Análisis exhaustivo de plaquetas procoagulantes que presentan características de necrosis, apoptosis y activación plaquetaria

Resumen

El presente protocolo proporciona un conjunto completo de procedimientos necesarios para analizar las plaquetas procoagulantes, que exhiben características superpuestas de necrosis, apoptosis y activación plaquetaria.

Resumen

Las plaquetas que circulan en el torrente sanguíneo están relativamente quietas, pero se "activan" al encontrarse con estimulantes o "agonistas" en el sitio de la lesión de los vasos sanguíneos. Las plaquetas proagregatorias y procoagulantes representan dos poblaciones distintas de plaquetas activadas. Mientras que las plaquetas proagregatorias facilitan el cese de la hemorragia, o "hemostasia", al formar un tapón de plaquetas agrupadas a través de puentes de fibrinógeno, las plaquetas procoagulantes aceleran drásticamente la cascada de coagulación, culminando en la formación de coágulos de fibrina. Un aspecto interesante de las plaquetas procoagulantes es que su morfología exhibe ciertas características de "necrosis" y "apoptosis". Por lo tanto, pueden representar una forma de muerte celular en las plaquetas, aunque con un papel importante en la trombosis y la hemostasia. En este artículo se presenta el concepto de plaquetas procoagulantes, su relevancia para la salud y la enfermedad, y se comparan los métodos existentes para su análisis. A continuación, proporciona protocolos completos para analizar las plaquetas procoagulantes, investigar los mecanismos de su formación y evaluar su papel protrombótico en la facilitación de la coagulación. El artículo concluye con una descripción de los pasos clave, las limitaciones y los principios de solución de problemas para los métodos descritos.

Introducción

Existen al menos dos poblaciones distintas de plaquetas activadas ^1,2. Las plaquetas proagregatorias se caracterizan por una alta activación de integrinas y una baja o nula exposición a PS. Por otro lado, las plaquetas procoagulantes se caracterizan por una baja actividad de integrinas y una alta exposición a PS ^1,2, proporcionando una superficie para el ensamblaje de los complejos tenasa y protrombinasa³, que es 10,^5-10,⁶ veces y 300000 veces más activa que los factores IXa y Xa de la fase soluble individual, respectivamente⁴. Por lo tanto, las plaquetas procoagulantes aceleran drásticamente la coagulación. Un aspecto interesante de las plaquetas procoagulantes es que su morfología se asemeja a ciertas características de "necrosis" como la microvesiculación, abombamiento de la célula con disrupción del citoesqueleto y pérdida de la integridad de la membrana, así como las de "apoptosis" como la pérdida de la asimetría de los fosfolípidos de la membrana con la exposición de fosfatidilserina en la valva externa ^5,6. En otras palabras, la formación de plaquetas procoagulantes puede representar una forma de muerte celular en las plaquetas, aunque con una importante función fisiológica en la hemostasia.

Las plaquetas procoagulantes se asocian significativamente con trastornos trombóticos. Si bien la mayoría de las personas sanas no tienen plaquetas procoagulantes circulantes, ~ 30% de las plaquetas normales de donantes adoptan un fenotipo procoagulante ex vivo después de la exposición a agonistas fuertes como la trombina y el colágeno⁷. Se han descrito plaquetas procoagulantes circulantes en traumatismos, donde su formación puede reflejar la activación por la histona H4 ^8,9. Sin embargo, en la mayoría de los trastornos protrombóticos, el aumento de los niveles de plaquetas procoagulantes solo se detecta después de la estimulación ex vivo ¹⁰. Por ejemplo, los pacientes con accidente cerebrovascular agudo en los que el >51,1% de sus plaquetas fueron convertidas en plaquetas procoagulantes (también conocidas como plaquetas COATed) por el colágeno y la trombina tenían un cociente de riesgo de 10,72 para el accidente cerebrovascular recurrente dentro de los 30 días en comparación con los pacientes con menor formación de plaquetas procoagulantes¹¹. Se han reportado resultados similares en pacientes con accidentes isquémicos transitorios y aterosclerosis carotídea¹². Por el contrario, el trastorno hemorrágico síndrome de Scott es el resultado de una mutación de ANO6, que codifica la fosfolípida escamblasa TMEM-16F, lo que conduce a una exposición deficiente a la PS plaquetaria¹³. Los trastornos hemorrágicos idiopáticos y la hemorragia intracraneal pueden estar asociados a una disminución de la capacidad de generar plaquetas procoagulantes¹⁴.

Por lo tanto, la evaluación de las plaquetas procoagulantes es parte de cualquier análisis de la función plaquetaria no solo durante las investigaciones básicas sobre los mecanismos de activación plaquetaria y la consiguiente trombosis y hemostasia, sino también durante el análisis clínico del riesgo de trombosis o sangrado en pacientes durante diversos estados patológicos. Un panel de la Sociedad Internacional de Trombosis y Hemostasia (ISTH) recomendó el uso de la unión a la anexina V y la expresión de P-selectina por citometría de flujo para distinguir los procoagulantes de otras subpoblaciones plaquetarias¹⁵. El artículo también discute los diversos métodos que se pueden utilizar para analizar las plaquetas procoagulantes y apoptóticas, pero no llega a describir los procesos en detalle. Estos métodos incluyen la detección de (1) la activación plaquetaria por PAC1/JonA o unión a fibrinógeno (citometría de flujo); (2) secreción de gránulos alfa por expresión de P-selectina (citometría de flujo); (3) Exposición a PS por unión a anexina V/lactadherina (citometría de flujo); (4) pérdida de la integridad de la membrana por el marcaje GSAO (citometría de flujo); (5) cambios morfológicos como aglomeración (microscopía); (6) detección de la activación de caspasas mediante ensayo de caspasas (inmunotransferencia/luminometría/citometría de flujo) o degradación del sustrato del citoesqueleto gelsolina (inmunotransferencia); (7) pérdida de potencial de membrana mitocondrial por colorantes sensibles al potencial mitocondrial como JC-1/Mitotracker (citometría de flujo); (8) liberación de marcadores apoptóticos intrínsecos mitocondriales Bax, Bak y citocromo c (inmunotransferencia); (9) función procoagulante por ensayo de generación de trombina y unión al factor de coagulación Xa/Va (citometría de flujo, microscopía); (10) Aumento del calcio citosólico y mitocondrial mediante colorantes fluorescentes sensibles al calcio (citometría de flujo, fluorometría, microscopía).

El presente estudio profundiza en los protocolos integrales para el análisis de las plaquetas procoagulantes, así como en su distinción de las plaquetas proagregatorias y apoptóticas. La mayoría de los procedimientos descritos se basan en la citometría de flujo, que tiene las ventajas de (1) estar fácilmente disponible y ser fácil de usar, (2) requerir un volumen de muestra bajo y (3) permitir la detección simultánea de múltiples subpoblaciones de plaquetas (proagregativas, procoagulantes y apoptóticas)¹⁵. Estos protocolos basados en citometría de flujo se complementan con ensayos funcionales de actividad procoagulante basados en la unión de factores de coagulación y ensayos de generación de trombina basados en coágulos.

Protocolo

Los participantes humanos fueron reclutados en el estudio para la toma de muestras de sangre venosa periférica después de obtener el consentimiento informado por escrito, siguiendo estrictamente las recomendaciones y la aprobación de la Junta de Revisión Institucional del Instituto de Investigación Lerner de la Clínica Cleveland, con todas las metodologías de estudio conformes a los estándares establecidos por la Declaración de Helsinki. Se incluyeron participantes adultos sanos mayores de 18 años, mientras que se excluyeron los menores de 18 años, las personas con antecedentes recientes de eventos trombóticos en los últimos seis meses, aquellos con antecedentes de alcoholismo o abuso de drogas y los participantes que habían usado medicamentos antiplaquetarios o anticoagulantes en las últimas cuatro semanas. Una descripción detallada de los materiales y reactivos utilizados en los protocolos se puede encontrar en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de plaquetas

1. Extraer muestras de sangre venosa periférica en el anticoagulante ACD (1:9 v/v) de los participantes humanos después de obtener el consentimiento informado por escrito, siguiendo estrictamente las recomendaciones aprobadas por la Junta de Revisión Institucional.
2. Centrifugar la sangre recogida en ACD a 100 x g durante 20 min a 22 °C para obtener plasma rico en plaquetas (PRP) como sobrenadante.
3. Centrifugar el PRP a 800 x g durante 7 min a 22 °C después de añadir 3 μM de PGE₁ y 2 mM de EDTA.
4. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo de plaquetas en el tampón A (ver Tabla de Materiales) mediante un pipeteo suave.
5. Centrifugar las plaquetas resuspendidas en tampón A a 800 x g durante 7 min a 22 °C.
6. Vuelva a suspender el gránulo de plaquetas en el tampón B (consulte la tabla de materiales) mediante un pipeteo suave.
7. Ajuste el recuento final de plaquetas a 1 × 10⁷/mL utilizando un contador de células automatizado.
   NOTA: Realice todos los pasos en condiciones estériles y tome precauciones para mantener las plaquetas en un estado de reposo evitando la exposición a un cizallamiento excesivo durante el pipeteo.

2. Análisis de plaquetas procoagulantes por citometría de flujo

1. Suplementar las plaquetas humanas lavadas con 2,5 mM de calcio (0,5 μL de solución de CaCl₂ 0,5 M en 100 μL de suspensión de plaquetas).
2. Mantenga una fracción de plaquetas sin estimular y estimule las fracciones restantes con trombina (0,1 U/mL, 0,25 U/mL, 0,5 U/mL), convulxina (20 ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/mL) o su combinación durante 15 min a temperatura ambiente.
3. Después de la estimulación, añadir 1 μL de PE-anexina V, FITC-PAC1 y 1 μl de anticuerpo APC-anti-CD62P humano a 100 μL de suspensiones plaquetarias estimuladas.
4. Incubar las plaquetas en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 min.
5. Fije las plaquetas añadiendo un volumen igual (1:1) de formalina al 2%.
6. Analizar las muestras por citometría de flujo para cuantificar las plaquetas procoagulantes^15,16.
7. Dibuja una puerta amorfa para abarcar las plaquetas, separándolas del ruido y las partículas multiplaquetarias.
8. Recopile todos los datos de fluorescencia utilizando amplificación logarítmica de cuatro cuadrantes para 10.000 eventos en la puerta de plaquetas de cada muestra.
9. Defina las regiones para las plaquetas en función de la positividad de fluorescencia o la negatividad para la exposición a la fosfatidilserina (PS) (unión a la anexina V), la expresión de P-selectina (CD62P) y la activación de la integrina αIIbβ₃ (unión a PAC1).
10. Considerar las plaquetas positivas tanto para la exposición a PS (unión a la anexina V) como para la expresión de P-selectina (CD62P), pero negativas para la activación de la integrina αIIbβ₃ (unión a PAC1) como plaquetas procoagulantes (Figura 1) (Tabla 1).
11. Del mismo modo, considere las plaquetas positivas para la activación de la integrina αIIbβ₃ (unión a PAC1) y la expresión de P-selectina (CD62P), pero negativas para la exposición a PS (unión a la anexina V) como plaquetas proagregadoras.
    NOTA: Las plaquetas negativas tanto para la activación de la integrina αIIbβ₃ (unión a PAC1) como para la expresión de P-selectina (CD62P), pero positivas para la exposición a PS (unión a la anexina V) son probablemente plaquetas apoptóticas^15,16.

3. Análisis del calcio mitocondrial por citometría de flujo

1. Diluir las plaquetas humanas lavadas a 1 × 10⁶/mL y complementar con 2,5 mM de calcio (0,5 μL de solución de CaCl₂ 0,5 M en suspensión de plaquetas de 100 μL).
2. Etiquete las plaquetas con 5 μM de Rhod-2 AM (para calcio mitocondrial) durante 30 minutos en la oscuridad.
3. Plaquetas de puerta apropiadamente, como se describe en el paso 2.
4. Analice los eventos en la puerta de las plaquetas para los cambios dependientes del tiempo en la fluorescencia media de los eventos adquiridos durante 5 min utilizando un diagrama de dispersión de densidad de fluorescencia PE (para Rhod-2 AM) frente al tiempo.
5. Registre los niveles basales de calcio durante el primer 1 minuto.
6. Agregue trombina (0,1 U/mL, 0,25 U/mL o 0,5 U/mL), convulxina (20 ng/mL, 50 ng/mL o 100 ng/mL), o su combinación, y continúe adquiriendo datos durante otros 4 min¹⁷.

4. Análisis del potencial de membrana mitocondrial por citometría de flujo

1. Suplementar las plaquetas humanas lavadas con 2,5 mM de calcio (0,5 μL de solución de CaCl₂ 0,5 M en 100 μL de suspensión de plaquetas).
2. Mantenga una fracción de plaquetas sin estimular y estimule las fracciones restantes con trombina (0,1 U/mL, 0,25 U/mL o 0,5 U/mL), convulxina (20 ng/mL, 50 ng/mL o 100 ng/mL) o su combinación durante 15 min a temperatura ambiente.
3. Después de la estimulación, agregue colorante de marcado de mitocondrias (ver Tabla de Materiales) a una concentración final de 500 nM a las suspensiones plaquetarias estimuladas.
4. Incubar las plaquetas durante 30 min en la oscuridad.
5. Fije las plaquetas agregando un volumen igual de formalina al 2%.
6. Análisis de muestras por citometría de flujo¹⁷.
7. Plaquetas de puerta apropiadamente como se describe en el paso 2.
8. Analice los eventos en la puerta plaquetaria para una caída de fluorescencia en el canal de PE (para el colorante de marcado de mitocondrias) del citómetro de flujo.

5. Análisis de la actividad de la caspasa 3 y la caspasa 8 por citometría de flujo

1. Suplementar las plaquetas humanas lavadas con 2,5 mM de calcio (0,5 μL de solución de CaCl₂ 0,5 M en 100 μL de suspensión de plaquetas).
2. Mantenga una fracción de plaquetas sin estimular y estimule las fracciones restantes con trombina (0,1 U/mL, 0,25 U/mL o 0,5 U/mL), convulxina (20 ng/mL, 50 ng/mL o 100 ng/mL) o su combinación durante 15 min a temperatura ambiente.
3. Después de la estimulación, agregue un reactivo de detección de apoptosis 1:1000 (v/v) (ver Tabla de Materiales) (para las vías de apoptosis intrínsecas y extrínsecas) o 1:300 (v/v) FITC-IETD-FMK (para la caspasa 8 de la vía de apoptosis extrínseca) a las suspensiones plaquetarias estimuladas.
4. Incubar las plaquetas durante 30 min en la oscuridad.
5. Fije las plaquetas agregando un volumen igual de formalina al 2%.
6. Análisis de muestras por citometría de flujo¹⁷.
7. Plaquetas de puerta apropiadamente, como se describe en el paso 2.
8. Analice los eventos en la puerta plaquetaria para la fluorescencia en el canal FITC (para caspasa 3/7 o caspasa 8) del citómetro de flujo.

6. Análisis de la unión de protrombina por citometría de flujo

1. Conjugue la protrombina bovina con el colorante Alexa Fluor 488 utilizando un kit de etiquetado de proteínas (consulte la Tabla de materiales), siguiendo las instrucciones del fabricante.
2. Suplementar las plaquetas humanas lavadas con 2,5 mM de calcio (0,5 μL de solución de CaCl₂ 0,5 M en suspensión de plaquetas de 100 μL).
3. Mantenga una fracción de plaquetas sin estimular y estimule las fracciones restantes con trombina (0,1 U/mL, 0,25 U/mL o 0,5 U/mL), convulxina (20 ng/mL, 50 ng/mL o 100 ng/mL) o su combinación durante 15 min a temperatura ambiente.
4. Después de la estimulación, añadir protrombina bovina conjugada con AF488 (100 μg/mL) y 1 μL de PE-Anexina V y 1 μL de anticuerpo anti-CD62P humano APC a 100 μL de suspensiones plaquetarias estimuladas.
5. Fije las plaquetas agregando un volumen igual de formalina al 2%.
6. Analizar muestras por citometría de flujo¹⁷ para la cuantificación de la unión de la protrombina a las plaquetas.
7. Dibuje una puerta amorfa para abarcar las plaquetas separadas del ruido y las partículas multiplaquetarias.
8. Recopile todos los datos de fluorescencia utilizando amplificación logarítmica de cuatro cuadrantes para 10.000 eventos en la puerta de plaquetas de cada muestra.
9. Regiones de dibujo para plaquetas con fluorescencia positiva o negativa para la exposición a PS (unión a la anexina V), la expresión de P-selectina (CD62P) y AF488-protrombina (unión a la protrombina).
10. Determinar la proporción de todos los eventos plaquetarios, así como la proporción de plaquetas positivas tanto para la exposición a PS (unión a la anexina V) como para la expresión de P-selectina (CD62P) (plaquetas procoagulantes), que son positivas para la unión a la protrombina.

7. Análisis de la unión de protrombina por microscopía confocal

1. Conjugue la protrombina bovina con el colorante Alexa Fluor 488 utilizando un kit de etiquetado de proteínas (consulte la Tabla de materiales), siguiendo las instrucciones del fabricante.
2. Suplementar las plaquetas humanas lavadas con 2,5 mM de calcio (0,5 μL de solución de CaCl₂ 0,5 M en suspensión de plaquetas de 100 μL).
3. Mantenga una fracción de plaquetas sin estimular y estimule las fracciones restantes con trombina (0,1 U/mL, 0,25 U/mL o 0,5 U/mL), convulxina (20 ng/mL, 50 ng/mL o 100 ng/mL) o su combinación durante 15 min a temperatura ambiente.
4. Después de la estimulación, añadir protrombina bovina conjugada con AF488 (100 μg/mL) y 1 μL de PE-Anexina V y 1 μL de anticuerpo anti-CD62P humano APC a 100 μL de suspensiones plaquetarias estimuladas.
5. Fije las plaquetas agregando un volumen igual de formalina al 2%.
6. Granule las plaquetas fijadas en cubreobjetos recubiertos de poli-D-lisina.
7. Monte los cubreobjetos en los portaobjetos de microscopía con una solución antidecoloración.
8. Alternativamente, cubra los cubrebotines con colágeno (100 μg/mL) durante 1 h en una cámara húmeda.
9. Bloquee los cubreobjetos recubiertos con 0,5% de BSA en PBS durante 1 h.
10. Etiquete las plaquetas con protrombina bovina conjugada con AF488 (100 μg/mL) y 1 μL de PE-anexina V y 1 μL de anticuerpo CD62P humano APC.
11. Deje que las plaquetas etiquetadas se adhieran durante 20 minutos en cubreobjetos recubiertos de colágeno.
12. Lave los cubreobjetos con plaquetas adheridas tres veces con PBS.
13. Fije los cubreobjetos con paraformaldehído al 2% durante 1 h.
14. Monte los cubreobjetos en los portaobjetos de microscopía con una solución antidecoloración.
15. Observe los portaobjetos bajo un microscopio confocal con un aumento objetivo del 63×.
16. Analice las imágenes utilizando el software Fiji para la cuantificación de fluorescencia.

8. Ensayo de generación de trombina dependiente de fosfolípidos plaquetarios basado en coágulos

1. Suplementar las plaquetas humanas lavadas con 2,5 mM de calcio (0,5 μL de solución de CaCl₂ 0,5 M en 100 μL de suspensión de plaquetas).
2. Mantenga una fracción de plaquetas sin estimular y estimule las fracciones restantes con trombina (0,1 U/mL, 0,25 U/mL o 0,5 U/mL), convulxina (20 ng/mL, 50 ng/mL o 100 ng/mL) o su combinación durante 15 min a temperatura ambiente.
3. Añadir 100 μL de plaquetas tratadas a una mezcla de 50 μL de plasma normal agrupado y 50 μL de solución de caolín de baja turbidez (20 mg/mL), preincubada a 37 °C durante 5 min.
4. Añade 5 mM de CaCl₂ a la mezcla.
5. Monitorice la formación de coágulos mediante turbidimetría en un lector de microplacas, midiendo la absorbancia a 660 nm cada 60 s durante 1 h.

Resultados

Una proporción de plaquetas activadas se vuelven "procoagulantes" con un aumento característico en la expresión superficial tanto de fosfatidilserina (PS) como de P-selectina, lo que las distingue de las plaquetas "apoptóticas" que son positivas solo para la exposición a PS, así como de las plaquetas "proagregadoras" que son positivas para la expresión de P-selectina. Encontramos que la trombina induce un aumento dependiente de la dosis en la proporción de plaquetas procoagulante...

Discusión

Las plaquetas procoagulantes muestran aumentos marcados y sostenidos de calcio intracelular tras la estimulación²⁶, pero pueden derivarse a través de diferentes mecanismos. Se generan tras una fuerte estimulación de agonistas con colágeno y trombina a través de distintos mediadores, incluido el más prominente influjo de calcio mitocondrial ^18,19 a lo largo del gradiente electroquímico a través de l...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acid Citrate Dextrose (ACD) solution (For 1000 mL)			Tri- Sodium Citrate-            22 g Citric Acid-                            8 g Dextrose-                              24.5 g Water-                                   Make up volume to 1000 mL
Alexa Fluor 488 protein labelling kit	Invitrogen	A10235
APC Mouse Anti-Human CD62P	BD Pharmingen	550888
Bovine Prothrombin	Prolytix	BCP-1010
Buffer A (Platelet Preparation)			M.W         Conc. in 1X      For 100 mL 10X solution HEPES        238.30         20 mM                    4.766 g NaCl              58.44       134 mM                   7.83 g KCl                74.55        2.9 mM               216.19 mg MgCl2          203.30           1 mM              203.30 mg NaH2PO4    156.01        0.34 mM                53.04 mg NaHCO3        84 01           12 mM            1.01 g Water to 100 mL after adjusting pH to 6.2 Dilute 10X solution 1:10 (v/v) with Milli Q water just before platelet preparation to obtain the 1X solution that needs to be supplemented with the following                  Conc. in 1X      For 1 ml 1X solution EGTA           1 mM       Add 10 μL (1:100 v/v) 100 mM EGTA  Glucose         5 mM      Add 5 μL (1:200 v/v) 1 M glucose PGE1            3 μM      Add 3 μL (1:333 v/v) 1 mM PGE1 solution
Buffer B (Platelet Preparation)			M.W         Conc. in 1X      For 100 mL 10X solution HEPES        238.30         20 mM                    4.766 g NaCl              58.44       134 mM                   7.83 g KCl                74.55        2.9 mM               216.19 mg MgCl2          203.30           1 mM              203.30 mg NaH2PO4    156.01        0.34 mM                53.04 mg NaHCO3        84 01           12 mM            1.01 g Water to 100 mL after adjusting pH to 7.4 Dilute 10X solution 1:10 (v/v) with Milli Q water just before platelet preparation to obtain the 1X solution that needs to be supplemented with the following                  Conc. in 1X      For 1 ml 1X solution Glucose         5 mM      Add 5 μL (1:200 v/v) 1 M glucose
CaCl2 (0.5 M) (For 50ml)			Molecular weight of CaCl2.2H2O = 147.02 Dissolve 3.675 g of CaCl2.2H2O in 50 ml Milli Q water
CellEvent Caspase-3/7 Detection Reagents Green	Invitrogen	C10423	Apoptosis detection reagent
Convulxin	Enzo Life Sciences	ALX-350-100
EDTA (0.5 M; pH 8) (For 100 mL)			Molecular Weight of EDTA Na2.2H2 O: 372.24g Weigh 18.612 g and suspend in 50 ml Milli Q water and check the pH (pH~4) Slowly add 10N NaOH with stirring and monitor the pH. EDTA starts solubilizing at around pH 7 and is completely soluble at pH 8. Make up the volume to 100 ml with Milli Q water.
EGTA (100 mM; pH 7.4) (For 100 mL)			Molecular Weight: 380.4 Add 3.804 g EGTA in 50 ml Milli Q water and check the pH (pH~3) Add 10 N NaOH dropwise while stirring and monitor the pH EGTA becomes soluble at pH 7.0 (approx) Adjust pH to 7.4 Make up the volume to 100 ml with Milli Q water
FITC Mouse Anti-Human PAC-1	BD	340507
FITC-IETD-FMK Caspase 8 (active) staining kit	Abcam	ab65614
Mitotracker Red CMXRos (mitochindria labeling dye)	Invitrogen	M7512	Stock= 1 mM (50 µg dissolved in 90 µl DMSO) Sub-stock= 100 µM (10 µl Stock + 90 µl DMSO) Working concentration= 500nM (0.5 µl in 100 µl)
PE Annexin V	BD Pharmingen	560930
Prostaglandin E1	Sigma	P5515	Stock= 20 mM (1 mg dissolved in 141 µL DMSO) Sub-stock= 1 mM (10 µl Stock + 190 µL DMSO) Working concentration= 3 µM (3 µL in 1 mL)
Rhod-2 AM	Invitrogen	R1244	Stock= 5 mM (1 mg dissolved in 178 µL DMSO) Sub-stock= 100 µM (10 µL Stock + 90 µL DMSO) Working concentration= 500 nM (0.5 µL in 100 µL)
Thrombin from human plasma	Sigma	T7572