JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يوفر البروتوكول الحالي مجموعة شاملة من الإجراءات اللازمة لتحليل الصفائح الدموية المخثرة ، والتي تظهر سمات متداخلة للنخر وموت الخلايا المبرمج وتنشيط الصفائح الدموية.

Abstract

الصفائح الدموية المنتشرة في مجرى الدم هادئة نسبيا ولكنها تصبح "تنشيط" عند مواجهة المنشطات أو "ناهضات" في موقع إصابة الأوعية الدموية. تمثل الصفائح الدموية التجمعية والتخثرية مجموعتين متميزتين من الصفائح الدموية المنشطة. في حين أن الصفائح الدموية التجمعية تسهل وقف النزيف ، أو "الإرقاء" ، عن طريق تكوين سدادة من الصفائح الدموية المتجمعة معا من خلال جسور الفيبرينوجين ، فإن الصفائح الدموية المخثرة تسرع بشكل كبير من سلسلة التخثر ، وتبلغ ذروتها في تكوين جلطة الفيبرين. أحد الجوانب المثيرة للاهتمام في الصفائح الدموية المخثرة هو أن مورفولوجيتها تظهر سمات معينة من "النخر" و "موت الخلايا المبرمج". وبالتالي قد تمثل شكلا من أشكال موت الخلايا في الصفائح الدموية ، وإن كان لها دور مهم في تجلط الدم والإرقاء. تقدم هذه المقالة مفهوم الصفائح الدموية المخثرة ، وصلتها بالصحة والمرض ، ومقارنة الطرق الحالية لتحليلها. ثم يوفر بروتوكولات شاملة لتحليل الصفائح الدموية المخثرة ، والتحقيق في آليات تكوينها ، وتقييم دورها التخثري في تسهيل التخثر. تختتم المقالة بمناقشة الخطوات الرئيسية والقيود ومبادئ استكشاف الأخطاء وإصلاحها للطرق الموصوفة.

Introduction

هناك مجموعتان متميزتان على الأقل من الصفائح الدموية المنشطة1،2. تتميز الصفائح الدموية المؤيدة للتجميع بتنشيط عالي الإنتجرين وانخفاض التعرض ل PS ، إن وجد. من ناحية أخرى ، تتميز الصفائح الدموية المخثرة بنشاط منخفض للإنتجرين وتعرض عالي ل PS1،2 ، مما يوفر سطحا لتجميع مجمعات التيناز والبروثرومبيناز3 ، وهو 105-10 6 أضعاف و 300000 ضعف أكثر نشاطا من عامل الطور القابل للذوبان الفردي IXa و Xa ، على التوالي4. وبالتالي فإن الصفائح الدموية المخثرة تسرع التخثر بشكل كبير. أحد الجوانب المثيرة للاهتمام للصفائح الدموية المخلوطة هو أن مورفولوجيتها تشبه ميزات معينة من "النخر" مثل الحويصلة الدقيقة ، ونتفخ الخلية مع اضطراب الهيكل الخلوي ، وفقدان سلامة الغشاء ، بالإضافة إلى تلك الخاصة ب "موت الخلايا المبرمج" مثل فقدان عدم تناسق الفوسفوليبيد الغشائي مع التعرض للفوسفاتيديل سيرين في النشرة الخارجية5،6. بمعنى آخر ، قد يمثل تكوين الصفائح الدموية المخثرة شكلا من أشكال موت الخلايا في الصفائح الدموية ، وإن كان ذلك مع وظيفة فسيولوجية مهمة في الإرقاء.

ترتبط الصفائح الدموية المخثرة بشكل كبير باضطرابات التخثر. في حين أن معظم الأفراد الأصحاء ليس لديهم صفائح تخثر صناعية منتشرة ، فإن ~ 30٪ من الصفائح الدموية المانحة الطبيعية تتبنى نمطا ظاهريا للتخثر خارج الجسم الحي بعد التعرض لناهضات قوية مثل الثرومبين والكولاجين7. تم الإبلاغ عن الصفائح الدموية المخثرة المنتشرة في الصدمة ، حيث قد يعكس تكوينها التنشيط بواسطة هيستون H48،9. ومع ذلك ، في معظم اضطرابات التخثر ، لا يتم الكشف عن زيادة مستويات الصفائح الدموية المخثرة إلا بعد التحفيز خارج الجسم الحي 10. على سبيل المثال ، المرضى الذين يعانون من السكتة الدماغية الحادة الذين تم تحويل >51.1٪ من الصفائح الدموية إلى صفائح الدموية المخلوطة (المعروفة أيضا باسم الصفائح الدموية المغطى) عن طريق الكولاجين والثرومبين كان لديهم نسبة خطر تبلغ 10.72 للسكتة الدماغية المتكررة في غضون 30 يوما مقارنة بالمرضى الذين يعانون من تكوين الصفائح الدموية الأقل تخثر11. تم الإبلاغ عن نتائج مماثلة في المرضى الذين يعانون من نوبات إقفارية عابرة وتصلب الشرايين السباتي12. في المقابل ، ينتج اضطراب النزيف متلازمة سكوت عن طفرة في ANO6 ، والتي تشفر الفوسفوليبيد سكرامبلاز TMEM-16F ، مما يؤدي إلى نقص التعرض للصفائح الدمويةPS 13. قد تترافق اضطرابات النزيف مجهول السبب والنزيف داخل الجمجمة بانخفاض القدرة على توليد الصفائح الدمويةالمخثرة 14.

ومن ثم ، فإن تقييم الصفائح الدموية المبديلة للتخثر هو جزء من أي تحليل لوظيفة الصفائح الدموية ليس فقط أثناء التحقيقات الأساسية في آليات تنشيط الصفائح الدموية وما يترتب على ذلك من تجلط الدم والإرقاء ، ولكن أيضا أثناء التحليل السريري لخطر تجلط الدم أو النزيف لدى المرضى خلال الحالات المرضية المختلفة. أوصت لجنة الجمعية الدولية المعنية بالتخثر والإرقاء (ISTH) باستخدام ربط Annexin V وتعبير P-selectin عن طريق قياس التدفق الخلوي لتمييز مواد التخثر عن المجموعات السكانية الفرعية الأخرى للصفائحالدموية 15. تناقش المقالة أيضا الطرق المختلفة التي يمكن استخدامها لتحليل الصفائح الدموية المخثرة والخلايا المبرمج ولكنها لا ترقى إلى وصف العمليات بالتفصيل. وتشمل هذه الطرق الكشف عن (1) تنشيط الصفائح الدموية بواسطة PAC1 / JonA أو ربط الفيبرينوجين (قياس التدفق الخلوي). (2) إفراز حبيبات ألفا عن طريق تعبير P-selectin (قياس التدفق الخلوي) ؛ (3) التعرض ل PS عن طريق ربط Annexin V / lactadherin (قياس التدفق الخلوي) ؛ (4) فقدان سلامة الغشاء عن طريق وضع العلامات GSAO (قياس التدفق الخلوي) ؛ (5) التغيرات المورفولوجية مثل البالون (الفحص المجهري) ؛ (6) الكشف عن تنشيط الكاسباز عن طريق فحص الكاسباز (النشاف المناعي / قياس اللومينومتر / قياس التدفق الخلوي) أو تدهور جيلسولين الركيزة الهيكلية الخلوية (النشاف المناعي) ؛ (7) فقدان إمكانات غشاء الميتوكوندريا بواسطة الأصباغ الحساسة لإمكانات الميتوكوندريا مثل JC-1 / Mitotracker (قياس التدفق الخلوي) ؛ (8) علامات موت الخلايا المبرمج الجوهرية في الميتوكوندريا Bax و Bak و Cytochrome c (النشاف المناعي) ؛ (9) وظيفة التخثر عن طريق فحص توليد الثرومبين وارتباط عامل التخثر Xa / Va (قياس التدفق الخلوي ، الفحص المجهري) ؛ (10) ارتفاع الكالسيوم العصاري الخلوي والميتوكوندريا بواسطة الأصباغ الحساسة للكالسيوم الفلوري (قياس التدفق الخلوي ، القياس الفلوري ، الفحص المجهري).

تتعمق الدراسة الحالية في بروتوكولات شاملة لتحليل الصفائح الدموية المسببة للتخثر بالإضافة إلى تمييزها عن الصفائح الدموية المتراكمة وموت الخلايا المبرمج. تعتمد معظم الإجراءات الموصوفة على قياس التدفق الخلوي الذي يتميز بمزايا (1) كونه متاحا بسهولة وسهل الاستخدام ، (2) يتطلب حجم عينة منخفضا ، و (3) السماح بالكشف المتزامن عن مجموعات فرعية متعددة من الصفائح الدموية (التجميعية ، والتخثر ، وموت الخلايا المبرمج) 15. يتم استكمال هذه البروتوكولات القائمة على قياس التدفق الخلوي بفحوصات وظيفية لنشاط التخثر بناء على ربط عامل التخثر وفحوصات توليد الثرومبين القائمة على الجلطة.

Protocol

تم تجنيد المشاركين من البشر في الدراسة لأخذ عينات من الدم الوريدي المحيطي بعد الحصول على موافقة خطية مستنيرة ، باتباع توصيات وموافقة مجلس المراجعة المؤسسية لمعهد أبحاث كليفلاند كلينك ليرنر بدقة ، مع توافق جميع منهجيات الدراسة مع المعايير التي حددها إعلان هلسنكي. تم تضمين المشاركين البالغين الأصحاء الذين تزيد أعمارهم عن 18 عاما ، بينما تم استبعاد المشاركين البالغين الأصحاء الذين تزيد أعمارهم عن 18 عاما ، والأفراد الذين لديهم تاريخ حديث من أحداث التخثر في الأشهر الستة الماضية ، وأولئك الذين لديهم تاريخ من إدمان الكحول أو تعاطي المخدرات ، والمشاركين الذين استخدموا الأدوية المضادة للصفائح الدموية أو مضادات التخثر في الأسابيع الأربعة الماضية. يمكن العثور على وصف مفصل للمواد والكواشف المستخدمة في البروتوكولات في جدول المواد.

1. تحضير الصفائح الدموية

  1. سحب عينات الدم الوريدية المحيطية إلى مضادات التخثر ACD (1: 9 v / v) من المشاركين البشريين بعد الحصول على موافقة خطية مستنيرة ، باتباع التوصيات المعتمدة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بدقة.
  2. جهاز الطرد المركزي للدم الذي تم جمعه في ACD عند 100 × جم لمدة 20 دقيقة عند 22 درجة مئوية للحصول على البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) كمادة طافية.
  3. جهاز الطرد المركزي PRP عند 800 × جم لمدة 7 دقائق عند 22 درجة مئوية بعد إضافة 3 ميكرومتر من PGE1 و 2 ملي مولار من EDTA.
  4. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الصفائح الدموية في المخزن المؤقت A (انظر جدول المواد) عن طريق سحب العينة اللطيف.
  5. الطرد المركزي الصفائح الدموية المعلقة في المخزن المؤقت A عند 800 × جم لمدة 7 دقائق عند 22 درجة مئوية.
  6. أعد تعليق حبيبات الصفائح الدموية في المخزن المؤقت B (انظر جدول المواد) عن طريق سحب العينة اللطيف.
  7. اضبط العدد النهائي للصفائح الدموية إلى 1 × 107 / مل باستخدام عداد خلوي آلي.
    ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الخطوات في ظل ظروف معقمة واتخذ الاحتياطات اللازمة للحفاظ على الصفائح الدموية في حالة الراحة عن طريق تجنب التعرض للقص المفرط أثناء سحب العينات.

2. تحليل الصفائح الدموية المخلوطة عن طريق قياس التدفق الخلوي

  1. تكملة الصفائح الدموية البشرية المغسولة ب 2.5 ملي مولار من الكالسيوم (0.5 ميكرولتر من محلول CaCl2 0.5 M في 100 ميكرولتر من تعليق الصفائح الدموية).
  2. حافظ على جزء واحد من الصفائح الدموية غير محفز وحفز الكسور المتبقية بالثرومبين (0.1 وحدة / مل ، 0.25 وحدة / مل ، 0.5 وحدة / مل) ، أو التشنج (20 نانوغرام / مل ، 50 نانوغرام / مل ، 100 نانوغرام / مل) ، أو مزيجها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. بعد التحفيز ، أضف 1 ميكرولتر لكل من الجسم المضاد PE-Annexin V و FITC-PAC1 و APC-anti-human CD62P إلى 100 ميكرولتر من معلقات الصفائح الدموية المحفزة.
  4. احتضان الصفائح الدموية في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  5. قم بإصلاح الصفائح الدموية عن طريق إضافة حجم متساو (1: 1) من 2٪ فورمالين.
  6. تحليل العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي لتحديد الصفائح الدموية المخثرة15،16.
  7. ارسم بوابة غير متبلورة لتشمل الصفائح الدموية ، وفصلها عن الضوضاء والجزيئات متعددة الصفائح الدموية.
  8. اجمع جميع بيانات التألق باستخدام التضخيم اللوغاريتمي المكون من أربعة أرباع ل 10,000 حدث في بوابة الصفائح الدموية من كل عينة.
  9. تحديد مناطق الصفائح الدموية بناء على إيجابية التألق أو السلبية للتعرض للفوسفاتيديل سيرين (PS) (ربط الملحق V) ، وتعبير P-selectin (CD62P) ، وتنشيط الإنتجرين αIIbβ3 (ربط PAC1).
  10. ضع في اعتبارك الصفائح الدموية إيجابية لكل من التعرض ل PS (ربط الملحق V) وتعبير P-selectin (CD62P) ولكنها سلبية لتنشيط الإنتجرين αIIbβ3 (ربط PAC1) كصفائح مخثرة (الشكل 1) (الجدول 1).
  11. وبالمثل ، ضع في اعتبارك الصفائح الدموية إيجابية لكل من تنشيط الإنتجرين αIIbβ3 (ربط PAC1) وتعبير P-selectin (CD62P) ولكنه سلبي للتعرض ل PS (ربط الملحق V) كصفائح دموية تجميعية.
    ملاحظة: من المحتمل أن تكون الصفائح الدموية سالبة لكل من تنشيط الإنتجرين αIIbβ3 (ربط PAC1) وتعبير P-selectin (CD62P) ولكنها إيجابية للتعرض ل PS (ربط الملحق V) من المحتمل أن تكون الصفائح الدموية المبرمجة15،16.

3. تحليل الكالسيوم الميتوكوندريا عن طريق قياس التدفق الخلوي

  1. خفف الصفائح الدموية البشرية المغسولة إلى 1 × 106 / مل واستكمل ب 2.5 ملي مولار من الكالسيوم (0.5 ميكرولتر من محلول CaCl2 0.5 M في معلق الصفائح الدموية 100 ميكرولتر).
  2. قم بتسمية الصفائح الدموية ب 5 ميكرومتر رود-2 صباحا (لكالسيوم الميتوكوندريا) لمدة 30 دقيقة في الظلام.
  3. بوابة الصفائح الدموية بشكل مناسب ، كما هو موضح في الخطوة 2.
  4. قم بتحليل الأحداث في بوابة الصفائح الدموية للتغيرات المعتمدة على الوقت في متوسط التألق للأحداث المكتسبة على مدى 5 دقائق باستخدام مخطط مبعثر الكثافة لمضان PE (ل Rhod-2 AM) مقابل الوقت.
  5. سجل مستويات الكالسيوم الأساسية لأول 1 دقيقة.
  6. أضف الثرومبين (0.1 وحدة / مل ، أو 0.25 وحدة / مل ، أو 0.5 وحدة / مل) ، أو كونفولكسين (20 نانوغرام / مل ، أو 50 نانوغرام / مل ، أو 100 نانوغرام / مل) ، أو مزيجها ، واستمر في الحصول على البيانات لمدة 4 دقائقأخرى 17.

4. تحليل إمكانات غشاء الميتوكوندريا عن طريق قياس التدفق الخلوي

  1. تكملة الصفائح الدموية البشرية المغسولة ب 2.5 ملي مولار من الكالسيوم (0.5 ميكرولتر من محلول CaCl2 0.5 M في 100 ميكرولتر من تعليق الصفائح الدموية).
  2. حافظ على جزء واحد من الصفائح الدموية غير محفز وحفز الكسور المتبقية بالثرومبين (0.1 وحدة / مل ، 0.25 وحدة / مل ، أو 0.5 وحدة / مل) ، أو المتشنج (20 نانوغرام / مل ، أو 50 نانوغرام / مل ، أو 100 نانوغرام / مل) ، أو مزيجها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. بعد التحفيز ، أضف صبغة وضع العلامات على الميتوكوندريا (انظر جدول المواد) بتركيز نهائي قدره 500 نانومتر إلى معلقات الصفائح الدموية المحفزة.
  4. احتضن الصفائح الدموية لمدة 30 دقيقة في الظلام.
  5. قم بإصلاح الصفائح الدموية عن طريق إضافة حجم متساو من 2٪ فورمالين.
  6. تحليل العينات عن طريق قياس التدفقالخلوي 17.
  7. صفائح الدموية للبوابة بشكل مناسب كما هو موضح في الخطوة 2.
  8. قم بتحليل الأحداث في بوابة الصفائح الدموية لانخفاض التألق في قناة PE (لصبغة وضع العلامات على الميتوكوندريا) لمقياس التدفق الخلوي.

5. تحليل نشاط كاسباز 3 وكاسباز 8 عن طريق قياس التدفق الخلوي

  1. تكملة الصفائح الدموية البشرية المغسولة ب 2.5 ملي مولار من الكالسيوم (0.5 ميكرولتر من محلول CaCl2 0.5 M في 100 ميكرولتر من تعليق الصفائح الدموية).
  2. حافظ على جزء واحد من الصفائح الدموية غير محفز وحفز الكسور المتبقية بالثرومبين (0.1 وحدة / مل ، 0.25 وحدة / مل ، أو 0.5 وحدة / مل) ، أو المتشنج (20 نانوغرام / مل ، أو 50 نانوغرام / مل ، أو 100 نانوغرام / مل) ، أو مزيجها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. بعد التحفيز ، أضف إما كاشف الكشف عن موت الخلايا المبرمج 1: 1000 (v / v) (انظر جدول المواد) (لكل من مسارات موت الخلايا المبرمج الجوهرية والخارجية) أو 1: 300 (v / v) FITC-IETD-FMK (للكاسباز 8 من مسار موت الخلايا المبرمج الخارجي) إلى معلقات الصفائح الدموية المحفزة.
  4. احتضن الصفائح الدموية لمدة 30 دقيقة في الظلام.
  5. قم بإصلاح الصفائح الدموية عن طريق إضافة حجم متساو من 2٪ فورمالين.
  6. تحليل العينات عن طريق قياس التدفقالخلوي 17.
  7. بوابة الصفائح الدموية بشكل مناسب ، كما هو موضح في الخطوة 2.
  8. تحليل الأحداث في بوابة الصفائح الدموية للتألق في قناة FITC (إما للكاسباز 3/7 أو كاسباز 8) لمقياس التدفق الخلوي.

6. تحليل ارتباط البروثرومبين عن طريق قياس التدفق الخلوي

  1. اقتران البروثرومبين البقري مع صبغة Alexa Fluor 488 باستخدام مجموعة ملصقات البروتين (انظر جدول المواد) ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  2. تكملة الصفائح الدموية البشرية المغسولة ب 2.5 ملي مولار من الكالسيوم (0.5 ميكرولتر من محلول CaCl2 0.5 M في معلق الصفائح الدموية 100 ميكرولتر).
  3. حافظ على جزء واحد من الصفائح الدموية غير محفز وحفز الكسور المتبقية بالثرومبين (0.1 وحدة / مل ، 0.25 وحدة / مل ، أو 0.5 وحدة / مل) ، أو المتشنج (20 نانوغرام / مل ، أو 50 نانوغرام / مل ، أو 100 نانوغرام / مل) ، أو مزيجها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. بعد التحفيز ، أضف البروثرومبين البقري المترافق AF488 (100 ميكروغرام / مل) و 1 ميكرولتر لكل من PE-Annexin V و APC المضاد CD62P المضاد للإنسان إلى 100 ميكرولتر من معلقات الصفائح الدموية المحفزة.
  5. قم بإصلاح الصفائح الدموية عن طريق إضافة حجم متساو من 2٪ فورمالين.
  6. تحليل العينات عن طريق قياس التدفقالخلوي 17 لقياس ارتباط البروثرومبين بالصفائح الدموية.
  7. ارسم بوابة غير متبلورة لتشمل الصفائح الدموية المنفصلة عن الضوضاء وجزيئات الصفائح الدموية المتعددة.
  8. اجمع جميع بيانات التألق باستخدام التضخيم اللوغاريتمي المكون من أربعة أرباع ل 10,000 حدث في بوابة الصفائح الدموية من كل عينة.
  9. ارسم مناطق للصفائح الدموية ذات التألق الإيجابي أو السلبي للتعرض ل PS (ربط الملحق V) ، وتعبير P-selectin (CD62P) ، و AF488-prothrombin (ربط البروثرومبين).
  10. تحديد نسبة جميع أحداث الصفائح الدموية ، بالإضافة إلى نسبة الصفائح الدموية الإيجابية لكل من التعرض ل PS (ربط الملحق V) وتعبير P-selectin (CD62P) (الصفائح الدموية المبدئية للتخثر) ، والتي تكون إيجابية لربط البروثرومبين.

7. تحليل ارتباط البروثرومبين بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر

  1. اقتران البروثرومبين البقري مع صبغة Alexa Fluor 488 باستخدام مجموعة ملصقات البروتين (انظر جدول المواد) ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  2. تكملة الصفائح الدموية البشرية المغسولة ب 2.5 ملي مولار من الكالسيوم (0.5 ميكرولتر من محلول CaCl2 0.5 M في معلق الصفائح الدموية 100 ميكرولتر).
  3. حافظ على جزء واحد من الصفائح الدموية غير محفز وحفز الكسور المتبقية بالثرومبين (0.1 وحدة / مل ، 0.25 وحدة / مل ، أو 0.5 وحدة / مل) ، أو المتشنج (20 نانوغرام / مل ، أو 50 نانوغرام / مل ، أو 100 نانوغرام / مل) ، أو مزيجها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. بعد التحفيز ، أضف البروثرومبين البقري المترافق AF488 (100 ميكروغرام / مل) و 1 ميكرولتر لكل من PE-Annexin V و APC المضاد CD62P المضاد للإنسان إلى 100 ميكرولتر من معلقات الصفائح الدموية المحفزة.
  5. قم بإصلاح الصفائح الدموية عن طريق إضافة حجم متساو من 2٪ فورمالين.
  6. بيليه الصفائح الدموية الثابتة على أغطية مطلية ب poly-D-lysine.
  7. قم بتركيب أغطية على شرائح الفحص المجهري باستخدام محلول مضاد للبهتان.
  8. بدلا من ذلك ، قم بتغطية الأغطية بالكولاجين (100 ميكروغرام / مل) لمدة ساعة واحدة في غرفة رطبة.
  9. قم بسد الغطاء المطلي باستخدام 0.5٪ BSA في PBS لمدة 1 ساعة.
  10. قم بتسمية الصفائح الدموية ببروثرومبين البقر المترافق AF488 (100 ميكروغرام / مل) و 1 ميكرولتر لكل من الجسم المضاد PE-Annexin V و APC CD62P المضاد للإنسان.
  11. اسمح للصفائح الدموية المصنفة بالالتصاق لمدة 20 دقيقة على أغطية الكولاجين المطلية.
  12. اغسل الأغطية بالصفائح الدموية الملتصقة ثلاث مرات باستخدام PBS.
  13. إصلاح أغطية مع 2٪ بارافورمالدهيد لمدة 1 ساعة.
  14. قم بتركيب أغطية على شرائح الفحص المجهري باستخدام محلول مضاد للبهتان.
  15. راقب الشرائح تحت مجهر متحد البؤر عند تكبير موضوعي 63×.
  16. تحليل الصور باستخدام برنامج فيجي لقياس الكميات الفلورية.

8. اختبار توليد الثرومبين المعتمد على الصفائح الدموية الفوسفوليبيد القائم على الجلطة

  1. تكملة الصفائح الدموية البشرية المغسولة ب 2.5 ملي مولار من الكالسيوم (0.5 ميكرولتر من محلول CaCl2 0.5 M في 100 ميكرولتر من تعليق الصفائح الدموية).
  2. حافظ على جزء واحد من الصفائح الدموية غير محفز وحفز الكسور المتبقية بالثرومبين (0.1 وحدة / مل ، 0.25 وحدة / مل ، أو 0.5 وحدة / مل) ، أو المتشنج (20 نانوغرام / مل ، أو 50 نانوغرام / مل ، أو 100 نانوغرام / مل) ، أو مزيجها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. أضف 100 ميكرولتر من الصفائح الدموية المعالجة إلى خليط من 50 ميكرولتر من البلازما العادية المجمعة و 50 ميكرولتر من محلول الكاولين منخفض التعكر (20 مجم / مل) ، محضن مسبقا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  4. أضف 5 ملي من CaCl2 إلى الخليط.
  5. راقب تكوين الجلطة عن طريق قياس التعكر على قارئ صفيحة دقيقة ، وقياس الامتصاص عند 660 نانومتر كل 60 ثانية لمدة 1 ساعة.

النتائج

تتحول نسبة الصفائح الدموية المنشطة إلى "تحثر الدم" مع زيادة مميزة في التعبير السطحي لكل من الفوسفاتيديل سيرين (PS) و P-selectin ، مما يميزها عن الصفائح الدموية "المبرمجة" الإيجابية فقط للتعرض ل PS بالإضافة إلى الصفائح الدموية "التجميعية" الإيجابية لتعبير P-selectin. وجدنا أن الثرومبي...

Discussion

تظهر الصفائح الدموية المخثرة زيادات ملحوظة ومستدامة في الكالسيوم داخل الخلايا عند التحفيز26 ، ولكن يمكن اشتقاقها من خلال آليات مختلفة. يتم إنشاؤها عند التحفيز الناهض القوي بالكولاجين والثرومبين من خلال وسطاء متميزين ، بما في ذلك بارز تدفق كالسيوم الميتوكو?...

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم مصالح متنافسة للإفصاح عنها.

Acknowledgements

يعترف باريش بي كولكارني وكيث آر ماكراي ، على التوالي ، بجوائز منح الزميل والتجريبي الممولة من مؤسسة فيلوسانو ، كليفلاند كلينك.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Acid Citrate Dextrose (ACD) solution (For 1000 mL)Tri- Sodium Citrate-            22 g
Citric Acid-                            8 g
Dextrose-                              24.5 g
Water-                                   Make up volume to 1000 mL 
Alexa Fluor 488 protein labelling kitInvitrogenA10235
APC Mouse Anti-Human CD62PBD Pharmingen550888
Bovine ProthrombinProlytixBCP-1010
Buffer A (Platelet Preparation)                    M.W         Conc. in 1X      For 100 mL 10X solution
HEPES        238.30         20 mM                    4.766 g
NaCl              58.44       134 mM                   7.83 g
KCl                74.55        2.9 mM               216.19 mg
MgCl2          203.30           1 mM              203.30 mg
NaH2PO4    156.01        0.34 mM                53.04 mg
NaHCO3        84 01           12 mM            1.01 g
Water to 100 mL after adjusting pH to 6.2

Dilute 10X solution 1:10 (v/v) with Milli Q water just before platelet preparation to obtain the 1X solution that needs to be supplemented with the following
                 Conc. in 1X      For 1 ml 1X solution
EGTA           1 mM       Add 10 μL (1:100 v/v) 100 mM EGTA 
Glucose         5 mM      Add 5 μL (1:200 v/v) 1 M glucose
PGE1            3 μM      Add 3 μL (1:333 v/v) 1 mM PGE1 solution
Buffer B (Platelet Preparation)                    M.W         Conc. in 1X      For 100 mL 10X solution
HEPES        238.30         20 mM                    4.766 g
NaCl              58.44       134 mM                   7.83 g
KCl                74.55        2.9 mM               216.19 mg
MgCl2          203.30           1 mM              203.30 mg
NaH2PO4    156.01        0.34 mM                53.04 mg
NaHCO3        84 01           12 mM            1.01 g
Water to 100 mL after adjusting pH to 7.4

Dilute 10X solution 1:10 (v/v) with Milli Q water just before platelet preparation to obtain the 1X solution that needs to be supplemented with the following
                 Conc. in 1X      For 1 ml 1X solution
Glucose         5 mM      Add 5 μL (1:200 v/v) 1 M glucose 
CaCl2 (0.5 M) (For 50ml)Molecular weight of CaCl2.2H2O = 147.02
Dissolve 3.675 g of CaCl2.2H2O in 50 ml Milli Q water
CellEvent Caspase-3/7 Detection Reagents GreenInvitrogenC10423Apoptosis detection reagent
ConvulxinEnzo Life SciencesALX-350-100
EDTA (0.5 M; pH 8) (For 100 mL)Molecular Weight of EDTA Na2.2H2 O: 372.24g
Weigh 18.612 g and suspend in 50 ml Milli Q water and check the pH (pH~4)
Slowly add 10N NaOH with stirring and monitor the pH.
EDTA starts solubilizing at around pH 7 and is completely soluble at pH 8.
Make up the volume to 100 ml with Milli Q water.
EGTA (100 mM; pH 7.4) (For 100 mL)Molecular Weight: 380.4
Add 3.804 g EGTA in 50 ml Milli Q water and check the pH (pH~3)
Add 10 N NaOH dropwise while stirring and monitor the pH
EGTA becomes soluble at pH 7.0 (approx)
Adjust pH to 7.4
Make up the volume to 100 ml with Milli Q water
FITC Mouse Anti-Human PAC-1BD340507
FITC-IETD-FMK Caspase 8 (active) staining kitAbcamab65614
Mitotracker Red CMXRos (mitochindria labeling dye)InvitrogenM7512Stock= 1 mM (50 µg dissolved in 90 µl DMSO)
Sub-stock= 100 µM (10 µl Stock + 90 µl DMSO)
Working concentration= 500nM (0.5 µl in 100 µl)
PE Annexin VBD Pharmingen560930
Prostaglandin E1SigmaP5515Stock= 20 mM (1 mg dissolved in 141 µL DMSO)
Sub-stock= 1 mM (10 µl Stock + 190 µL DMSO)
Working concentration= 3 µM (3 µL in 1 mL)
Rhod-2 AMInvitrogenR1244Stock= 5 mM (1 mg dissolved in 178 µL DMSO)
Sub-stock= 100 µM (10 µL Stock + 90 µL DMSO)
Working concentration= 500 nM (0.5 µL in 100 µL)
Thrombin from human plasmaSigmaT7572

References

  1. Munnix, I., Cosemans, J., Auger, J., Heemskerk, J. Platelet response heterogeneity in thrombus formation. Thromb Haemost. 102 (12), 1149-1156 (2009).
  2. Heemskerk, J. W. M., Mattheij, N. J. A., Cosemans, J. M. E. M. Platelet-based coagulation: Different populations, different functions. J Thromb Haemost. 11 (1), 2-16 (2013).
  3. Podoplelova, N. A., et al. Coagulation factors bound to procoagulant platelets concentrate in cap structures to promote clotting. Blood. 128 (13), 1745-1755 (2016).
  4. Mann, K. G., Butenas, S., Brummel, K. The dynamics of thrombin formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (1), 17-25 (2003).
  5. Jackson, S. P., Schoenwaelder, S. M. Procoagulant platelets: Are they necrotic. Blood. 116 (12), 2011-2018 (2010).
  6. Hua Vivien Mun Yee, V. M. C. Procoagulant platelets and the pathways leading to cell death. Semin Thromb Hemost. 41 (04), 405-412 (2015).
  7. Dale, G. L. Coated-platelets: An emerging component of the procoagulant response. J Thromb Haemost. 3 (10), 2185-2192 (2005).
  8. Vulliamy, P., Armstrong, P. C. Platelets in hemostasis, thrombosis, and inflammation after major trauma. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 44 (3), 545-557 (2024).
  9. Vulliamy, P., et al. Histone H4 induces platelet ballooning and microparticle release during trauma hemorrhage. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (35), 17444-17449 (2019).
  10. Aliotta, A., Bertaggia Calderara, D., Zermatten, M. G., Marchetti, M., Alberio, L. Thrombocytopathies: Not just aggregation defects-the clinical relevance of procoagulant platelets. J Clin Med. 10 (5), 894 (2021).
  11. Kirkpatrick, A. C., Vincent, A. S., Dale, G. L., Prodan, C. I. Coated platelets predict stroke at 30 days following TIA. Neurology. 89 (2), 125-128 (2017).
  12. Kirkpatrick, A. C., Tafur, A. J., Vincent, A. S., Dale, G. L., Prodan, C. I. Coated platelets improve prediction of stroke and transient ischemic attack in asymptomatic internal carotid artery stenosis. Stroke. 45 (10), 2995-3001 (2014).
  13. Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. Calcium-dependent phospholipid scrambling by TMEM16F. Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).
  14. Prodan, C. I., Vincent, A. S., Dale, G. L. Coated platelet levels correlate with bleed volume in patients with spontaneous intracerebral hemorrhage. Stroke. 41 (6), 1301-1303 (2010).
  15. Josefsson, E. C., et al. Consensus report on markers to distinguish procoagulant platelets from apoptotic platelets: Communication from the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. J Thromb Haemost. 21 (8), 2291-2299 (2023).
  16. Kulkarni, P. P., Sonkar, V. K., Gautam, D., Dash, D. AMPK inhibition protects against arterial thrombosis while sparing hemostasis through differential modulation of platelet responses. Thromb Res. 196, 175-185 (2020).
  17. Ekhlak, M., et al. Necroptosis executioner MLKL plays pivotal roles in agonist-induced platelet prothrombotic responses and lytic cell death in a temporal order. Cell Death Differ. 30 (8), 1886-1899 (2023).
  18. Kholmukhamedov, A., Janecke, R., Choo, H. -. J., Jobe, S. M. The mitochondrial calcium uniporter regulates procoagulant platelet formation. J Thromb Haemost. 16 (11), 2315-2321 (2018).
  19. Choo, H. -. J., Saafir, T. B., Mkumba, L., Wagner, M. B., Jobe, S. M. Mitochondrial calcium and reactive oxygen species regulate agonist-initiated platelet phosphatidylserine exposure. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (12), 2946-2955 (2012).
  20. Jobe, S. M., et al. Critical role for the mitochondrial permeability transition pore and cyclophilin D in platelet activation and thrombosis. Blood. 111 (3), 1257-1265 (2008).
  21. Leytin, V., Allen, D. J., Mykhaylov, S., Lyubimov, E., Freedman, J. Thrombin-triggered platelet apoptosis. J Thromb Haemost. 4 (12), 2656-2663 (2006).
  22. Lopez, J. J., Salido, G. M., Pariente, J. A., Rosado, J. A. Thrombin induces activation and translocation of Bid, Bax and Bak to the mitochondria in human platelets. J Thromb Haemost. 6 (10), 1780-1788 (2008).
  23. Wolf, B. B., et al. Calpain functions in a caspase-independent manner to promote apoptosis-like events during platelet activation. Blood. 94 (5), 1683-1692 (1999).
  24. Kim, O. V., et al. Fatal dysfunction and disintegration of thrombin-stimulated platelets. Haematologica. 104 (9), 1866-1878 (2019).
  25. Schoenwaelder, S. M., et al. Two distinct pathways regulate platelet phosphatidylserine exposure and procoagulant function. Blood. 114 (3), 663-666 (2009).
  26. Abbasian, N., Millington-Burgess, S. L., Chabra, S., Malcor, J. -. D., Harper, M. T. Supramaximal calcium signaling triggers procoagulant platelet formation. Blood Adv. 4 (1), 154-164 (2020).
  27. Le, T., et al. An inner activation gate controls TMEM16F phospholipid scrambling. Nat Commun. 10 (1), 1846 (2019).
  28. Yang, H., et al. TMEM16F forms a Ca2+-activated cation channel required for lipid scrambling in platelets during blood coagulation. Cell. 151 (1), 111-122 (2012).
  29. Mattheij, N. J. A., et al. Dual mechanism of integrin closure in procoagulant platelets. J Biol Chem. 288 (19), 13325-13336 (2013).
  30. Liu, F., et al. Mitochondrially mediated integrin αiIbβ3 protein inactivation limits thrombus growth. J Biol Chem. 288 (42), 30672-30681 (2013).
  31. van Kruchten, R., et al. Both TMEM16F-dependent and TMEM16F-independent pathways contribute to phosphatidylserine exposure in platelet apoptosis and platelet activation. Blood. 121 (10), 1850-1857 (2013).
  32. Goelz, N., et al. Platelets express adaptor proteins of the extrinsic apoptosis pathway and can activate caspase-8. PLOS ONE. 16 (1), e0244848 (2021).
  33. Shlomovitz, I., Speir, M., Gerlic, M. Flipping the dogma - phosphatidylserine in non-apoptotic cell death. Cell Commun Signal. 17 (1), 139 (2019).
  34. Nadine, J. A. M., et al. Coated platelets function in platelet-dependent fibrin formation via integrin αIIbβ3 and transglutaminase factor XIII. Haematologica. 101 (4), 427-436 (2016).
  35. Michelson, A. D. Platelet activation by thrombin can be directly measured in whole blood through the use of the peptide GPRP and flow cytometry: Methods and clinical applications. Blood Coagul Fibrinolysis. 5 (1), 121-131 (1994).
  36. Taylor, M. R., Couto, J. R., Scallan, C. D., Ceriani, R. L., Peterson, J. A. Lactadherin (formerly BA46), a membrane-associated glycoprotein expressed in human milk and breast carcinomas, promotes Arg-Gly-Asp (RGD)-dependent cell adhesion. DNA Cell Biol. 16 (7), 861-869 (1997).
  37. Andersen, M. H., Graversen, H., Fedosov, S. N., Petersen, T. E., Rasmussen, J. T. Functional analyses of two cellular binding domains of bovine lactadherin. Biochemistry. 39 (20), 6200-6206 (2000).
  38. Tan, C. W., Bourcy, M., Pasalic, L., Chen, V. M. Flow cytometry assessment of procoagulant platelets using a dithiol-reactive probe functional disulfide bonds: Methods and protocols. Methods Mol Biol. 1967, 305-321 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

219

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved