Analyse complète des plaquettes procoagulantes présentant des caractéristiques de nécrose, d’apoptose et d’activation plaquettaire

Résumé

Le protocole actuel fournit un ensemble complet de procédures nécessaires à l’analyse des plaquettes procoagulantes, qui présentent des caractéristiques de nécrose, d’apoptose et d’activation plaquettaire qui se chevauchent.

Résumé

Les plaquettes circulant dans la circulation sanguine sont relativement calmes, mais deviennent « activées » lorsqu’elles rencontrent des stimulants ou des « agonistes » sur le site de la lésion des vaisseaux sanguins. Les plaquettes proagrégatrices et procoagulantes représentent deux populations distinctes de plaquettes activées. Alors que les plaquettes pro-agrégatrices facilitent l’arrêt des saignements, ou « hémostase », en formant un bouchon de plaquettes agglomérées par des ponts de fibrinogène, les plaquettes procoagulantes accélèrent considérablement la cascade de coagulation, aboutissant à la formation de caillots de fibrine. Un aspect intéressant des plaquettes procoagulantes est que leur morphologie présente certaines caractéristiques de « nécrose » et d'« apoptose ». Ils peuvent donc représenter une forme de mort cellulaire dans les plaquettes, bien qu’ils jouent un rôle important dans la thrombose et l’hémostase. Cet article présente le concept de plaquettes procoagulantes, leur pertinence pour la santé et la maladie, et une comparaison des méthodes existantes pour leur analyse. Il fournit ensuite des protocoles complets pour analyser les plaquettes procoagulantes, étudier les mécanismes de leur formation et évaluer leur rôle prothrombotique dans la facilitation de la coagulation. L’article se termine par une discussion sur les étapes clés, les limitations et les principes de dépannage des méthodes décrites.

Introduction

Il existe au moins deux populations distinctes de plaquettes activées ^1,2. Les plaquettes pro-agrégatives sont caractérisées par une activation élevée de l’intégrine et une exposition faible, voire nulle, au PS. D’autre part, les plaquettes procoagulantes sont caractérisées par une faible activité de l’intégrine et une exposition élevée à la PS ^1,2, fournissant une surface pour l’assemblage des complexes ténase et prothrombinase³, qui est 10^{5-10 6} fois et 300000 fois plus active que les facteurs de phase solubles individuels IXa et Xa, respectivement⁴. Les plaquettes procoagulantes accélèrent ainsi considérablement la coagulation. Un aspect intéressant des plaquettes procoagulantes est que leur morphologie ressemble à certaines caractéristiques de la « nécrose » telles que la microvésiculation, le gonflement de la cellule avec perturbation cytosquelettique et la perte d’intégrité de la membrane, ainsi qu’à celles de l’apoptose telles que la perte de l’asymétrie des phospholipides membranaires avec l’exposition de la phosphatidylsérine dans le feuillet externe ^5,6. En d’autres termes, la formation de plaquettes procoagulantes peut représenter une forme de mort cellulaire dans les plaquettes, bien qu’avec une fonction physiologique importante dans l’hémostase.

Les plaquettes procoagulantes sont significativement associées aux troubles thrombotiques. Alors que la plupart des individus en bonne santé n’ont pas de plaquettes procoagulantes circulantes, ~30 % des plaquettes de donneurs normaux adoptent un phénotype procoagulant ex vivo après une exposition à des agonistes puissants tels que la thrombine et le collagène⁷. Des plaquettes procoagulantes circulantes ont été rapportées dans les traumatismes, où leur formation peut refléter l’activation par l’histone H4 ^8,9. Dans la plupart des troubles prothrombotiques, cependant, des taux accrus de plaquettes procoagulantes ne sont détectés qu’après une stimulation ex vivo ¹⁰. Par exemple, les patients ayant subi un AVC aigu chez qui >51,1 % de leurs plaquettes ont été converties en plaquettes procoagulantes (également appelées plaquettes COATed) par le collagène et la thrombine présentaient un rapport de risque de 10,72 pour un AVC récurrent dans les 30 jours par rapport aux patients dont la formation de plaquettes procoagulantes était moindre¹¹. Des résultats similaires ont été rapportés chez des patients atteints d’accidents ischémiques transitoires et d’athérosclérose carotidienne¹². En revanche, le syndrome de Scott, un trouble de la coagulation, résulte d’une mutation de ANO6, qui code pour la phospholipide scramblase TMEM-16F, entraînant une exposition déficiente des plaquettes PS¹³. Les troubles hémorragiques idiopathiques et les hémorragies intracrâniennes peuvent être associés à une diminution de la capacité à générer des plaquettes procoagulantes¹⁴.

Par conséquent, l’évaluation des plaquettes procoagulantes fait partie de toute analyse de la fonction plaquettaire non seulement lors d’investigations de base sur les mécanismes d’activation plaquettaire et la thrombose et l’hémostase qui en résultent, mais également lors de l’analyse clinique du risque de thrombose ou d’hémorragie chez les patients au cours de divers états pathologiques. Un panel de l’International Society on Thrombosis and Haemostasis (ISTH) a recommandé l’utilisation de la liaison à l’annexine V et de l’expression de la P-sélectine par cytométrie en flux pour distinguer les procoagulants des autres sous-populations plaquettaires¹⁵. L’article traite également des différentes méthodes qui peuvent être utilisées pour analyser les plaquettes procoagulantes et apoptotiques, mais ne décrit pas les processus en détail. Ces méthodes comprennent la détection de (1) l’activation plaquettaire par PAC1/JonA ou la liaison au fibrinogène (cytométrie en flux) ; (2) sécrétion d’alpha-granules par expression de la P-sélectine (cytométrie en flux) ; (3) exposition au PS par liaison à l’annexine V/lactadhérine (cytométrie en flux) ; (4) perte d’intégrité membranaire par marquage GSAO (cytométrie en flux) ; (5) les changements morphologiques comme le ballonnement (microscopie) ; (6) détection de l’activation de la caspase par dosage de la caspase (immunoblotting/luminométrie/cytométrie en flux) ou de la dégradation du substrat du cytosquelette, la gelsoline (immunoblotting) ; (7) perte de potentiel de membrane mitochondriale par des colorants sensibles au potentiel mitochondrial tels que JC-1/Mitotracker (cytométrie en flux) ; (8) les marqueurs apoptotiques intrinsèques mitochondriaux Bax, Bak et la libération du cytochrome c (immunoblotting) ; (9) la fonction procoagulante par dosage de génération de thrombine et liaison du facteur de coagulation Xa/Va (cytométrie en flux, microscopie) ; (10) Augmentation du calcium cytosolique et mitochondrial par des colorants sensibles au calcium fluorescents (cytométrie en flux, fluorométrie, microscopie).

La présente étude se penche sur des protocoles complets pour l’analyse des plaquettes procoagulantes et les distingue des plaquettes proagrégantes et apoptotiques. La plupart des procédures décrites reposent sur la cytométrie en flux qui présente les avantages de (1) être facilement disponible et facile à utiliser, (2) nécessiter un faible volume d’échantillon et (3) permettre la détection simultanée de plusieurs sous-populations de plaquettes (proagrégatoire, procoagulante et apoptotique)¹⁵. Ces protocoles basés sur la cytométrie en flux sont complétés par des tests fonctionnels de l’activité procoagulante basés sur la liaison du facteur de coagulation et des tests de génération de thrombine basés sur le caillot.

Protocole

Les participants humains ont été recrutés dans l’étude pour un prélèvement de sang veineux périphérique après avoir obtenu un consentement éclairé écrit, en suivant strictement les recommandations et l’approbation du conseil d’examen institutionnel de l’Institut de recherche Lerner de la clinique de Cleveland, toutes les méthodologies de l’étude étant conformes aux normes établies par la Déclaration d’Helsinki. Les participants adultes en bonne santé de plus de 18 ans ont été inclus, tandis que ceux de moins de 18 ans, les personnes ayant des antécédents récents d’événements thrombotiques au cours des six derniers mois, ceux ayant des antécédents d’alcoolisme ou de toxicomanie et les participants ayant utilisé des médicaments antiplaquettaires ou anticoagulants au cours des quatre dernières semaines ont été exclus. Une description détaillée des matériaux et des réactifs utilisés dans les protocoles se trouve dans la Table des matériaux.

1. Préparation des plaquettes

1. Prélever des échantillons de sang veineux périphérique dans l’anticoagulant ACD (1:9 v/v) chez les participants humains après avoir obtenu un consentement éclairé écrit, en suivant strictement les recommandations approuvées par le comité d’examen institutionnel.
2. Centrifuger le sang prélevé dans l’ACD à 100 x g pendant 20 min à 22 °C pour obtenir du plasma riche en plaquettes (PRP) comme surnageant.
3. Centrifuger le PRP à 800 x g pendant 7 min à 22 °C après ajout de 3 μM de PGE₁ et 2 mM d’EDTA.
4. Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille plaquettaire dans le tampon A (voir tableau des matériaux) par pipetage doux.
5. Centrifuger les plaquettes remises en suspension dans le tampon A à 800 x g pendant 7 min à 22 °C.
6. Remettre en suspension la pastille plaquettaire dans le tampon B (voir tableau des matériaux) par pipetage doux.
7. Ajuster la numération plaquettaire finale à 1 × 10⁷/mL à l’aide d’un compteur de cellules automatisé.
   REMARQUE : Effectuez toutes les étapes dans des conditions stériles et prenez des précautions pour maintenir les plaquettes dans un état de repos en évitant l’exposition à un cisaillement excessif pendant le pipetage.

2. Analyse des plaquettes procoagulantes par cytométrie en flux

1. Compléter les plaquettes humaines lavées avec 2,5 mM de calcium (0,5 μL de solution mère CaCl₂ 0,5 M dans 100 μL de suspension plaquettaire).
2. Gardez une fraction des plaquettes non stimulée et stimulez les fractions restantes avec de la thrombine (0,1 U/mL, 0,25 U/mL, 0,5 U/mL), de la convulxine (20 ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/mL) ou leur combinaison pendant 15 min à température ambiante.
3. Après la stimulation, ajoutez 1 μL d’anticorps PE-Annexine V, FITC-PAC1 et APC-anti-humain CD62P à 100 μL de suspensions plaquettaires stimulées.
4. Incuber les plaquettes à l’obscurité à température ambiante pendant 30 min.
5. Fixez les plaquettes en ajoutant un volume égal (1:1) de formol à 2 %.
6. Analyser les échantillons par cytométrie en flux pour quantifier les plaquettes procoagulantes^15,16.
7. Dessinez une porte amorphe pour englober les plaquettes, en les séparant du bruit et des particules multiplaquettaires.
8. Collectez toutes les données de fluorescence à l’aide de l’amplification logarithmique à quatre quadrants pour 10 000 événements dans la porte plaquettaire de chaque échantillon.
9. Définir des régions pour les plaquettes en fonction de la positivité ou de la négativité de la fluorescence pour l’exposition à la phosphatidylsérine (PS) (liaison à l’annexine V), l’expression de la sélectine P (CD62P) et l’activation de l’intégrine αIIbβ₃ (liaison PAC1).
10. Considérons que les plaquettes sont positives pour l’exposition au PS (liaison à l’annexine V) et l’expression de la P-sélectine (CD62P), mais négatives pour l’activation de l’intégrine αIIbβ₃ (liaison PAC1) en tant que plaquettes procoagulantes (Figure 1) (Tableau 1).
11. De même, considérez les plaquettes positives pour l’activation de l’intégrine αIIbβ₃ (liaison PAC1) et l’expression de la P-sélectine (CD62P), mais négatives pour l’exposition à la PS (liaison à l’annexine V) en tant que plaquettes proagrégatrices.
    REMARQUE : Les plaquettes négatives pour l’activation de l’intégrine αIIbβ₃ (liaison PAC1) et l’expression de la P-sélectine (CD62P) mais positives pour l’exposition au PS (liaison à l’annexine V) sont probablement des plaquettes apoptotiques^15,16.

3. Analyse du calcium mitochondrial par cytométrie en flux

1. Diluer les plaquettes humaines lavées à 1 × 10⁶/mL et compléter avec 2,5 mM de calcium (0,5 μL de solution mère de CaCl₂ 0,5 M dans une suspension plaquettaire de 100 μL).
2. Étiqueter les plaquettes avec 5 μM Rhod-2 AM (pour le calcium mitochondrial) pendant 30 min dans l’obscurité.
3. Éliminez les plaquettes de manière appropriée, comme décrit à l’étape 2.
4. Analysez les événements dans la porte plaquettaire pour les changements dépendants du temps de la fluorescence moyenne des événements acquis sur 5 min à l’aide d’un nuage de points de densité de la fluorescence PE (pour Rhod-2 AM) en fonction du temps.
5. Enregistrez les taux de calcium de base pendant les 1 première minute.
6. Ajoutez de la thrombine (0,1 U/mL, 0,25 U/mL ou 0,5 U/mL), des convulxines (20 ng/mL, 50 ng/mL ou 100 ng/mL) ou leur combinaison, et continuez à recueillir des données pendant encore 4 min¹⁷.

4. Analyse du potentiel de la membrane mitochondriale par cytométrie en flux

1. Compléter les plaquettes humaines lavées avec 2,5 mM de calcium (0,5 μL de solution mère CaCl₂ 0,5 M dans 100 μL de suspension plaquettaire).
2. Gardez une fraction de plaquettes non stimulée et stimulez les fractions restantes avec de la thrombine (0,1 U/mL, 0,25 U/mL ou 0,5 U/mL), de la convulxine (20 ng/mL, 50 ng/mL ou 100 ng/mL) ou leur combinaison pendant 15 min à température ambiante.
3. Après la stimulation, ajouter un colorant de marquage des mitochondries (voir le tableau des matériaux) à une concentration finale de 500 nM aux suspensions plaquettaires stimulées.
4. Incuber les plaquettes pendant 30 min dans l’obscurité.
5. Fixez les plaquettes en ajoutant un volume égal de formol à 2 %.
6. Analyse d’échantillons par cytométrie en flux¹⁷.
7. Éliminez les plaquettes de manière appropriée comme décrit à l’étape 2.
8. Analysez les événements dans la porte plaquettaire pour une baisse de fluorescence dans le canal PE (pour le colorant de marquage des mitochondries) du cytomètre en flux.

5. Analyse de l’activité de la caspase 3 et de la caspase 8 par cytométrie en flux

1. Compléter les plaquettes humaines lavées avec 2,5 mM de calcium (0,5 μL de solution mère CaCl₂ 0,5 M dans 100 μL de suspension plaquettaire).
2. Gardez une fraction de plaquettes non stimulée et stimulez les fractions restantes avec de la thrombine (0,1 U/mL, 0,25 U/mL ou 0,5 U/mL), de la convulxine (20 ng/mL, 50 ng/mL ou 100 ng/mL) ou leur combinaison pendant 15 min à température ambiante.
3. Après la stimulation, ajouter soit un réactif de détection de l’apoptose 1:1000 (v/v) (voir le tableau des matériaux) (pour les voies d’apoptose intrinsèque et extrinsèque), soit 1:300 (v/v) FITC-IETD-FMK (pour la caspase 8 de la voie d’apoptose extrinsèque) aux suspensions plaquettaires stimulées.
4. Incuber les plaquettes pendant 30 min dans l’obscurité.
5. Fixez les plaquettes en ajoutant un volume égal de formol à 2 %.
6. Analyse d’échantillons par cytométrie en flux¹⁷.
7. Éliminez les plaquettes de manière appropriée, comme décrit à l’étape 2.
8. Analysez les événements dans la porte plaquettaire pour la fluorescence dans le canal FITC (pour la caspase 3/7 ou la caspase 8) du cytomètre en flux.

6. Analyse de la liaison de la prothrombine par cytométrie en flux

1. Conjuguez la prothrombine bovine avec le colorant Alexa Fluor 488 à l’aide d’un kit d’étiquetage des protéines (voir le tableau des matériaux), en suivant les instructions du fabricant.
2. Compléter les plaquettes humaines lavées avec 2,5 mM de calcium (0,5 μL de solution mère de CaCl₂ 0,5 M dans une suspension plaquettaire de 100 μL).
3. Gardez une fraction de plaquettes non stimulée et stimulez les fractions restantes avec de la thrombine (0,1 U/mL, 0,25 U/mL ou 0,5 U/mL), de la convulxine (20 ng/mL, 50 ng/mL ou 100 ng/mL) ou leur combinaison pendant 15 min à température ambiante.
4. Après la stimulation, ajoutez de la prothrombine bovine conjuguée à l’AF488 (100 μg/mL) et 1 μL de PE-Annexine V et d’anticorps anti-CD62P humain APC à 100 μL de suspensions plaquettaires stimulées.
5. Fixez les plaquettes en ajoutant un volume égal de formol à 2 %.
6. Analyser des échantillons par cytométrie en flux¹⁷ pour la quantification de la liaison de la prothrombine aux plaquettes.
7. Dessinez une porte amorphe pour englober les plaquettes séparément du bruit et les particules multiplaquettaires.
8. Collectez toutes les données de fluorescence à l’aide de l’amplification logarithmique à quatre quadrants pour 10 000 événements dans la porte plaquettaire de chaque échantillon.
9. Dessiner des régions pour les plaquettes avec une fluorescence positive ou négative pour l’exposition au PS (liaison à l’annexine V), l’expression de la P-sélectine (CD62P) et la prothrombine AF488 (liaison à la prothrombine).
10. Déterminer la proportion de tous les événements plaquettaires, ainsi que la proportion de plaquettes positives pour l’exposition au PS (liaison à l’annexine V) et l’expression de la P-sélectine (CD62P) (plaquettes procoagulantes), qui sont positives pour la liaison à la prothrombine.

7. Analyse de la liaison de la prothrombine par microscopie confocale

1. Conjuguez la prothrombine bovine avec le colorant Alexa Fluor 488 à l’aide d’un kit d’étiquetage des protéines (voir le tableau des matériaux), en suivant les instructions du fabricant.
2. Compléter les plaquettes humaines lavées avec 2,5 mM de calcium (0,5 μL de solution mère de CaCl₂ 0,5 M dans une suspension plaquettaire de 100 μL).
3. Gardez une fraction de plaquettes non stimulée et stimulez les fractions restantes avec de la thrombine (0,1 U/mL, 0,25 U/mL ou 0,5 U/mL), de la convulxine (20 ng/mL, 50 ng/mL ou 100 ng/mL) ou leur combinaison pendant 15 min à température ambiante.
4. Après la stimulation, ajoutez de la prothrombine bovine conjuguée à l’AF488 (100 μg/mL) et 1 μL de PE-Annexine V et d’anticorps anti-CD62P humain APC à 100 μL de suspensions plaquettaires stimulées.
5. Fixez les plaquettes en ajoutant un volume égal de formol à 2 %.
6. Granulez les plaquettes fixées sur des lamelles enrobées de poly-D-lysine.
7. Montez les lamelles sur les lames de microscopie à l’aide d’une solution anti-décoloration.
8. Vous pouvez également enduire les lamelles de collagène (100 μg/mL) pendant 1 h dans une chambre humide.
9. Bloquer les lamelles enrobées avec 0,5 % de BSA dans du PBS pendant 1 h.
10. Étiquetez les plaquettes avec de la prothrombine bovine conjuguée à l’AF488 (100 μg/mL) et 1 μL chacun d’anticorps PE-Annexine V et d’anticorps anti-CD62P humain APC.
11. Laissez les plaquettes étiquetées adhérer pendant 20 minutes sur des lamelles enrobées de collagène.
12. Lavez trois fois les lamelles avec des plaquettes adhérentes avec du PBS.
13. Fixer les lamelles avec 2 % de paraformaldéhyde pendant 1 h.
14. Montez les lamelles sur les lames de microscopie à l’aide d’une solution anti-décoloration.
15. Observez les lames sous un microscope confocal à 63× grossissement de l’objectif.
16. Analysez les images à l’aide d’un logiciel Fidji pour la quantification de la fluorescence.

8. Test de génération de thrombine dépendante des phospholipides plaquettaires à base de caillot

1. Compléter les plaquettes humaines lavées avec 2,5 mM de calcium (0,5 μL de solution mère CaCl₂ 0,5 M dans 100 μL de suspension plaquettaire).
2. Gardez une fraction de plaquettes non stimulée et stimulez les fractions restantes avec de la thrombine (0,1 U/mL, 0,25 U/mL ou 0,5 U/mL), de la convulxine (20 ng/mL, 50 ng/mL ou 100 ng/mL) ou leur combinaison pendant 15 min à température ambiante.
3. Ajouter 100 μL de plaquettes traitées à un mélange de 50 μL de plasma normal mélangé et de 50 μL de solution de kaolin à faible turbidité (20 mg/mL), préincubé à 37 °C pendant 5 min.
4. Ajouter 5 mM de CaCl₂ au mélange.
5. Surveiller la formation de caillots par turbidimétrie sur un lecteur de microplaques, en mesurant l’absorbance à 660 nm toutes les 60 s pendant 1 h.

Résultats

Une proportion de plaquettes activées devient « procoagulante » avec une augmentation caractéristique de l’expression de surface de la phosphatidylsérine (PS) et de la P-sélectine, ce qui les distingue des plaquettes « apoptotiques » qui ne sont positives que pour l’exposition à la PS ainsi que des plaquettes « proagrégatives » qui sont positives pour l’expression de la P-sélectine. Nous avons constaté que la thrombine induit une augmentation dose-dépendante de la pr...

Discussion

Les plaquettes procoagulantes présentent des augmentations marquées et soutenues du calcium intracellulaire lors de la stimulation²⁶, mais peuvent être dérivées par différents mécanismes. Ils sont générés lors d’une forte stimulation agoniste avec du collagène et de la thrombine par l’intermédiaire de médiateurs distincts, y compris le plus important l’afflux de calcium mitochondrial^18,19

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acid Citrate Dextrose (ACD) solution (For 1000 mL)			Tri- Sodium Citrate-            22 g Citric Acid-                            8 g Dextrose-                              24.5 g Water-                                   Make up volume to 1000 mL
Alexa Fluor 488 protein labelling kit	Invitrogen	A10235
APC Mouse Anti-Human CD62P	BD Pharmingen	550888
Bovine Prothrombin	Prolytix	BCP-1010
Buffer A (Platelet Preparation)			M.W         Conc. in 1X      For 100 mL 10X solution HEPES        238.30         20 mM                    4.766 g NaCl              58.44       134 mM                   7.83 g KCl                74.55        2.9 mM               216.19 mg MgCl2          203.30           1 mM              203.30 mg NaH2PO4    156.01        0.34 mM                53.04 mg NaHCO3        84 01           12 mM            1.01 g Water to 100 mL after adjusting pH to 6.2 Dilute 10X solution 1:10 (v/v) with Milli Q water just before platelet preparation to obtain the 1X solution that needs to be supplemented with the following                  Conc. in 1X      For 1 ml 1X solution EGTA           1 mM       Add 10 μL (1:100 v/v) 100 mM EGTA  Glucose         5 mM      Add 5 μL (1:200 v/v) 1 M glucose PGE1            3 μM      Add 3 μL (1:333 v/v) 1 mM PGE1 solution
Buffer B (Platelet Preparation)			M.W         Conc. in 1X      For 100 mL 10X solution HEPES        238.30         20 mM                    4.766 g NaCl              58.44       134 mM                   7.83 g KCl                74.55        2.9 mM               216.19 mg MgCl2          203.30           1 mM              203.30 mg NaH2PO4    156.01        0.34 mM                53.04 mg NaHCO3        84 01           12 mM            1.01 g Water to 100 mL after adjusting pH to 7.4 Dilute 10X solution 1:10 (v/v) with Milli Q water just before platelet preparation to obtain the 1X solution that needs to be supplemented with the following                  Conc. in 1X      For 1 ml 1X solution Glucose         5 mM      Add 5 μL (1:200 v/v) 1 M glucose
CaCl2 (0.5 M) (For 50ml)			Molecular weight of CaCl2.2H2O = 147.02 Dissolve 3.675 g of CaCl2.2H2O in 50 ml Milli Q water
CellEvent Caspase-3/7 Detection Reagents Green	Invitrogen	C10423	Apoptosis detection reagent
Convulxin	Enzo Life Sciences	ALX-350-100
EDTA (0.5 M; pH 8) (For 100 mL)			Molecular Weight of EDTA Na2.2H2 O: 372.24g Weigh 18.612 g and suspend in 50 ml Milli Q water and check the pH (pH~4) Slowly add 10N NaOH with stirring and monitor the pH. EDTA starts solubilizing at around pH 7 and is completely soluble at pH 8. Make up the volume to 100 ml with Milli Q water.
EGTA (100 mM; pH 7.4) (For 100 mL)			Molecular Weight: 380.4 Add 3.804 g EGTA in 50 ml Milli Q water and check the pH (pH~3) Add 10 N NaOH dropwise while stirring and monitor the pH EGTA becomes soluble at pH 7.0 (approx) Adjust pH to 7.4 Make up the volume to 100 ml with Milli Q water
FITC Mouse Anti-Human PAC-1	BD	340507
FITC-IETD-FMK Caspase 8 (active) staining kit	Abcam	ab65614
Mitotracker Red CMXRos (mitochindria labeling dye)	Invitrogen	M7512	Stock= 1 mM (50 µg dissolved in 90 µl DMSO) Sub-stock= 100 µM (10 µl Stock + 90 µl DMSO) Working concentration= 500nM (0.5 µl in 100 µl)
PE Annexin V	BD Pharmingen	560930
Prostaglandin E1	Sigma	P5515	Stock= 20 mM (1 mg dissolved in 141 µL DMSO) Sub-stock= 1 mM (10 µl Stock + 190 µL DMSO) Working concentration= 3 µM (3 µL in 1 mL)
Rhod-2 AM	Invitrogen	R1244	Stock= 5 mM (1 mg dissolved in 178 µL DMSO) Sub-stock= 100 µM (10 µL Stock + 90 µL DMSO) Working concentration= 500 nM (0.5 µL in 100 µL)
Thrombin from human plasma	Sigma	T7572