen der kortikalen Prozessierung zu ermöglichen ^8,26. Um diese Lücke zu schließen, haben wir kundenspezifische μECoG-Bauelemente mit 128 niederohmigen Elektroden mit 40 μm Elektrodendurchmesser und 20 μm Elektrodenabstand auf einem flexiblen, transparenten Polymersubstrat (Parylen-C und Polyimid) mit Perforationen zwischen den Elektroden entwickelt, die gleichzeitige μECoG- und laminare Polytrodenaufzeichnungen mit optogenetischen Manipulationen ermöglichen^13,22. Zu den wichtigsten Aspekten dieses experimentellen Protokolls gehören: (i) säulenförmige räumliche Auflösung und großräumige Abdeckung der kortikalen Aktivität durch μECoG-Arrays mit hoher Dichte; (ii) die Fähigkeit, aus mehreren kortikalen Schichten mit laminaren Polytroden aufzuzeichnen, die durch das μECoG-Gitter eingefügt werden; und (iii) die Einbeziehung optogenetischer Techniken zur selektiven Aktivierung oder Hemmung spezifischer neuronaler Populationen, wodurch eine kausale Dissektion neuronaler Schaltkreise ermöglicht^wird 27,28,29. Die Konfiguration mit hoher Dichte ermöglicht Aufzeichnungen mit hoher räumlicher Auflösung und bietet effektiv eine "säulenförmige Ansicht" der kortikalen Aktivität, da frühere Studien gezeigt haben, dass μECoG-Signale die Aktivität auf einer räumlichen Skala auflösen können, die mit dem Durchmesser der kortikalen Säule von Nagetieren (~20 μm) vergleichbar ^ist11. Diese integrierte Methodik ermöglicht die gleichzeitige Überwachung und Manipulation der neuronalen Aktivität auf mehreren Skalen, was möglicherweise kausale Experimente zur Bestimmung der neuronalen Quellen von μECoG-Signalen sowie zur verteilten kortikalen Verarbeitung ermöglicht. Um diese Ziele zu erreichen, enthält dieses Manuskript detaillierte Protokolle für die Verwendung von μECoG-Arrays mit hoher Dichte in zwei Kombinationen.

Zunächst beschreiben wir μECoG in Kombination mit der Manipulation von Pyramidenzellen der Schicht 5 (L5) im primären somatosensorischen Kortex der Maus (S1). In der Maus wird das μECoG-Array epidural platziert (aufgrund der chirurgischen Hartnäckigkeit der Durotomie bei Mäusen). Eine optische Faser wird über dem Gitter positioniert oder mit einer Linse kombiniert, um das optogenetische Licht auf einen kleinen Zielbereich der kortikalen Oberfläche zu fokussieren. Die optogenetische Strategie wird hier für die Hemmung von erregenden Neuronen der Schicht 5 beschrieben, kann aber ohne weiteres an jede Population von Neuronen angepasst werden, die mit der entsprechenden, populationsspezifischen, Cre-exprimierenden Mauslinie versehen sind. Zweitens beschreiben wir die kombinierte Verwendung von μECoG mit laminaren Siliziumpolytroden zur gleichzeitigen Aufzeichnung von kortikalen Oberflächenpotentialen (CSEPs) und der Spike-Aktivität mehrerer Neuronen über kortikale Schichten aus dem auditorischen Kortex der Ratte (A1). Das Array verfügt über Perforationen zwischen den Elektroden, die das Einführen von laminaren Mehrkanalpolytroden durch das Gitter ermöglichen, um die neuronale Aktivität über verschiedene kortikale Schichten hinweg aufzuzeichnen. Während der Kraniotomie wird das μECoG-Array subdural über der auditorischen Rinde platziert und die laminare Polytrode durch die Perforationen eingeführt. Neuronale Signale von der μECoG- und der laminaren Sonde werden gleichzeitig aufgezeichnet und bei 6 kHz bzw. 24 kHz abgetastet, wobei ein Verstärkersystem verwendet wird, das optisch mit einem digitalen Signalprozessor verbunden ist.

Protokoll

Beide Protokolle folgen den gleichen Schlüsselschritten (Anästhesie, Fixierung, Kraniotomie, μECoG-Aufzeichnung), weisen jedoch bemerkenswerte Unterschiede auf. In der folgenden Beschreibung werden die freigegebenen Schritte zusammengeführt, während die Besonderheiten der einzelnen Protokolle mit Anmerkungen versehen sind. Die folgenden Schritte entsprechen der μECoG-Aufzeichnung mit Optogenetik (Maus) oder der μECoG-Aufzeichnung mit einer laminaren Sonde (Rat). Alle hier beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den lokalen Ethik- oder Rechtsbehörden (IACUC oder Ethikkommissionen) durchgeführt. Die verwendeten Medikamente können je nach genehmigtem ethischem Protokoll variieren.

1. Vorbereitung und Protokoll für Verfahren an Mäusen und Ratten

1. Bemerkenswerte Unterschiede zwischen Maus- und Rattenprotokollen
   1. Setups für Chirurgie versus elektrophysiologische Aufzeichnungen
      1. Verwenden Sie bei einer Ratte sowohl bei der Operation als auch bei elektrophysiologischen Aufzeichnungen das gleiche Setup.
      2. Bei einer Maus führen Sie die Operation im ersten Setup und elektrophysiologische Aufzeichnungen im zweiten Setup durch.
   2. Fixierung des Kopfes
      1. Verwenden Sie bei einer Ratte die gleiche Schnauzenklemme für Operationen und elektrophysiologische Aufzeichnungen.
      2. Verwenden Sie für eine Maus eine Schnauzenklemme für die Operation und eine externe Metallkopfstange im Aufbau für die Elektrophysiologie, um die Fixierung unter leichter Isofluran-Anästhesie zu ermöglichen. Implantieren Sie die Kopfstange mit Zahnzement auf den Schädel.
   3. Aufnahme-Setup: Verwenden Sie eine unterschiedliche Erfassungselektronik, Aufnahmesoftware und sensorische Stimulationssoftware für die beiden Spezies.
      1. Verwenden Sie für das Mausprotokoll das SpikeGadgets-System (https://spikegadgets.com) und die Open-Source-Software Trodes (https://spikegadgets.com/trodes/) für die Datenerfassung.
      2. Verwenden Sie für das Rattenprotokoll die Aufzeichnungssoftware Synapse - Neurophysiology Suite (https://www.tdt.com/component/synapse-software/) für die Datenerfassung.
   4. Induzieren Sie eine Anästhesie durch Injektion (Ratte) oder Inhalation (Maus).
   5. Aufnahmeort
      1. Führen Sie Aufzeichnungen im somatosensorischen Kortex (S1) für eine Maus durch.
      2. Führen Sie Aufnahmen im primären auditorischen Kortex (A1) für eine Ratte durch.
         HINWEIS: Dieser Unterschied in der anatomischen Lokalisation erfordert für jede Spezies unterschiedliche Kraniotomiestellen.
2. Vorbereiten und Testen des Netzes
   1. Weichen Sie das Gitter (mit Ausnahme der Anschlussplatine) mindestens 1 h lang in einem verdünnten enzymatischen Reinigungsmittel (50 % Reinigungsmittel, 50 % destilliertes Wasser) ein.
   2. Geben Sie es in ein Bad mit reinem destilliertem Wasser und lassen Sie es an einem sicheren, sauberen Ort an der Luft trocknen.
   3. Führen Sie die platinschwarze Elektroabscheidung als Teil der Erstvorbereitung des μECoG-Geräts durch, nicht vor jeder Aufnahmesitzung.
      HINWEIS: Nach dem Abscheiden bildet die Platinum Black-Beschichtung eine stabile Schicht, die für mehrere Aufnahmen wirksam bleibt, obwohl ihre Leistung durch regelmäßige Impedanztests überwacht werden sollte. Die Platinschwarz-Elektroabscheidung (Zielbereich von 10-20 kΩ bei 1 kHz) verringert die Elektrodenimpedanz und verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis bei neuronalen Aufzeichnungen.
   4. Um die Elektroabscheidung durchzuführen, wird eine Chlorplatinsäurelösung (typischerweise 1-3 % Chlorplatinsäure [H2PtCl6]) hergestellt, die eine kleine Menge Bleiacetat (ca. 0,005 %) als Abscheidungsmodifikator enthält. Verbinden Sie die μECoG-Elektroden als Arbeitselektrode in einer elektrochemischen Zelle mit drei Elektroden mit einer Platin-Gegenelektrode und einer Ag/AgCl-Referenzelektrode.
   5. Wenden Sie eine konstante Stromdichte von ca. -0,5--2 mA/cm² für 10-30 s an, während Sie die Impedanzwerte überwachen.
   6. Testen und erfassen Sie die Impedanz von Gitterelektroden (z. B. mit einem Nano-Z).
   7. Überprüfen Sie das Gitter über einer Lichtquelle und bereiten Sie das Gitter für die Verwendung in der postoperativen Aufzeichnung vor.
3. Löten von Referenzkabeln
   1. Bei einer Maus löten Sie das Ende eines Silberdrahtes (10 mm lang, 30 G) an einen Goldstift für den Anschluss an das Referenzkabel des Aufnahmesystems.

2. Chirurgie

1. Aufbereitung der Materialien und allgemeine Überwachung (Tierpflege und -erfassung)
   1. Vorbereitung: Reinigen und desinfizieren Sie das Operationsgebiet gründlich mit einem geeigneten Desinfektionsmittel. Stellen Sie sicher, dass alle chirurgischen Instrumente sterilisiert sind, in der Regel mit einem Autoklaven.
   2. Platzierung des chirurgischen Werkzeugs: Ordnen Sie die chirurgischen Instrumente auf der sterilen OP-Auflage an. Bestücken Sie den Operationsbereich mit Applikatoren mit Wattespitze und saugfähigen chirurgischen Dreiecken aus Baumwolle. Entsorgen Sie alle biologisch gefährlichen Abfälle in einem speziellen Entsorgungsbeutel.
   3. Temperaturregelung: Schalten Sie das Heizkissen an der chirurgischen und elektrophysiologischen Aufnahmestelle ein. Kontrollieren Sie die Temperatur des Heizkissens während der Operation und der Aufzeichnung.
   4. OP-Pad: Legen Sie eine blaue OP-Binde oder -Decke über das Temperaturregulationsbett.
      HINWEIS: Dieses Pad sollte eine weiche weiße Baumwollunterseite haben, die nach oben zeigen sollte.
   5. Positionierung des Mikroskops: Bereiten Sie das Mikroskop und die daran befestigte Beleuchtung (z. B. LED-Ring) auf eine Seite des Operationsfeldes vor. Überprüfen Sie, ob es ordnungsgemäß funktioniert.
   6. Chirurgischer Bohrer: Bereiten Sie den chirurgischen Bohrer für den Kraniotomieeingriff vor.
   7. Sauerstoffversorgung: Stellen Sie die Durchflussrate des Sauerstofftanks auf 1,0 l/min (Ratte) oder 0,5 l/min (Maus) ein und platzieren Sie die Sauerstoffmaske in der Nähe des Regelkissens. Das Tier benötigt nach der Anästhesie kontinuierlich Sauerstoff.
   8. Flüssigkeitsaustausch: Während der gesamten Operation sollte der Flüssigkeitsverlust mit dem Ziel eines Ersatzes von mindestens 1,5 % des Körpergewichts des Tieres (Maus) oder 1 ml pro Stunde (Ratte) ersetzt werden. Bereiten Sie isotonische Lösungen entsprechend vor.
   9. Tier: Bringen Sie das Tier gemäß den genehmigten Verfahren aus der Tierhaltung in den Operationssaal. Verwendung von Mäusen im Alter von 8 bis 16 Wochen, entweder männlich oder weiblich, mit C57Bl6-Hintergrund; Verwenden Sie ebenfalls Ratten im Alter von 7 Wochen, männliche Ratten des Sprague Dawley-Stammes.
   10. Zubereitung von Medikamenten: Wiegen Sie das Tier mit einer Waage mit einer Genauigkeit von 0,1 g. Bereiten Sie die entsprechenden Arzneimittelmengen für die Operation vor, gegebenenfalls mit vorverdünnten Lösungen.
2. Induktion der Anästhesie
   1. Anästhesieeinleitung für eine Maus
      1. Setzen Sie das Tier in die Isofluran-Induktionskammer (3-5 % Isofluran in 0,5 l/min O₂).
      2. Sobald die Tiefenanästhesie bestätigt ist (kein Reflex beim Einklemmen des Schwanzes/Zehe), legen Sie das Tier auf das chirurgische Heizkissen und fixieren Sie es mit dem Kopf.
      3. Injizieren Sie subkutane Arzneimittel zur allgemeinen Analgesie: Meloxicam: 5 mg/kg und Buprenorphin: 0,1 mg/kg.
      4. Fixieren Sie die Maus mit den Schritten 2.2.1.5-2.2.1.6.
      5. Legen Sie die Schnauze in die Anästhesiemaske und den Kopf locker in die Kopfhalterung. Um die Maus in die Beißstange zu legen, stellen Sie zunächst sicher, dass sich die Zunge unter dem Stab und nicht zwischen dem Stab und dem Gaumen befindet. Benutze bei Bedarf eine Pinzette, um die Zunge zu bewegen.
      6. Führen Sie die Schneidezähne des Tieres in das Loch an der Stange der Beißstange ein. Sichern Sie die Mausanästhesiemaske (1,5-2% Isofluran in 0,5 L/min O₂), indem Sie die Fixierschraube vorsichtig anziehen. Die Stabilisierung des Kopfes während der Operation wird allein durch die Beißstange gewährleistet.
      7. Schützen Sie die Augen des Tieres mit einer Augensalbe oder einem Gleitmittel auf Erdölbasis, um ein Austrocknen während der Operation zu verhindern.
      8. Halten Sie die Anästhesie während des gesamten Eingriffs mit einem kontinuierlichen Fluss von Isofluran durch die Maske aufrecht.
   2. Anästhesieeinleitung für eine Ratte
      1. Verwenden Sie zunächst Isofluran, um das Tier zu sedieren, um die Injektion der Induktionsanästhesie zu erleichtern.
      2. Verabreichen Sie die Medikamente für die Anästhesie und Analgesie:
         Meloxicam: Dosierung von 5 mg/kg, Konzentration 10 mg/ml, 0,4 mL/kg
         Ketamin: Dosierung von 90 mg/kg, Konzentration 100 mg/ml, 0,9 mL/kg
         Xylazin: Dosierung von 10 mg/kg, Konzentration 100 mg/ml, 0,1 ml/kg
      3. Lassen Sie das Tier innerhalb von 15-30 Minuten eine tiefe Narkose erreichen, je nach Gewicht und Alter.
   3. Überwachung der Anästhesie
      1. Überwachen Sie während des gesamten Eingriffs kontinuierlich die Vitalwerte (Atemfrequenz) des Tieres. Überprüfen Sie die Atemfrequenz als besonders nützliches Zeichen für frühe Veränderungen des Anästhesiezustands und passen Sie das Anästhesieniveau an, wenn sich die Atemfrequenz ändert.
      2. Der Rückzugsreflex der Pfote ist ein kritisches Zeichen für den Narkosezustand. Testen Sie diesen Reflex regelmäßig, da sein völliges Fehlen ein ausreichendes Maß an Anästhesie für die Operation gewährleistet.
3. Fixierung des Kopfes und Überwachung der Vitalparameter
   1. Überwachung der Vitalwerte von Tieren
      1. Überprüfen und notieren Sie die Vitalparameter des Tieres auf einem Versuchsblatt. Wenn die Reflexe des Tieres (z. B. Pfotenentzug) nicht vollständig erloschen sind, verabreichen Sie eine zusätzliche halbe Dosis zusätzliches Ketamin (Ratte) oder erhöhen Sie die Isoflurankonzentration in Schritten von 0,5 % (Maus).
   2. Kopffixierung für eine Ratte
      1. Sobald die Ratte vollständig betäubt ist (keine Pfoten- oder Schwanzreflexe), führen Sie die Schneidezähne des Tieres in das Loch an der Stange der Kopfhalterung ein.
      2. Führen Sie die Spitzen der Montagearme vorsichtig in den Nasenkamm ein, um den Kopf während der Operation zu fixieren, und stellen Sie sicher, dass er nicht mit den Augen in Berührung kommt.
      3. Stellen Sie den Winkel der Arme ein, bis der Gaumen des Tieres fest gegen die Stange gedrückt wird. Stellen Sie sicher, dass der Schädel unter Druck unbeweglich bleibt.
      4. Sichern Sie beide Arme der Halterung, indem Sie die Schrauben mit einem Inbusschlüssel festziehen.
   3. Sauerstoffaufbau für eine Ratte
      1. Befestigen Sie den Kunststoffschlauch vom Sauerstofftank über der Schnauze und der Nase des Tieres und befestigen Sie ihn mit chirurgischem Klebeband. Vermeiden Sie Falten in den Schläuchen, die den Luftstrom behindern könnten. Stellen Sie den Sauerstofftank auf eine Durchflussmenge von 1 l/min ein.
         HINWEIS: Die Vitalwerte des Tieres, einschließlich Herzfrequenz und Atemfrequenz, sollten während des gesamten Eingriffs in Abständen von 15 bis 30 Minuten überprüft werden.
4. Schnitt an der Kopfhaut
   1. Rasur und Vorbereitung
      1. Rasieren Sie den Bereich von der oberen Schnauze bis zum Hinterkopf, der sich von einem Auge zum anderen und um die Ohren erstreckt. Entfernen Sie den Großteil des Fells mit einer Schere oder einer elektrischen Schermaschine und tragen Sie dann Enthaarungscreme auf.
   2. Desinfektion
      1. Desinfizieren Sie den Bereich mit einem in Betadine getränkten Wattestäbchen und spülen Sie ihn dann mit einem Wattestäbchen ab, das in 70 % Ethanol getränkt ist. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal und beenden Sie ihn mit einer abschließenden Betadine-Anwendung, um sicherzustellen, dass der Bereich steril ist.
   3. Injektion von Lokalanästhetika
      1. Injizieren Sie das Lokalanästhetikum Lidocain (1 %, 0,1 ml für Maus / 0,4 ml pro kg für Ratte) subkutan in die Mittellinie der Kopfhaut des Tieres. Massieren Sie sanft die Kopfhaut, um das Lidocain zu verteilen, und warten Sie 5 Minuten, bis das Anästhetikum einwirken kann.
   4. Einschnitt
      1. Bei einer Maus heben Sie mit einer Pinzette einen Punkt auf der Haut an und resezieren Sie einen kleinen Hautabschnitt (ca. 1 cm Durchmesser) mit einer chirurgischen Schere.
      2. Bei einer Ratte machen Sie mit dem Skalpell einen präzisen Schnitt auf der vorderen Seite der Kopfhaut, direkt über der Nase, an der Mittellinie. Ziehe die Haut vorsichtig zurück und mache einen geraden Schnitt zwischen den Augen bis zur Schädelbasis. Heben Sie die Kopfhaut vorsichtig an, schneiden Sie das Bindegewebe ab und legen Sie den Schädel vollständig frei.
      3. Legen Sie die Kraniotomiestelle frei, indem Sie die Schritte 2.4.4.4-2.4.4.5 befolgen.
      4. Mit einem Schaber das Bindegewebe und die Knochenhaut auf der Schädeldecke entfernen. Spülen Sie die Kochsalzlösung und verwenden Sie eine Aspiration oder einen chirurgischen Schwamm, um die Stelle zu reinigen.
      5. Verwenden Sie chirurgische Clips an den Hauträndern, um eine klare Freilegung der Schädelregion zu ermöglichen, in der die Kraniotomie durchgeführt wird.
5. Kraniotomie
   1. Allgemeines Bohrverfahren
      1. Stellen Sie die chirurgische Bohrerdrehzahl auf eine niedrige Einstellung von 5000 U/min oder 7000 U/min für erfahrene Chirurgen ein. Führen Sie alle Bohrungen durch, während Sie durch das Mikroskop visualisieren.
      2. Halten Sie den Bohrer parallel zur Schädeloberfläche und legen Sie ihn sanft an die Oberfläche.
      3. Beginnen Sie mit leichtem Druck auf das Pedal mit dem Bohren an einer einzigen Stelle. Führen Sie Bohrungen in kurzen Intervallen (5-10 s) mit häufigen Überprüfungen auf Veränderungen der Knochenfarbe durch.
         HINWEIS: Der Knochen beginnt undurchsichtig weiß zu werden, und wenn das Loch tiefer wird, wird es durchscheinender und zeigt einen rosa Farbton.
      4. Wenn die Bohrung in die Nähe des Gehirns gekommen ist, verlangsamen Sie die Bohrung und suchen Sie nach Anzeichen von Feuchtigkeit, die in das Loch eindringt. Wenn das Loch dunkelrosa ist und leicht glänzt, hören Sie auf zu bohren. Mit einer kurzen 30-G-Nadel die verbleibende Knochenschicht vorsichtig durchstechen. Klare Flüssigkeit sollte aus dem neuen Loch austreten.
   2. Bohrverfahren für eine Maus
      1. Um eine Referenzelektrode für physiologische Aufzeichnungen zu platzieren, bohren Sie ein Bohrloch in den vorderen Teil der Hemisphäre ipsilateral zum aufgezeichneten Bereich.
      2. Definieren Sie die Kontur der Kraniotomie, indem Sie einen flachen Graben an seinem Rand bohren. Beginnen Sie in der medio-lateralen Achse mit dem lateralen Knochenkamm als Referenz und zeichnen Sie ein 4 mm langes Fenster nach.
      3. Bohren Sie in der antero-posterioren Achse ein 3 mm Fenster beginnend ~ 1 mm vor dem hinteren Knochenkamm. Die endgültige Größe der offenen Kraniotomie beträgt ca. ein Fenster von 4 x 3 mm.
   3. Bohrverfahren für eine Ratte
      1. Bohren Sie zwei Löcher: eines im linken hinteren Quadranten, das andere im rechten vorderen Quadranten.
      2. Injizieren Sie dem Kaumuskel eine zweite Dosis Lidocain (0,4 ml/kg bei 10 mg/ml) und verteilen Sie sie gleichmäßig an der Stelle, an der der Schnitt gemacht werden soll.
      3. Resezieren Sie nur die minimalen Muskeln, die erforderlich sind, um den Kraniotomiebereich freizulegen.
      4. Erstellen Sie mit einer frischen #10 Skalpellklinge einen quer verlaufenden dorsal-ventralen Schnitt in das Muskelbündel über dem Kiefer des Tieres (rechte Seite). Halten Sie den hinteren Rand des Schnitts mit einer Greifzange fest und schälen Sie sich vom Schädel ab, während Sie entlang des knöchernen Kamms des Wangenknochens schneiden. Auf diese Weise kann der Muskel mit minimalen Blutungen vom Knochen gelöst werden.
      5. Sezieren Sie den vorderen Muskel auf ähnliche Weise, bis eine Fissurenlinie im Schädel sichtbar wird. Diese Linie bildet die vordere Grenze des Kraniotomiefensters.
      6. Befreien Sie den Muskel um den hinteren Kamm mit dem Skalpell und der Pinzette unter Verwendung einer starken Lichtquelle, um Schnitte in stark vaskularisierte Regionen zu vermeiden.
      7. Schleifen Sie den hinteren Kamm mit dem Bohrer ab, bis er nicht mehr über die Schädeloberfläche hinausragt.
         HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, um das μECoG-Gitter so abzusetzen, dass es direkten Kontakt mit der kortikalen Oberfläche hat.
      8. Bohren Sie den dorsalen Rand des Fensters direkt über dem Kamm, an dem der resezierte Muskel befestigt war. Platzieren Sie die hintere Kante vor dem aufgebohrten hinteren Kamm. Platzieren Sie den vorderen Rand hinter der Fissurenlinie, die sich in der Nähe der Augenhöhle nach unten erstreckt.
         HINWEIS: Bei der Reinigung des vorderen Muskels muss darauf geachtet werden, das Auge zu vermeiden.
6. Kraniotomie Fensterbohren
   1. Bohren des Kraniotomiefensters (Tipps)
      1. Achten Sie beim Bohren darauf, dass der Bohrer parallel zur Schädeloberfläche gehalten wird. Wenden Sie so wenig Kraft wie möglich an und verwenden Sie den Bohrer wie eine Bürste, indem Sie den Bohrer leichten Kontakt mit dem Schädel herstellen lassen, während Sie kurze, sich wiederholende Bewegungen entlang der vorgesehenen Kraniotomielinie ausführen.
         HINWEIS: Bei Ratten hat die hintere Kante des Fensters den dicksten Knochen. Wenn zu weit nach hinten gebohrt wird, kann der Knochen eine schuppige, "knusprige" Qualität aufweisen, die die Messung des Bohrfortschritts erschwert. Bei falscher Platzierung kann dieser Knochenbereich eine aderrote Färbung aufweisen, die einen falschen Eindruck der Nähe zum Gehirn erweckt.
      2. Bohren Sie jede Seite des Kraniotomiefensters, bis der Knochen blassrosa erscheint und eine dünne weiße Fissur oder einen Riss entlang seiner Länge verläuft. Üben Sie leichten Druck aus; Der Knochen sollte ein deutliches "Wackeln" erzeugen, wenn er vollständig gebohrt ist. Wenn der Riss unzusammenhängend erscheint, bohren Sie leicht weiter, bis eine durchgehende Linie erreicht ist.
   2. Entfernung des ausgedünnten Schädels innerhalb des Kraniotomiefensters
      1. Wenn der Schädel so ausgedünnt ist, dass durch extrem leichten Druck das ganze Fenster sichtbar wackelt, entfernen Sie den ausgedünnten Schädel.
      2. Spülen Sie die Kraniotomiestelle mit einem Tropfen Kochsalzlösung und warten Sie mindestens 1 min. Dies schwächt den ausgedünnten Knochen und hilft dem Knochen, sich von der Dura zu lösen. Überschüssige Kochsalzlösung mit einem saugfähigen Wattedreieck oder Vakuum abtropfen lassen.
      3. Heben Sie den ausgedünnten Schädel vorsichtig mit einer Pinzette an, um eine Beschädigung des darunter liegenden Gewebes zu vermeiden.
      4. Verwende einen hämostatischen Schwamm, um das Gehirn feucht zu halten.
      5. Fassen Sie das Fenster an der dorsalen und ventralen Seite mit einer Zahnzange fest und ziehen Sie es direkt vom Schädel weg. Wenn es Schwierigkeiten gibt, das Fenster aus der Baustelle zu ziehen, stoppen Sie das Bohren und setzen Sie das leichte Bohren fort, bis der Knochen ausreichend geschwächt ist.
      6. Lassen Sie bei μECoG-Aufnahmen der Maus die Dura intakt.
7. Zement- und Kopfpfostenimplantat für eine Maus
   1. Führen Sie das Referenzkabel ein und sichern Sie es.
      1. Führen Sie das Ende des Silberdrahtes ~1 mm in das Bohrloch ein, genug, um die Oberfläche des Gehirns zu berühren, aber keine Blutungen zu verursachen.
      2. Tragen Sie den Zahnzement auf, während Sie die erste Schicht auftragen.
   2. Herstellung von Zahnzement
      1. Verwenden Sie eine abgekühlte Keramikmischschale, um die Zahnzementmischung zuzubereiten. Dieser Zement verdickt sich schnell und erfordert die regelmäßige Zubereitung einer neuen Mischung. Wischen Sie die Mischschale sauber, bevor Sie eine neue Mischung zubereiten.
         HINWEIS: Der Zement sollte niemals in direktem Kontakt mit dem Gehirn stehen.
   3. Auftragen der ersten Schicht
      1. Tragen Sie die erste Zementschicht um den Kraniotomie und über den gesamten Schädel mit Mikroapplikatoren auf. Diese Schicht fungiert als elektrische Isolierung zwischen dem Schädel und der Metallkopfstange.
      2. Die Kraniotomie vollständig mit Zement umgeben, einschließlich der lateralen Abdeckung, um einen ausreichenden Schutz der offenen Kraniotomie und des μECoG-Gitters zu gewährleisten.
   4. Positionierung der Metallkopfstange
      1. Befestigen Sie den großen Teil der Kopfstange an der Halterung, ohne sie vollständig festzuziehen.
      2. Positionieren Sie die Kopfstange wie gewünscht und legen Sie den dünnen Abschnitt entlang der Schädelmittellinie in Kontakt mit der Zementoberfläche.
   5. Sicherung des Implantats
      1. Decken Sie die Kopfstange mit Zahnzement ab und verbinden Sie sie mit der Zementoberfläche.
   6. Entfernen der Halterung
      1. Warten Sie einige Minuten, bis sich der Zahnzement festigt hat.
      2. Sobald die Kopfstange vollständig befestigt ist, entfernen Sie sie, indem Sie zuerst die Schraube aus der Halterung entfernen. Ziehen Sie dann den Halter nach hinten ein und stellen Sie sicher, dass keine Kraft auf die Kopfstange ausgeübt wird.
8. Durotomie bei der Rattenchirurgie
   HINWEIS: Dies ist ein schwieriger chirurgischer Schritt.
   1. Anheben der Dura
      1. Heben Sie mit der Pinzette Nr. 5, die so parallel wie möglich zur Gehirnoberfläche gehalten wird, einen kleinen Teil der Dura vom Gehirn weg.
      2. Verwenden Sie eine frische 30 G Nadel (so kurz wie möglich), um die angehobene Dura vorsichtig zu zerreißen.
         HINWEIS: Die Dura mater ist eine dünne, transparente Gewebeschicht, die direkt auf dem Gehirn liegt. Es wird für μECoG-Aufzeichnungen bei Ratten entfernt. Es ist wichtig, die Durotomie durchzuführen, ohne das Gefäßsystem auf der Gehirnoberfläche zu stören. Zu den empfohlenen Methoden für die Durchführung der Durotomie gehören die Verwendung einer Pinzette und einer Spritzennadel, um die Dura zu punktieren, bevor sie zurückgezogen wird, oder die Verwendung eines Duratomwerkzeugs, das in der Nähe des Schädels verankert ist, um die Dura vorsichtig zurückzuziehen.
   2. Resektion der Dura
      1. Greifen Sie die Dura weiterhin mit der Pinzette und heben Sie sie vom Gehirn weg. Erzeugen Sie mit der Nadel beim Heben einen diagonalen Riss.
      2. Verwenden Sie die Pinzette, um die Dura vorsichtig zu den Seiten des Kraniotomiefensters zu schälen, um sicherzustellen, dass die Gehirnoberfläche ungestört bleibt.
9. Übergabe der Maus an das Setup für die elektrophysiologische Aufzeichnung
   1. Nehmen Sie das Tier aus der Operationseinrichtung, indem Sie die Schnauze und die Schneidezähne vorsichtig von der Schneidestange anheben und dann das Tier zurückziehen. Injizieren Sie Chlorprothixen (1 mg/kg, intraperitoneal [IP]), ein Beruhigungsmittel, das eine kontinuierliche Anästhesie mit einer niedrigeren Isoflurankonzentration ermöglicht.
   2. Platzieren Sie die Maus in der elektrophysiologischen Aufzeichnung.
      1. Vergewissern Sie sich, dass das Heizkissen an seinem Platz sitzt und ordnungsgemäß funktioniert.
      2. Befestigen Sie das Tier mit dem Kopf an der Halterung im elektrophysiologischen Aufbau.
      3. Bringen Sie die Isofluran-Maske in die Nähe, um die Schnauze des Tieres vollständig zu bedecken.
   3. Anpassung der Anästhesie
      1. Reduzieren Sie den Anästhesiespiegel allmählich auf 0,7-1 % Isofluran (in Schritten von maximal 0,5 % alle 5 Minuten).
      2. Überwachen Sie die Atemfrequenz und die Bewegungen des Tieres.
         HINWEIS: Die Atemfrequenz sollte im Vergleich zum chirurgischen Zustand leicht ansteigen, aber das Tier sollte sich nicht bewegen.
      3. Wenn sich das Tier bewegt, erhöhen Sie die Isoflurankonzentration sofort auf 2 %, bevor Sie sie langsam in Schritten von 0,5 % auf ein niedrigeres Niveau zurückbringen.
   4. Einfügen von Schnurrhaaren zur sensorischen Stimulation
      1. Befestigen Sie die Vibrissen der Maus an dem Schnurrhaarstimulationsgerät. In diesem Protokoll werden neun Vibrissen in kurze 10-μl-Pipettenspitzen eingeführt, die mit piezoelektrischen Aktuatoren verbunden sind, die für eine schnelle Ablenkung der Vibrissen sorgen.

3. Aufnahme

1. Installation des Gitters
   1. Vorbereitende Schritte
      1. Schalten Sie das Aufnahmesystem und den Verstärker ein.
      2. Überprüfen Sie die Vitalfunktionen des Tieres.
   2. Verfahren
      1. Um das Tier und die Werkzeuge zu positionieren, befolgen Sie die Schritte 3.1.2.2 bis 3.1.2.4.
      2. Platzieren Sie das Tier in der Aufnahmeeinrichtung und stellen Sie sicher, dass die Kraniotomie feucht bleibt, indem Sie regelmäßig eine Kochsalzlösung auftragen.
      3. Positionieren Sie den Mikromanipulator bei einer Ratte auf dem Geländer des Bohrgeräts, das sich weit hinter der Kraniotomiestelle befindet, um Störungen zu vermeiden.
      4. Platzieren Sie bei einer Maus den Mikromanipulator seitlich an der Kraniotomiestelle neben dem Tier.
      5. Um das Raster an einer Maus anzubringen und zu positionieren, führen Sie die Schritte 3.1.2.6-3.1.2.12 aus.
      6. Befestigen Sie das μECoG-Gitter mit den ZIF-Clip-Verbindern (Headstage-Stecker) an der Kopfbühne. Halten Sie die Elektronikplatine des Kopftisches über eine mechanische Stange, die an einem Mikromanipulator befestigt ist, an Ort und Stelle.
      7. Senken Sie das μECoG-Gitter horizontal ab, um es flach über der Kraniotomie entlang der anteroposterioren Achse auszurichten.
         HINWEIS: Entlang der lateral-medialen Achse sollte sich die Kante des Gitters in der Nähe des medialen Randes der Kraniotomie befinden.
      8. Sobald das Gitter in der Nähe des Gehirns positioniert ist, aber nicht in Kontakt mit ihm steht, befestigen Sie den Referenzdraht des Gitters an dem implantierten Silberdraht-Goldstift. Befestigen Sie bei Bedarf das Erdungskabel am Tier (z. B. an einem nicht bedeckten Muskel), um elektrische Störungen zu reduzieren.
      9. Senken Sie außerdem das Gitter ab, um mit dem Gehirn in Kontakt zu treten.
      10. Bewegen Sie das Gitter seitlich, um über die feuchte Dura-Oberfläche zu "gleiten". Fahren Sie mit der Anpassung fort, bis das Gitter entlang der mediolateralen Achse zentriert ist.
      11. Verwenden Sie eine Aspiration oder einen chirurgischen Schwamm an den Rändern der Kraniotomie, um überschüssige Kochsalzlösung zu entfernen.
      12. Sobald die Zubereitung etwas trockener ist, stellen Sie sicher, dass der Rost fester an der Dura haftet und nicht über deren Oberfläche rutscht. Wenn es trockener ist, üben Sie eine seitliche bis mediale Bewegung auf das flexible Gitter aus, wobei Sie den Kontakt mit den seitlichsten Elektroden sicherstellen. Das flexible Kabel des Gitters biegt sich auf natürliche Weise, um sich der Kontur des Gehirns anzupassen.
      13. Um das Gitter auf einer Ratte zu positionieren, befolgen Sie die Schritte 3.1.2.14-3.1.2.18.
      14. Befestigen Sie den Stiel der Haltegabel im Mikromanipulator und stellen Sie sicher, dass die Verbindungsplatine des Gitters beim Absenken an der hinteren Seite des Kraniotomiefensters schwebt.
      15. Passen Sie die Position des Mikromanipulators am Geländer so an, dass sich das Gitter ungefähr über der Kraniotomiestelle befindet. Senken Sie das Gitter ab, bis es dicht über der Gehirnoberfläche schwebt. Befeuchten Sie die Gehirnoberfläche mit einem kleinen Tropfen Kochsalzlösung.
      16. Führen Sie diese Schritte mit dem Mikroskop durch. Stellen Sie mit den Drehreglern des Mikromanipulators die Position des Gitters so ein, dass es flach auf der Gehirnoberfläche in der Mitte der Kraniotomie anliegt.
      17. Leiten Sie Feuchtigkeit vorsichtig mit einem saugfähigen Baumwolldreieck ab, ohne das Gitter selbst zu berühren. Stellen Sie sicher, dass jede Reihe des Gitters in Kontakt mit der Gehirnoberfläche ist.
          HINWEIS: Das Entfernen von Feuchtigkeit verhindert die passive Ausbreitung des elektrischen Signals durch die Flüssigkeit zwischen der kortikalen Oberfläche und dem Gitter, wodurch das an der Elektrode gemessene Signal räumlich gestreut wird.
      18. Führen Sie mit der Pinzette Nummer 2 oder Nummer 5 den Erdungsdraht des Gitters in dasselbe Bohrloch ein oder führen Sie den Referenzdraht in ein Bohrloch und den Erdungsdraht in das nahe gelegene Muskelgewebe ein.
          HINWEIS: Drähte sollten nur ~1 mm eingeführt werden, genug, um das Gehirn zu kontaktieren, aber keine Blutungen oder Traumata im Gehirn zu verursachen.
2. Überprüfen der Positionierung des Rasters
   1. Überwachung der elektrophysiologischen Aktivität
      1. Beobachten Sie die elektrophysiologische Aktivität mit der Aufzeichnungssoftware. Unter Lichtnarkose sind die Gehirnsignale variabel und können eine Vielzahl von Mustern aufweisen.
      2. Der ordnungsgemäße Anschluss des Gitters, der Referenz- und Erdungskabel sollte ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis mit Signalamplituden im mV-Bereich ergeben. Überwachen Sie das Rauschen im Hochfrequenzbereich mithilfe von Bandpassfiltern mit Trodes (z. B. 100-6000 Hz) und stellen Sie sicher, dass es einige Dutzend Mikrovolt (μV) nicht überschreitet.
   2. Beurteilen Sie die sensorische Reaktionsfähigkeit anhand von Geräuschen (z. B. Klatschen oder Fingerschnippen), um sichtbare ereigniskortikale elektrische Oberflächenpotentiale (CSEPs) zu induzieren.
      HINWEIS: Die Stimulation eines einzelnen Whiskers sollte in nur wenigen Kanälen (Maus) einen klaren, scharfen ereignisbezogenen CSEP hervorrufen.
   3. Überprüfung der Rasterposition
      1. Vergewissern Sie sich bei einer Ratte, dass das Gitter korrekt über dem auditorischen Kortex positioniert ist. Der erste aufgezeichnete Block sollte in der Regel ein 60-Sekunden-Stimulus mit weißem Rauschen sein, um zu überprüfen, ob das Gitter eine korrekte Reaktion des Gehirns registriert. Führen Sie erst vor dem Einsetzen der Polytrode Diagnoseaufzeichnungen für weißes Rauschen und Töne mit dem Gitter durch, um festzustellen, ob das Gitter richtig platziert wurde und ob eine Signalantwort vorliegt.
      2. Um die Rasterpositionierung einer Maus zu überprüfen, führen Sie eine schnelle Mapping-Sitzung mit 20-30 Whisker-Auslenkungen im Abstand von 350 ms durch. Zeichnen Sie die Aktivität im LFP-Band (Local Field Potential) mit Trodes auf und analysieren Sie sie offline mit einem benutzerdefinierten MATLAB-Code, um die räumliche Ausdehnung der durch Whisker evozierten Aktivität zu visualisieren.
   4. Neupositionierung
      1. Wenn das Gitter angepasst werden muss, befeuchten Sie die kortikale Oberfläche mit Tropfen Kochsalzlösung über dem Gitter.
      2. Lassen Sie die Kochsalzlösung 30 s bis 1 Minute stehen, bevor Sie versuchen, das Gitter anzuheben.
      3. Heben Sie das Gitter vorsichtig und langsam an.
      4. Positionieren Sie es neu, indem Sie die in Schritt 3.1 beschriebenen Schritte ausführen.
3. Laminare Polytroden für eine Ratte
   1. Polytroden-Aufbau
      1. Verbinden Sie zunächst den Kopftischadapter mit der Rückseite der Polytrode. Befestigen Sie den Stecker an den dritten Kanalsatz auf der Platine des Adapters. Stellen Sie sicher, dass die schwarze Markierung auf dem Clip auf die rechte Seite des Geschäftsendes der Polytrode zeigt.
   2. Polytroden-Einfügung
      1. Führen Sie die Polytrode so lange in das Gehirn ein, bis die allerletzten (obersten) Elektroden über der kortikalen Oberfläche sichtbar sind. Ein langsamer Abstieg (bis zu 1 μm/s) verbessert die Signalqualität. Warten Sie 15 Minuten, damit sich das Gehirn an die Anwesenheit der Polytrode gewöhnen kann.
      2. Prüfen Sie nach 15 Minuten, ob die letzten Elektroden in die kortikale Oberfläche eingedrungen sind. Wenn nicht, senken Sie die Polytrode etwas weiter ab und warten Sie weitere 10 Minuten, bevor Sie fortfahren.
4. Positionierung der optogenetischen Lichtquelle auf einer Maus
   1. Verwenden Sie entweder ein dreidimensionales Feinjustierschraubensystem, das an einem Gelenkarm montiert ist, oder einen Mikromanipulator, um den Glasfaserhalter zu montieren.
   2. Um die Lichtquelle zu lenken und die Positionierung der Faser zu erleichtern, schalten Sie das optogenetische Licht mit geringer Intensität ein. Verwenden Sie den Gelenkarm, um das optogenetische Licht grob in Richtung des Zielbereichs zu positionieren.
   3. Fokussieren und justieren Sie die Position der Faser entweder mit einem Mikromanipulator oder mit Feineinstellschrauben.
5. Aufzeichnung der Signale
   1. Präparat
      1. Trennen Sie alle nicht benötigten Lampen, Verlängerungskabel und Überspannungsschutzgeräte aus dem OP-Gerät, um elektrische Störungen zu reduzieren. Schalten Sie die Deckenbeleuchtung im Rig aus.
      2. Schließen Sie die Tür zum isolierten Aufnahmeraum und die Tür zum Operationssaal, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.
   2. Beginn der Akquisition
      1. Bei einer Ratte starten Sie Synapse auf der Aufnahmeplattform/dem Computer und bestätigen Sie, dass die Erfassung funktioniert, indem Sie eine Vorschau anzeigen und nach Signalen suchen. Lösen Sie große, scharfe Spannungstransienten im μECoG-Signal aus, indem Sie Reize in der Nähe des Tieres präsentieren, z. B. Klatschen.
      2. Für eine Maus starten Sie die Aufnahmesitzung in Trodes.
   3. Hydration
      1. Injizieren Sie der Ratte oder Maus während der Aufzeichnung alle 1-2 Stunden subkutan 1 ml bzw. 0,1 ml Kochsalzlösung, um eine Dehydrierung zu verhindern. Warten Sie bei einer Ratte 5-10 Minuten nach der Verabreichung von Kochsalzlösung, bevor Sie einen neuen Aufnahmeblock ausführen.
   4. Stimulus-Sets
      1. Bei einer Ratte fahren Sie, sobald der Aufnahmeort bestätigt ist, mit der Aufzeichnung der erforderlichen Stimulussätze fort. Ein Beispielsatz könnte Folgendes enthalten:
         Weißes Rauschen (60 s)
         Tondiagnose (5 min)
         Reiner Ton (23 min)
         Dynamisch bewegte Welligkeit
         Ton 150 (15 min)
         TIMIT (38 min)
      2. Bei einer Ratte stellen Sie das weiße Rauschen und die Tondiagnose jedes Mal wieder her, wenn das Raster neu positioniert wird.
      3. Taktile Stimuli für eine Maus: Stellen Sie taktile Stimuli in einer Versuchsstruktur bereit, wobei jeder Versuch alle 350 ms einen Zug zufälliger Whisker-Ablenkungen enthält. Im bereitgestellten Beispiel umfasst jeder Versuch 14 Ablenkungen, die über einen Zeitraum von 4500 ms präsentiert werden.
      4. Optogenetische Stimuli für eine Maus: In einigen Versuchen wird über die gesamte Versuchsdauer (5 s) ein quadratischer Impuls aus optogenetischem Licht angelegt. Bestimmung des erforderlichen Lichtniveaus auf der Grundlage des verwendeten Opsins und der zu erreichenden Gewebetiefe unter Verwendung von Schätzungen der Lichtdurchlässigkeit (https://web.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php)
6. Säuberungsaktion
   1. Anheben und Reinigen des Gitters
      1. Sobald die Aufnahme beendet ist, schließen Sie die Aufnahmesoftware und schließen Sie die Lichtquellen wieder an das Rig an.
      2. Wenn das Gehirn trocken ist, tragen Sie mit einer Spritze einen kleinen Tropfen Kochsalzlösung auf die Gehirnoberfläche auf. Lassen Sie die Kochsalzlösung 30 s bis 1 Minute stehen, bevor Sie versuchen, das Gitter anzuheben.
      3. Heben Sie unter dem Mikroskop das Gitter mit Mikromanipulatoren vorsichtig von der Gehirnoberfläche ab.
      4. Wenn beim Anheben des Gitters zusätzliche Kraft erforderlich ist, verwenden Sie eine mit Kohlenstoffspitze bestückte Pinzette (geschlossen), um das Gitter vorsichtig vom Gehirn zu heben. Stellen Sie sicher, dass die Bewegung des Mikromanipulators leicht nach vorne erfolgt, um das Gitter vorsichtig von der Gehirnoberfläche abzulösen.
      5. Sobald das Gitter vollständig entfernt wurde, lösen Sie es von der Greifgabel und reinigen Sie es gemäß den Schritten 3.6.1.6-3.6.1.7.
      6. Weichen Sie das Gitter (mit Ausnahme der Anschlussplatine) mindestens 1 h lang in einem verdünnten enzymatischen Reinigungsmittel (50 % Enzol, 50 % destilliertes Wasser) ein. Füllen Sie es anschließend in ein zweites Bad mit reinem destilliertem Wasser und lassen Sie es an einem sicheren, sauberen Ort an der Luft trocknen.
      7. Wenn sich an verschiedenen Stellen des Gitters Blut oder Gewebe abgelagert haben, wischen Sie es vorsichtig mit einem in enzymatischer Lösung getränkten Wattedreieck ab.
      8. Sobald es trocken ist, lege das Gitter wieder in seine Schachtel.
   2. Einschläferung des Tieres
      1. Bei einer Maus nehmen Sie das Tier aus der Kopffixierung und legen es in die Euthanasiekammer. Fügen Sie eine Gaze mit 5 ml Isofluran hinzu und warten Sie 60 s nach Beendigung der Atmung. Vergewissern Sie sich, dass kein Rückzugsreflex vorhanden ist, und enthaupten Sie ihn mit einer scharfen Schere.
      2. Injizieren Sie einer Ratte 0,2 ml Pentobarbital-IP. Warten Sie 60 s nach Beendigung der Atmung, legen Sie das Tier auf den Rücken und verwenden Sie eine #11-Klinge, um eine doppelte Thorakotomie durchzuführen.
   3. Reinigung der Ausrüstung
      1. Bringen Sie alle chirurgischen Instrumente zum Laborwaschbecken und legen Sie sie auf ein chirurgisches Handtuch. Sprühen Sie die Werkzeuge mit 10%iger Bleichlösung ein und waschen Sie sie gründlich in der Spüle. Bei schmutzigeren Werkzeugen lassen Sie sie vor dem Waschen in einer Bleichlösung einweichen.
      2. Alternativ können Sie ein Pulverwaschmittel (z. B. Contrex AP) mit Wasser verwenden, indem Sie die Instrumente mit einer Bürste in der Spüle schrubben.
      3. Sobald die Werkzeuge sauber und gespült sind, wischen Sie sie mit Alkoholtüchern ab und legen Sie sie wieder an ihren Aufbewahrungsort.
   4. Desinfektion des Arbeitsplatzes
      1. Entsorgen Sie alle benutzten Nadeln und Klingen im Behälter für scharfe Gegenstände.
      2. Entsorgen Sie kontaminierte Wattestäbchen, Dreiecke und Alkoholtücher im Biohazard-Beutel.
      3. Wischen Sie alle Arbeitsflächen im Rig-Raum mit Alkohol ab und reinigen Sie alle Instrumente, bevor Sie den Arbeitsbereich schließen.

Ergebnisse

Wir haben die Protokolle zur Aufzeichnung elektrokortikographischer Signale in Kombination mit optogenetischen Methoden und laminaren Aufzeichnungen beschrieben. Hier werden typische Signale vorgestellt, die aus dem somatosensorischen Kortex der Maus (Abbildung 1, Abbildung 2 und Abbildung 3) und innerhalb des auditorischen Kortex von Ratten als Reaktion auf sensorische Stimulation (

Diskussion

Die hier beschriebenen Protokolle ermöglichen die Integration von Mikro-Elektrokortikographie-Arrays (μECoG) mit hoher Dichte mit laminaren Sonden und optogenetischen Techniken. Die einfache Anwendung dieses Protokolls in Nagetiermodellen macht es zu einem leistungsfähigen Werkzeug für die Untersuchung der kortikalen Dynamik, und die Anzahl der Probanden kann leicht erhöht werden. Das μECoG-Gitter mit hoher Dichte ermöglicht eine effiziente, räumlich präzise Kartierung der korti...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 disposable #11 blade	Swann Morton	303	For surgical procedures
2 disposable #10 blades	Swann Morton	3901	For surgical procedures
30 mm cage bars	Thorlabs	ER	cage components
30 mm cage plate	Thorlabs	CP33T	holding the lenses
70% ethanol	Decon Labs	V1016	Cleaning / Disinfectant (diluted to 70%)
Amalgambond PLUS Adjustable Precision Applicator Brush Teal 200/Bx	Henry Schein	1869563	precision applicator for the cement
Amalgambond PLUS Catalyst 0.7 mL Syringe Ea	Henry Schein	1861119	cement component
Amplifier (Tucker-Davis Technologies)	Tucker-Davis Technologies	PZ5M-512	Used for auditory stimulus and recording software.
Articulated arm	Noga	DG60103	for holding the fine adjustment screw system
Aspheric lenses for light collection (and one for focusing the light)	Thorlabs	ACL25416U-B	for collecting LED light
Auditory equipment	Tucker-Davis Technologies, Sony, Cortera	RP2.1 Enhanced Real-Time Processor/HB7 Headphone Drive	Used for auditory stimulus and recording software.
Buprenorphine	Sterile Products LLC	#42023017905	General analgesia
C&B Metabond Base Cement Ea	Henry Schein	1864477	cement component
C&B Metabond L-Powder Cement Clear 3 g	Henry Schein	1861068	cement component
Chlorprothixene hydrochloride (mouse)	Sigma Aldrich	Cat. No. C1671	For sedation, must be prepared the same day and kept at 4
Custom-designed 128-channel micro-electrocorticography (μECoG) grids	Neuronexus	E128-200-8-40-HZ64	For neurophysiology recordings. Placed onto the cortex.
Dengofoam gelatin sponges	Dengen dental	600034 (SKU)	can be used dry or wet, saturated with sterile sodium chloride solution
Drill bit, size 5 to 9 (Mouse)	Fine Science Tools	19007-XX	XX is the size of the drill bit e.g. 05 or 09. For mouse procedures
Drill bitSteel Round Bur (5.5 mm/7.5 mm)	LZQ Tools	Dental Bar Drill Bit Stainless Steel Bur	For rat procedures
Dumont No. 5 forceps	Fine Science Tools	11251-10	For surgical procedures
Dumont tweezers #5 bent 45°	World precision instruments	14101	for removing craniotomy window
DVD Player (Sony)	Sony	CDP-C345	System used to accept and play back stimulus sets
Electrostatic Speaker	Sony	XS-162ES	Used for auditory stimulus and recording software. Located within the rig, plays sound to the sedated rodent
Enzymatic detergent (Enzol)	Advanced sterilization products	2252	Cleaning/Disinfectant
EverEdge 2.0 Scaler Sickle Double End H6/H7 #9	Henry Schein	6011862	for scrubing the skull
Fine adjustment screw system in 3 dimension	Narishige	U-3C	for precise positioning of the optical fiber end
Gold pin	Harwin Inc	G125-1020005	Used for contact reference in mouse Soldered to the silver wire
Gripping forceps	Fine Science Tools	00632-11	For surgical procedures
Isoflurane	Covetrus	11695067772	require a vaporizer
Ketamine (Hydrochloride Injection) (Rat)	Dechra	17033-101-10	Anesthesia/Analgesic
LED	New Energy	LED XLAMP XPE2 BLUE STARBOARD	Blue LED light source
LED driver	Thorlabs	LEDD1B	LED driver
Lidocaine	Covetrus	VINB-0024-6800	to be diluted to 1% in saline
Meloxicam	Covetrus	6451603845	Anti-inflammatory used for general analgesia
Micromanipulator	Narishige (Stereotaxic Rig)	SR-6R + SR-10R-HT components	Used to manipulate ECoG and rodent with fine movements
No. 2 forceps	Fine Science Tools	91117-10	For surgical procedures
No. 55 forceps	Fine Science Tools	1129551	For surgical procedures
Ophtalmic lubricant (Artificial tears)	Akorn	17478-062-35	Used to protect eyes from dessication during surgical procedures
Optical fiber 200µm Core diameter	Thorlabs	M133L02	FC/PC connector 2 m long
Pentobarbital (Rat)	Covetrus / Dechra	VINV-C0II-0008	Anesthesia/Analgesic
Platinum Black	Sigma	205915-250MG	For neurophysiology recordings (Used for electroplating the contacts on the μECoG grids).
Povidone Iodine 10%	Betadine	https://betadine.com/medical-professionals/betadine-solution/	no catalog number ( not retail )
Powder detergent (Contrex AP)	Decon Labs	5204	Cleaning / Disinfectant
Pre-cut tape for oxygen tube	ULINE (Various Providers)	S-14726	Used to attach oxygen tube to the nose-cone of the rodent stereotaxic rig
Scalpel handle # 3	World precision instruments	500236-G	for blades # 10, #11 and #15
Scraper	Fine Science Tools	1007516	For surgical procedures
Short 30 G needles	ExelInt	26437	For surgical procedures and injections
Silver Wire	Warner Instruments	63-1319	For neurophysiology recordings (Used for grounding and as a reference electrode).
Sterilized saline (0.9% sodium chloride for injection)	Hospira	00409-7101-67 (NDC)	For dilution of injectable, and replacement of body fluids
Stoelting Hopkins Bulldog	Fine Science Tools	10-000-481	For surgical procedures
Surface disinfectant (Coverage Plus NDP Disinfectant)	Steris life science	638708	Cleaning/Disinfectant
TDT ZIF-clip connectors for acquisition.	Tucker-Davis Technologies	ZIF-Clip Analog Headstages	Connects ECoG with outside acquisition equipement
Two-pronged holding fork	Tucker-Davis Technologies	Z-ROD128	Used to connect the TDT-clips with the micromanipulator
Xylazine (Rat)	Covetrus	1XYL006	Anesthesia/Analgesic