ניתוח מקיף של טסיות דם מקרישות המציגות מאפיינים של נמק, אפופטוזיס והפעלת טסיות דם

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מספק מערך מקיף של נהלים הדרושים לניתוח טסיות דם פרו-קרישיות, המציגות תכונות חופפות של נמק, אפופטוזיס והפעלת טסיות דם.

Abstract

טסיות הדם המסתובבות בזרם הדם שקטות יחסית אך "מופעלות" כאשר נתקלות בממריצים או "אגוניסטים" במקום הפגיעה בכלי הדם. טסיות פרו-אגרגטוריות ופרו-קרישיות מייצגות שתי אוכלוסיות נפרדות של טסיות מופעלות. בעוד שטסיות פרו-אגרגטוריות מקלות על הפסקת הדימום, או "המוסטזיס", על ידי יצירת פקק של טסיות דם המקובצות יחד דרך גשרי פיברינוגן, טסיות פרו-קרישה מאיצות באופן דרמטי את מפל הקרישה, ומגיעה לשיאה בהיווצרות קרישי פיברין. היבט מעניין של טסיות דם מקרישות הוא שהמורפולוגיה שלהן מציגה מאפיינים מסוימים של "נמק" ו"אפופטוזיס". לפיכך הם עשויים לייצג צורה של מוות תאי בטסיות דם, אם כי יש להם תפקיד חשוב בפקקת והמוסטזיס. מאמר זה מציג את הרעיון של טסיות דם פרו-קרישה, הרלוונטיות שלהן לבריאות ולמחלות, והשוואה בין השיטות הקיימות לניתוחן. לאחר מכן הוא מספק פרוטוקולים מקיפים לניתוח טסיות דם פרו-קרישה, חקירת מנגנוני היווצרותם והערכת תפקידם הפרוטרומבוטי בהקלת הקרישה. המאמר מסתיים בדיון בשלבים מרכזיים, מגבלות ועקרונות פתרון בעיות עבור השיטות המתוארות.

Introduction

ישנן לפחות שתי אוכלוסיות נפרדות של טסיות פעילות ^1,2. טסיות פרו-אגרגטוריות מאופיינות בהפעלה גבוהה של אינטגרין וחשיפה נמוכה, אם בכלל, ל-PS. מצד שני, טסיות דם מקרישות מאופיינות בפעילות אינטגרין נמוכה וחשיפה גבוהה ל-PS ^1,2, ומספקות משטח להרכבה של קומפלקסים טנאז ופרותרומבינאז³, שהוא פעיל פי 10^5-10 פי⁶ ופי 300000 מגורם פאזה מסיס בודד IXa ו-Xa, בהתאמה⁴. טסיות דם מעודדות קרישה מאיצות באופן דרמטי את הקרישה. היבט מעניין של טסיות דם פרו-קרישה הוא שהמורפולוגיה שלהן דומה למאפיינים מסוימים של "נמק" כגון מיקרו-שלפוחית, בלון של התא עם הפרעה בשלד הציטו ואובדן שלמות הממברנה, כמו גם אלה של "אפופטוזיס" כגון אובדן אסימטריה של פוספוליפידים בממברנה עם חשיפה של פוספטידילסרין בעלון החיצוני ^5,6. במילים אחרות, היווצרות טסיות דם פרו-קרישה עשויה לייצג צורה של מוות תאים בטסיות דם, אם כי עם פונקציה פיזיולוגית חשובה בהמוסטזיס.

טסיות דם מקרישות קשורות באופן משמעותי להפרעות פקקתיות. בעוד שלרוב האנשים הבריאים אין טסיות דם מעודדות קרישה במחזור הדם, ~30% מהטסיות הרגילות מאמצות פנוטיפ פרוקו-קרישה ex vivo לאחר חשיפה לאגוניסטים חזקים כמו טרומבין וקולגן⁷. טסיות דם פרו-קרישה במחזור דווחו בטראומה, כאשר היווצרותן עשויה לשקף הפעלה על ידי היסטון H4 ^8,9. עם זאת, ברוב ההפרעות הפרוטרומבוטיות, רמות מוגברות של טסיות דם מקרישות מתגלות רק לאחר גירוי ex vivo ¹⁰. לדוגמה, לחולים עם שבץ מוחי חריף שאצלם >51.1% מהטסיות שלהם הומרו לטסיות דם מעודדות קרישה (הידועות גם בשם טסיות COATed) על ידי קולגן ותרומבין היה יחס סיכון של 10.72 לשבץ חוזר תוך 30 יום בהשוואה לחולים עם^{היווצרות} טסיות דם פרו-קרישה פחותה. תוצאות דומות דווחו בחולים עם התקפים איסכמיים חולפים וטרשת עורקים קרוטידית¹². לעומת זאת, הפרעת הדימום תסמונת סקוט נובעת ממוטציה של ANO6, המקודדת את הסקרמבלאז הפוספוליפיד TMEM-16F, מה שמוביל לחשיפה חסרה של טסיות דם^{PS 13}. הפרעות דימום אידיופטיות ודימום תוך גולגולתי עשויות להיות קשורות לירידה ביכולת לייצר טסיות דם פרו-קרישיות¹⁴.

לפיכך, הערכת טסיות דם מקרישות היא חלק מכל ניתוח של תפקוד טסיות הדם לא רק במהלך חקירות בסיסיות של מנגנוני הפעלת טסיות דם וכתוצאה מכך פקקת והמוסטזיס, אלא גם במהלך ניתוח קליני לסיכון לפקקת או דימום בחולים במצבים פתולוגיים שונים. פאנל של האגודה הבינלאומית לפקקת והמוסטזיס (ISTH) המליץ על שימוש בקשירת Annexin V וביטוי P-selectin על ידי זרימה ציטומטרית להבחנה בין פרוקו-קרישה מתת-אוכלוסיות טסיות אחרות¹⁵. המאמר דן גם בשיטות השונות שניתן להשתמש בהן כדי לנתח טסיות דם פרו-קרישה ואפופטוטיות, אך אינו מתאר את התהליכים בפירוט. שיטות אלה כוללות זיהוי של (1) הפעלת טסיות דם על ידי PAC1/JonA או קשירת פיברינוגן (ציטומטריית זרימה); (2) הפרשת גרגירי אלפא על ידי ביטוי P-selectin (ציטומטריית זרימה); (3) חשיפה ל-PS על ידי קשירת Annexin V/lactadherin (ציטומטריית זרימה); (4) אובדן שלמות הממברנה על ידי תיוג GSAO (ציטומטריית זרימה); (5) שינויים מורפולוגיים כמו בלון (מיקרוסקופיה); (6) זיהוי הפעלת קספאאז על ידי בדיקת קספאזה (אימונובלוטינג/לינומטריה/ציטומטריית זרימה) או פירוק של גלסולין מצע שלד ציטו (אימונובלוטינג); (7) אובדן פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית על ידי צבעים רגישים לפוטנציאל מיטוכונדריאלי כגון JC-1/Mitotracker (ציטומטריית זרימה); (8) סמנים אפופטוטיים פנימיים מיטוכונדריאלים שחרור Bax, Bak וציטוכרום c (אימונובלטינג); (9) תפקוד פרוקו-קרישה על ידי בדיקת יצירת תרומבין וקשירת גורם קרישה Xa/Va (ציטומטריית זרימה, מיקרוסקופיה); (10) עליית סידן ציטוזולית ומיטוכונדריאלית על ידי צבעים רגישים לסידן פלואורסצנטיים (ציטומטריית זרימה, פלואורומטריה, מיקרוסקופיה).

המחקר הנוכחי מתעמק בפרוטוקולים מקיפים לניתוח טסיות דם פרו-קרישיות וכן מבדיל אותן מטסיות פרואגרגטוריות ואפופטוטיות. רוב ההליכים המתוארים מסתמכים על זרימה ציטומטרית שיש לה את היתרונות של (1) היותה זמינה וקלה לשימוש, (2) דורשת נפח דגימה נמוך, ו-(3) מאפשרת זיהוי בו זמנית של תת-אוכלוסיות מרובות של טסיות דם (פרואגרגטורי, פרוקו-קרישה ואפופטוטית)¹⁵. פרוטוקולים אלה המבוססים על ציטומטריית זרימה מתווספים למבחנים פונקציונליים של פעילות פרוקו-קרישה המבוססים על קשירת גורמי קרישה ומבחני יצירת תרומבין מבוססי קריש.

Protocol

משתתפים אנושיים גויסו למחקר לדגימת דם ורידית היקפית לאחר קבלת הסכמה מדעת בכתב, תוך הקפדה על ההמלצות והאישור של ועדת הביקורת המוסדית של מכון המחקר לרנר קליבלנד קליניק, כאשר כל מתודולוגיות המחקר תואמות את הסטנדרטים שנקבעו בהצהרת הלסינקי. משתתפים בוגרים בריאים מעל גיל 18 נכללו, בעוד שמשתתפים מתחת לגיל 18, אנשים עם היסטוריה עדכנית של אירועים טרומבוטיים בששת החודשים האחרונים, אלה עם היסטוריה של אלכוהוליזם או שימוש בסמים, ומשתתפים שהשתמשו בתרופות נוגדות טסיות או נוגדות קרישה בארבעת השבועות האחרונים לא נכללו. תיאור מפורט של חומרים וריאגנטים המשמשים בפרוטוקולים ניתן למצוא בטבלת החומרים.

1. הכנת טסיות דם

1. לשאוב דגימות דם ורידיות היקפיות לנוגדי קרישה ACD (1:9 v/v) ממשתתפים אנושיים לאחר קבלת הסכמה מדעת בכתב, תוך הקפדה על ההמלצות שאושרו על ידי ועדת הביקורת המוסדית.
2. צנטריפוגה הדם שנאסף ב-ACD ב-100 x גרם למשך 20 דקות ב-22 מעלות צלזיוס כדי לקבל פלזמה עשירה בטסיות דם (PRP) כסופרנטנט.
3. צנטריפוגה את ה-PRP ב-800 x g למשך 7 דקות ב-22 מעלות צלזיוס לאחר הוספת 3 מיקרומטר של PGE₁ ו-2 מ"מ של EDTA.
4. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור הטסיות במאגר A (ראה טבלת חומרים) על ידי פיפטינג עדין.
5. צנטריפוגה: טסיות הדם תלויות במאגר A ב-800 x גרם למשך 7 דקות ב-22 מעלות צלזיוס.
6. השעו מחדש את כדור הטסיות במאגר B (ראה טבלת חומרים) על ידי פיפטינג עדין.
7. התאם את ספירת הטסיות הסופית ל-1 ×^{10 7}/מ"ל באמצעות מונה תאים אוטומטי.
   הערה: בצע את כל השלבים בתנאים סטריליים ונקוט באמצעי זהירות כדי לשמור על טסיות הדם במצב מנוחה על ידי הימנעות מחשיפה לגזירה מוגזמת במהלך הפיפטינג.

2. אנליזה של טסיות דם פרו-קרישה על ידי זרימה ציטומטרית

1. תוסף טסיות דם אנושיות שטופות עם 2.5 מ"מ סידן (0.5 מיקרוליטר של תמיסת CaCl₂ 0.5 M במלאי ב-100 מיקרוליטר של תרחיף טסיות דם).
2. שמרו על חלק אחד של טסיות דם ללא גירוי ועוררו את השברים הנותרים עם טרומבין (0.1 U/mL, 0.25 U/mL, 0.5 U/mL), קונוולקסין (20 ננוגרם/מ"ל, 50 ננוגרם/מ"ל, 100 ננוגרם/מ"ל), או השילוב שלהם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
3. לאחר הגירוי, הוסף 1 מיקרוליטר כל אחד של PE-Annexin V, FITC-PAC1 ונוגדני CD62P אנטי-אנושיים APC ל-100 מיקרוליטר של תרחיפי טסיות מגורים.
4. דגרו את הטסיות בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
5. תקן את הטסיות על ידי הוספת נפח שווה (1:1) של 2% פורמלין.
6. נתח את הדגימות על ידי זרימה ציטומטרית כדי לכמת טסיות דם פרו-קרישה^15,16.
7. צייר שער אמורפי כדי להקיף טסיות דם, להפריד אותן מרעש וחלקיקים מרובי טסיות.
8. אסוף את כל נתוני הקרינה באמצעות הגברה לוגריתמית של ארבעה רבעים עבור 10,000 אירועים בשער הטסיות מכל דגימה.
9. הגדר אזורים לטסיות דם על סמך חיוביות פלואורסצנטית או שליליות לחשיפה לפוספטידילסרין (PS) (כריכת Annexin V), ביטוי P-selectin (CD62P) והפעלת אינטגרין αIIbβ₃ (קשירת PAC1).
10. קחו בחשבון טסיות חיוביות הן עבור חשיפה ל-PS (קשירת Annexin V) והן עבור ביטוי P-selectin (CD62P) אך שליליות עבור הפעלת אינטגרין αIIbβ₃ (קשירת PAC1) כטסיות פרו-קרישה (איור 1) (טבלה 1).
11. באופן דומה, קחו בחשבון טסיות חיוביות הן להפעלת אינטגרין αIIbβ₃ (קשירת PAC1) והן לביטוי P-selectin (CD62P) אך שליליות לחשיפה ל-PS (קשירת Annexin V) כטסיות דם מצטברות.
    הערה: טסיות שליליות הן להפעלת אינטגרין αIIbβ₃ (קשירת PAC1) והן לביטוי P-selectin (CD62P) אך חיוביות לחשיפה ל-PS (קשירת Annexin V) הן ככל הנראה טסיות אפופטוטיות^15,16.

3. אנליזה של סידן מיטוכונדריאלי על ידי זרימה ציטומטרית

1. יש לדלל טסיות דם אנושיות שטופות ל-1 ×^{10 6}/מ"ל ולהשלים עם 2.5 מ"מ סידן (0.5 מיקרוליטר של תמיסת CaCl₂ 0.5 M במלאי בתרחיף טסיות של 100 מיקרוליטר).
2. סמן את הטסיות עם 5 מיקרומטר רוד-2 AM (לסידן מיטוכונדריאלי) למשך 30 דקות בחושך.
3. טסיות שער כראוי, כמתואר בשלב 2.
4. נתח אירועים בשער הטסיות עבור שינויים תלויי זמן בקרינה הממוצעת של אירועים נרכשים במשך 5 דקות באמצעות תרשים פיזור צפיפות של פלואורסצנציה PE (עבור Rhod-2 AM) לעומת זמן.
5. רשום את רמות הסידן הבסיסיות במשך הדקה הראשונה.
6. הוסיפו תרומבין (0.1 ננוגרם/מ"ל, 0.25 ננוגרם/מ"ל, או 0.5 ננוגרם/מ"ל), קונוולקסין (20 ננוגרם/מ"ל, 50 ננוגרם/מ"ל או 100 ננוגרם/מ"ל), או השילוב שלהם, והמשיכו לאסוף נתונים עוד 4 דקות¹⁷.

4. ניתוח פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית על ידי ציטומטריית זרימה

1. תוסף טסיות דם אנושיות שטופות עם 2.5 מ"מ סידן (0.5 מיקרוליטר של תמיסת CaCl₂ 0.5 M במלאי ב-100 מיקרוליטר של תרחיף טסיות דם).
2. שמרו על חלק אחד של טסיות דם ללא גירוי ועוררו את השברים הנותרים עם טרומבין (0.1 U/mL, 0.25 U/mL, או 0.5 U/mL), קונוולקסין (20 ננוגרם/מ"ל, 50 ננוגרם/מ"ל או 100 ננוגרם/מ"ל), או השילוב שלהם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
3. לאחר הגירוי, הוסף צבע תיוג מיטוכונדריה (ראה טבלת חומרים) בריכוז סופי של 500 ננומטר לתרחיפים המגורים של טסיות הדם.
4. דגרו על הטסיות למשך 30 דקות בחושך.
5. תקן את הטסיות על ידי הוספת נפח שווה של 2% פורמלין.
6. לנתח דגימות לפי זרימה ציטומטרית¹⁷.
7. טסיות שער כמתואר בשלב 2.
8. נתח אירועים בשער הטסיות לאיתור ירידה בקרינה בתעלת PE (עבור צבע תיוג המיטוכונדריה) של ציטומטר הזרימה.

5. ניתוח פעילות קספאז 3 וקספאז 8 על ידי זרימה ציטומטרית

1. תוסף טסיות דם אנושיות שטופות עם 2.5 מ"מ סידן (0.5 מיקרוליטר של תמיסת CaCl₂ 0.5 M במלאי ב-100 מיקרוליטר של תרחיף טסיות דם).
2. שמרו על חלק אחד של טסיות דם ללא גירוי ועוררו את השברים הנותרים עם טרומבין (0.1 U/mL, 0.25 U/mL, או 0.5 U/mL), קונוולקסין (20 ננוגרם/מ"ל, 50 ננוגרם/מ"ל או 100 ננוגרם/מ"ל), או השילוב שלהם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
3. לאחר הגירוי, הוסף מגיב לזיהוי אפופטוזיס 1:1000 (v/v) (ראה טבלת חומרים) (עבור מסלולי אפופטוזיס פנימיים וחיצוניים כאחד) או 1:300 (v/v) FITC-IETD-FMK (עבור קספאז 8 של מסלול האפופטוזיס החיצוני) לתרחיפי הטסיות המגורים.
4. דגרו על הטסיות למשך 30 דקות בחושך.
5. תקן את הטסיות על ידי הוספת נפח שווה של 2% פורמלין.
6. לנתח דגימות לפי זרימה ציטומטרית¹⁷.
7. טסיות שער כראוי, כמתואר בשלב 2.
8. נתח אירועים בשער הטסיות לפלואורסצנטיות בתעלת FITC (עבור קספאז 3/7 או קספאז 8) של ציטומטר הזרימה.

6. אנליזה של קשירת פרותרומבין על ידי זרימה ציטומטרית

1. צימוד פרותרומבין בקר עם צבע Alexa Fluor 488 באמצעות ערכת תיוג חלבון (ראה טבלת חומרים), בהתאם להוראות היצרן.
2. תוסף טסיות דם אנושיות שטופות עם 2.5 מ"מ סידן (0.5 מיקרוליטר של תמיסת CaCl₂ 0.5 M במלאי בתרחיף טסיות של 100 מיקרוליטר).
3. שמרו על חלק אחד של טסיות דם ללא גירוי ועוררו את השברים הנותרים עם טרומבין (0.1 U/mL, 0.25 U/mL, או 0.5 U/mL), קונוולקסין (20 ננוגרם/מ"ל, 50 ננוגרם/מ"ל או 100 ננוגרם/מ"ל), או השילוב שלהם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
4. לאחר הגירוי, הוסף פרותרומבין בקר מצומד AF488 (100 מיקרוגרם/מ"ל) ו-1 מיקרוליטר כל אחד של נוגדן CD62P אנטי-אנושי PE-Annexin V ו-APC ל-100 מיקרוליטר של תרחיפי טסיות מגורים.
5. תקן את הטסיות על ידי הוספת נפח שווה של 2% פורמלין.
6. לנתח דגימות על ידי זרימה ציטומטרית¹⁷ לכימות קשירת פרותרומבין לטסיות דם.
7. צייר שער אמורפי כדי להקיף טסיות נפרדות מרעש וחלקיקים מרובי טסיות.
8. אסוף את כל נתוני הקרינה באמצעות הגברה לוגריתמית של ארבעה רבעים עבור 10,000 אירועים בשער הטסיות מכל דגימה.
9. צייר אזורים עבור טסיות דם עם פלואורסצנטיות חיוביות או שליליות לחשיפה ל-PS (כריכת Annexin V), ביטוי P-selectin (CD62P) ו-AF488-prothrombin (קשירת פרותרומבין).
10. קבע את החלק היחסי של כל אירועי טסיות הדם, כמו גם את שיעור הטסיות החיוביות הן לחשיפה ל-PS (כריכת Annexin V) והן לביטוי P-selectin (CD62P) (טסיות דם פרוקו-קרישה), החיוביות לקשירת פרותרומבין.

7. ניתוח קשירת פרותרומבין במיקרוסקופיה קונפוקלית

1. צימוד פרותרומבין בקר עם צבע Alexa Fluor 488 באמצעות ערכת תיוג חלבון (ראה טבלת חומרים), בהתאם להוראות היצרן.
2. תוסף טסיות דם אנושיות שטופות עם 2.5 מ"מ סידן (0.5 מיקרוליטר של תמיסת CaCl₂ 0.5 M במלאי בתרחיף טסיות של 100 מיקרוליטר).
3. שמרו על חלק אחד של טסיות דם ללא גירוי ועוררו את השברים הנותרים עם טרומבין (0.1 U/mL, 0.25 U/mL, או 0.5 U/mL), קונוולקסין (20 ננוגרם/מ"ל, 50 ננוגרם/מ"ל או 100 ננוגרם/מ"ל), או השילוב שלהם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
4. לאחר הגירוי, הוסף פרותרומבין בקר מצומד AF488 (100 מיקרוגרם/מ"ל) ו-1 מיקרוליטר כל אחד של נוגדן CD62P אנטי-אנושי PE-Annexin V ו-APC ל-100 מיקרוליטר של תרחיפי טסיות מגורים.
5. תקן את הטסיות על ידי הוספת נפח שווה של 2% פורמלין.
6. גלולה את הטסיות הקבועות על כיסויים מצופים פולי-D-ליזין.
7. הרכיבו כיסויים על שקופיות מיקרוסקופיה באמצעות תמיסה נגד דהייה.
8. לחלופין, כיסויי מעיל עם קולגן (100 מיקרוגרם/מ"ל) למשך שעה אחת בתא לח.
9. חסום את הכיסויים המצופים עם 0.5% BSA ב-PBS למשך שעה.
10. סמן את הטסיות עם פרותרומבין בקר מצומד AF488 (100 מיקרוגרם/מ"ל) ו-1 מיקרוליטר כל אחד של נוגדן CD62P אנטי-אנושי PE-Annexin V ו-APC.
11. אפשר לטסיות המסומנות להיצמד למשך 20 דקות על כיסויים מצופים קולגן.
12. שטפו את הכיסויים עם טסיות דביקות שלוש פעמים עם PBS.
13. תקן כיסויים עם 2% פרפורמלדהיד למשך שעה.
14. הרכיבו כיסויים על שקופיות מיקרוסקופיה באמצעות תמיסה נגד דהייה.
15. התבונן בשקופיות תחת מיקרוסקופ קונפוקלי בהגדלה אובייקטיבית של 63×.
16. לנתח את התמונות באמצעות תוכנת פיג'י לכימות פלואורסצנטי.

8. בדיקת יצירת תרומבין תלויה בפוספוליפידים על בסיס טסיות דם

1. תוסף טסיות דם אנושיות שטופות עם 2.5 מ"מ סידן (0.5 מיקרוליטר של תמיסת CaCl₂ 0.5 M במלאי ב-100 מיקרוליטר של תרחיף טסיות דם).
2. שמרו על חלק אחד של טסיות דם ללא גירוי ועוררו את השברים הנותרים עם טרומבין (0.1 U/mL, 0.25 U/mL, או 0.5 U/mL), קונוולקסין (20 ננוגרם/מ"ל, 50 ננוגרם/מ"ל או 100 ננוגרם/מ"ל), או השילוב שלהם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
3. הוסף 100 מיקרוליטר של טסיות דם מטופלות לתערובת של 50 מיקרוליטר של פלזמה רגילה מאוגדת ו-50 מיקרוליטר של תמיסת קאולין בעלת עכירות נמוכה (20 מ"ג/מ"ל), שהודגרה מראש ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
4. מוסיפים לתערובת 5 מ"מ של CaCl₂ .
5. עקוב אחר היווצרות הקריש על ידי עכירות בקורא מיקרו-פלטות, ומדוד ספיגה ב-660 ננומטר כל 60 שניות למשך שעה.

תוצאות

חלק מהטסיות המופעלות הופכות ל"פרו-קרישות" עם עלייה אופיינית בביטוי פני השטח של פוספטידילסרין (PS) ו-P-סלקטין, מה שמבדיל אותן מטסיות "אפופטוטיות" שהן חיוביות רק לחשיפה ל-PS כמו גם טסיות "פרו-אגרגטוריות" שהן חיוביות לביטוי P-selectin. מצאנו כי תרומבין גורם לעלייה תלוית מינון בשיעור ?...

Discussion

טסיות דם מעודדות קרישה מדגימות עלייה ניכרת ומתמשכת בסידן התוך תאי עם גירוי²⁶, אך ניתן להפיק אותן באמצעות מנגנונים שונים. הם נוצרים על ידי גירוי אגוניסטי חזק עם קולגן ותרומבין באמצעות מתווכים נפרדים, כולל זרם הסידן המיטוכונדריאלי^{הבולט ביותר 18...}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acid Citrate Dextrose (ACD) solution (For 1000 mL)			Tri- Sodium Citrate-            22 g Citric Acid-                            8 g Dextrose-                              24.5 g Water-                                   Make up volume to 1000 mL
Alexa Fluor 488 protein labelling kit	Invitrogen	A10235
APC Mouse Anti-Human CD62P	BD Pharmingen	550888
Bovine Prothrombin	Prolytix	BCP-1010
Buffer A (Platelet Preparation)			M.W         Conc. in 1X      For 100 mL 10X solution HEPES        238.30         20 mM                    4.766 g NaCl              58.44       134 mM                   7.83 g KCl                74.55        2.9 mM               216.19 mg MgCl2          203.30           1 mM              203.30 mg NaH2PO4    156.01        0.34 mM                53.04 mg NaHCO3        84 01           12 mM            1.01 g Water to 100 mL after adjusting pH to 6.2 Dilute 10X solution 1:10 (v/v) with Milli Q water just before platelet preparation to obtain the 1X solution that needs to be supplemented with the following                  Conc. in 1X      For 1 ml 1X solution EGTA           1 mM       Add 10 μL (1:100 v/v) 100 mM EGTA  Glucose         5 mM      Add 5 μL (1:200 v/v) 1 M glucose PGE1            3 μM      Add 3 μL (1:333 v/v) 1 mM PGE1 solution
Buffer B (Platelet Preparation)			M.W         Conc. in 1X      For 100 mL 10X solution HEPES        238.30         20 mM                    4.766 g NaCl              58.44       134 mM                   7.83 g KCl                74.55        2.9 mM               216.19 mg MgCl2          203.30           1 mM              203.30 mg NaH2PO4    156.01        0.34 mM                53.04 mg NaHCO3        84 01           12 mM            1.01 g Water to 100 mL after adjusting pH to 7.4 Dilute 10X solution 1:10 (v/v) with Milli Q water just before platelet preparation to obtain the 1X solution that needs to be supplemented with the following                  Conc. in 1X      For 1 ml 1X solution Glucose         5 mM      Add 5 μL (1:200 v/v) 1 M glucose
CaCl2 (0.5 M) (For 50ml)			Molecular weight of CaCl2.2H2O = 147.02 Dissolve 3.675 g of CaCl2.2H2O in 50 ml Milli Q water
CellEvent Caspase-3/7 Detection Reagents Green	Invitrogen	C10423	Apoptosis detection reagent
Convulxin	Enzo Life Sciences	ALX-350-100
EDTA (0.5 M; pH 8) (For 100 mL)			Molecular Weight of EDTA Na2.2H2 O: 372.24g Weigh 18.612 g and suspend in 50 ml Milli Q water and check the pH (pH~4) Slowly add 10N NaOH with stirring and monitor the pH. EDTA starts solubilizing at around pH 7 and is completely soluble at pH 8. Make up the volume to 100 ml with Milli Q water.
EGTA (100 mM; pH 7.4) (For 100 mL)			Molecular Weight: 380.4 Add 3.804 g EGTA in 50 ml Milli Q water and check the pH (pH~3) Add 10 N NaOH dropwise while stirring and monitor the pH EGTA becomes soluble at pH 7.0 (approx) Adjust pH to 7.4 Make up the volume to 100 ml with Milli Q water
FITC Mouse Anti-Human PAC-1	BD	340507
FITC-IETD-FMK Caspase 8 (active) staining kit	Abcam	ab65614
Mitotracker Red CMXRos (mitochindria labeling dye)	Invitrogen	M7512	Stock= 1 mM (50 µg dissolved in 90 µl DMSO) Sub-stock= 100 µM (10 µl Stock + 90 µl DMSO) Working concentration= 500nM (0.5 µl in 100 µl)
PE Annexin V	BD Pharmingen	560930
Prostaglandin E1	Sigma	P5515	Stock= 20 mM (1 mg dissolved in 141 µL DMSO) Sub-stock= 1 mM (10 µl Stock + 190 µL DMSO) Working concentration= 3 µM (3 µL in 1 mL)
Rhod-2 AM	Invitrogen	R1244	Stock= 5 mM (1 mg dissolved in 178 µL DMSO) Sub-stock= 100 µM (10 µL Stock + 90 µL DMSO) Working concentration= 500 nM (0.5 µL in 100 µL)
Thrombin from human plasma	Sigma	T7572